專利名稱：一種增加CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺調節性T細胞的抗原及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于免疫學領域，具體涉及一種增加⑶4+⑶25+FOXP3+調節性T細 胞(Tregs)的血吸蟲來源的抗原分子-日本血吸蟲熱休克蛋白60KDa (Schistosoma japonicum heatshock protein 60KDa, SjHSP60)及其應用。
背景技術：
上個世紀九十年代前后，西方發達國家提出來“衛生假說”，認為在衛生環境大大 改善的發達國家，一些過敏性疾病和自身免疫病的發病率大為增加，這是與發達國家衛生 條件改善，人群發生病原體感染的機會減少有關(Wills-Karp，et al, Nat Rev Immunol, 2001,1 69-75)。其后的若干年，科學家們通過一些過敏性疾病和自身免疫病的動物模型研 究證明，一些病原體的慢性感染確實可以預防這些免疫性疾病的發生或者減輕免疫病理損 傷(Dunne，Nat Rev Immunol, 2005, 5 420-426)如曼氏血吸蟲感染可以預防或減輕I型糖 尿病，實驗性腦炎，甲狀腺炎；絳蟲感染會減少實驗性結腸炎的發??；鏈球菌感染可以抑制 膠原誘導型關節炎的發生發展，等等。從進化史的角度看，慢性感染是病原體和宿主在長期 共同進化彼此選擇后，最終所形成的對雙方都有利的一種平衡狀態。在這種狀態下，病原體 不會被宿主完全清除，可長期存在于宿主；宿主既可維持對病原體有一定抵抗力，也不會因 為過強的免疫反應而產生免疫病理損傷，而且還預防了自身免疫病的發生。隨著免疫學的發展，在免疫系統中發現了一群天然存在的CD4+CD25+調節性T細 胞(Tregs) (Sakaguchi，et al.，J Immunol, 1995,155 :1151-64)，這群細胞主要由胸腺產 生，參與維持外周自身免疫耐受和免疫內環境穩定；后來進一步發現，一些病原體的感染 (病毒，細菌，寄生蟲)也可以在外周從⑶4+T細胞中誘導產生⑶4+⑶25+Tregs (Bluestone and Abbas, Nat Rev Immunol，2003，3 :253_7)。如丙型肝炎病毒(HCV)感染人體后，可以 誘導特異性的 CD4+CD25+Tregs (Bolacchi，et al.，Clin Exp Immunol, 2006,144 188-96)； 小鼠百日咳桿菌感染模型中研究發現，⑶4+⑶25+Tregs發生增多(McGuirk，et al.，J Exp Med, 2002,195 :221_31)；寄生蟲類感染中，曼氏血吸蟲感染后4周，發現腸系膜淋巴結中 ⑶4+⑶25+Tregs發生了擴增，然后聚集到肝臟和脾臟中發揮免疫抑制效應(Wilson et al,. unpublished observaton)。進一步探究導致慢性感染的病原體是如何誘導調節性T細 胞，從而抑制免疫攻擊，對于提高宿主抗感染力和治療免疫病意義都非常重大。寄生蟲中 的蠕蟲類，是一類具有復雜生物學功能的多細胞真核生物，能夠很好的逃避宿主免疫攻擊， 長期存在于宿主機體中(Maizels，et al.，J ExpMed，2009，206 :2059_66)。蠕蟲類中血 吸蟲感染是一種非常典型的慢性感染，在其感染模型中研究發現，其蟲卵抗原是刺激誘導 CD4+CD25+Tregs 產生的關鍵因素(Baumgart，et al.，JImmunol，2006，176 :5374_87)；此外， 本課題組也已發現，日本血吸蟲蟲卵抗原也可以刺激誘導⑶4+CD25+Tregs從而減輕哮喘所 導致的氣道炎癥反應(Yang, et al.，Immunology, 2006,120 :8_18)。關于特異性抗原在外周誘導免疫負調控的研究，在自身免疫研究領域已有一些報 道，有些自身抗原的自身反應性在逃避了胸腺中樞的陰性選擇后，它們還可以在外周誘導自身反應性調節性T細胞，從而參與免疫調控。這些自身抗原包括一些組織抗原(谷氨酸 脫羧酶GAD，少突膠質細胞蛋白M0G，肌球蛋白等)；免疫調控分子(泛素，白介素，肌動蛋白 等)；應激蛋白(HSP40, HSP60, HSP70) (Merb 1, et al.，J Clin Invest，2007，117 :712_8)。 實際上，免疫系統天然就存在這些抗原的抗體或反應性T細胞，或其特定的受體(配體)， 它們會時刻監視著機體免疫系統，維持免疫內環境穩定(Cohen，Nat Rev Immunol, 2007, 7 569-74)。早些年就有研究發現，人自身HSP60或其多肽可預防或減輕I型糖尿病(Elias and Cohen, Diabetes，1996，45 :1168_72)，且于兩年前已經開始應用于臨床III期實驗 (Eldor, et al.，DiabetesMetab Res Rev, 2009, 25 :316_20)；通過大鼠佐劑性關節炎模型 研究發現，鼠自身HSP60也可減輕關節炎癥病理反應(Durai，et al.，J Autoimmun, 2009, 33:208-13)。而且非常特別的是，HSP60屬于進化上最為保守的分子家族-熱休克蛋白家 族，在所有真核和原核生物中高度同源。因此，病原體很可能會利用這個分子去模擬宿主 HSP60的作用，誘導免疫調控，抑制宿主免疫攻擊，維持慢性感染。如果能夠鑒定和驗證出這 些病原體來源的“模擬分子”，不僅可以找到打破慢性感染的靶標，還可應用于預防或治療 免疫性疾病。對于過敏性疾病和自身免疫病的治療，臨床上很長時間以來一直在用一些直接抑 制免疫應答行為的化學藥物，如激素類，或者聯合應用硫唑嘌呤(抗胸腺球蛋白類藥物)， 環孢素 A 等(Bougneres, et al.，Diabetes, 1990,39 1264-72)。但是其中有些藥物不僅 價格比較貴，會讓患者產生難以忍受的副作用，而且一旦停止用藥，自身免疫反應會立即反 彈，疾病會卷土重來。而廉價的純化蛋白分子，不僅安全沒有毒副作用，更重要的是，它是通 過免疫學途徑去啟動其自身的調控機制，從根本上解決了問題；相比較于同類的短肽疫苗， 氨基酸序列較長而不易被降解，且具有多個表位，可以聯合發揮作用，更易被機體免疫系統 所識別；此外，蛋白分子的制備，一般都是通過生物表達系統(原核或真核表達系統)，而不 是生物合成，這有助于形成蛋白質的高級空間結構，能更有效地形成免疫學表位。已公開的日本血吸蟲熱休克蛋白60KDa(Schistosoma japonicum heat shock protein60KDa, SjHSP60)基因在 Genebank 中序列號為 AY813151?？傊?，利用慢性感染中病原體來源的抗原，尋找誘導調節性T細胞的特異分子，不 僅有利于鑒定出導致慢性感染主要因素，從而可以針對性地提高宿主抗感染力，而且在進 一步研究應用于治療過敏性疾病或自身免疫病方面具有更廣闊的前景。

發明內容
本發明旨在提供一種增加⑶4+⑶25+FoXp3+調節性T細胞的蛋白。本發明所說的增加⑶4+CD25+FOXp3+調節性T細胞的蛋白，是日本血吸蟲熱休克蛋 白60KDa(SjHSP60)，其全長氨基酸序列SEQ. ID. NO. 1所示，由572個氨基酸構成。本發明所說的增加⑶4+CD25+FOXP3+調節性T細胞的蛋白，還包括缺失了一段多肽 的SJHSP60,即SJHSP60 (D)，SJHSP60 (D)的序列如SEQ. ID. NO. 3所示，由548個氨基酸組成。本發明SEQ. ID. NO. 1所示的蛋白與Genebank中SjHSP60基因(序列號為 AY813151)的蛋白質序列并不完全相同(一致性為87%)。但是SEQ. ID. NO. 1分別 與其它種屬同源蛋白中曼氏血吸蟲HSP60 (SmHSP60, Genebank號AF310263)和人 類 HSP60 (HomoHSP60, Genebank 號:BC003030)的一致性更高，分別為 92 % 和 72 %，而AY813151的蛋白質序列與SmHSP60和HomoHSP60的一致性分別為81%和65%。這是單克 隆測序與大規模測序的差異所在，本發明是經過“Primer walking”測序拼接后翻譯出來的 序列，所以更精確。本發明所說的蛋白SjHSP60，主要通過以下兩個途徑增加⑶4+⑶25+FOXp3+TregS， 從而增強機體免疫抑制力1.上述所說蛋白誘導⑶4+⑶25T細胞轉化為⑶4+⑶25+Foxp3+Tregs ；2.上述所說蛋白直接使⑶4+⑶25+Tregs發生擴增；本發明公開了 SjHSP60和SjHSP60⑶作為增強CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞抑 制效應的免疫抑制劑的應用。本發明公開了 SjHSP60和SjHSP60(D)在制備治療免疫反應引起的炎癥性疾病藥 物中的應用。特別是在制備防治關節炎所致的炎性癥狀和免疫病理藥物中的應用。本發明所說的SjHSP60和SjHSP60 (D)蛋白使擴增后的CD4+CD25+TregS的免疫抑 制力增強。本發明所說的蛋白應用于實驗性炎癥動物模型中有抑制炎性癥狀和免疫病理反 應的作用，在治療免疫性疾病方面具有比較廣闊的應用前景。


圖ISjHSPeo序列同源性比對分析，天然表達分析。A SjHSP60的全長氨基酸序列，與宿主(人，小鼠)的HSP60進行序列比對；B SjHSP60在蟲體中的天然表達情況；表lSjHSP60與宿主(人，小鼠)自身HSP60的交叉性T細胞表位分析。圖 2SjHSP60 增加 CD4+CD25+Foxp3+Tregs。A用SjHSP60體內免疫小鼠，小鼠脾和淋巴結中CD4+CD25+Foxp3+Tregs比例顯著增 加；B用SjHSP60體內免疫小鼠，檢測小鼠脾和淋巴結中⑶4+CD25+Foxp3+Tregs比例的 流式細胞術檢測圖；C用SjHSP60體外處理小鼠脾和淋巴結細胞，⑶4+CD25+Foxp3+Tregs比例均發生增 加；D用SjHSP60體外處理小鼠脾和淋巴結細胞，檢測⑶4+CD25+Foxp3+Tregs比例的流 式細胞術檢測圖；圖3SjHSP60減輕CIA(膠原性關節炎)小鼠炎性癥狀和病理損傷。A SJHSP60體內免疫可減輕CIA小鼠關節炎性癥狀；B SJHSP60體內免疫可減輕CIA小鼠踝關節腫脹度；C SjHSP60體內免疫可減輕CIA小鼠關節周圍軟組織腫脹和骨關節損害；D SjHSP60體內免疫可減輕CIA小鼠關節及其周圍軟組織的炎癥病理反應；圖4SJHSP60增加CIA小鼠CD4+CD25+Foxp3+Tregs比例，抑制炎癥抗原 (CollagenII, CII)的特異性體液和細胞免疫應答。A SJHSP60體內免疫CIA小鼠，小鼠脾和淋巴結中CD4+CD25+Foxp3+Tregs比例顯著 增加；
B SjHSP60體內免疫CIA小鼠，檢測小鼠脾和淋巴結中CD4+CD25+Foxp3+Tregs比例 的流式細胞術檢測圖；C SjHSP60體內免疫后，CIA小鼠體內針對炎癥抗原C II的特異性體液免疫應答 水平明顯降低；D SjHSP60體內免疫后，CIA小鼠體內針對炎癥抗原CII的特異性細胞免疫應答水 平明顯降低圖 5HSP60 增力卩 CD4+CD25+Foxp3+Tregs 可通過誘導 CD4+CD251 轉化為 CD4+CD25+Foxp3+Tregs。A 用 SjHSP60 處理小鼠 CD4+T，CD4+CD25T 細胞，SjHSP60 誘導 CD4+CD25T 轉化為 CD4+CD25+Foxp3+Tregs ；B 用 SjHSP60 處理小鼠 CD4+T，CD4+CD25T 細胞，SjHSP60 誘導 CD4+CD25T 轉化為 ⑶4+CD25+Foxp3+Tregs的流式細胞術檢測圖； 圖 6S jHSP60 增加 CD4+CD25+Foxp3+Tregs 可通過直接擴增 CD4+CD25+Tregs，且擴增 后的⑶4+⑶25+Tregs免疫抑制力更強。A SjHSP60 直接擴增 CD4+CD25+Tregs ；B擴增后的⑶4+CD25+TregS具有更強的免疫抑制力；圖 7 :SjHSP60(D)仍可顯著增加 CD4+CD25+Foxp3+Tregs 比例。A SjHSP60的蛋白質空間結構和表面功能殘基(蛋白質-蛋白質作用位點)的預 測和分析；B通過兩次PCR得到了接頭部分重疊且缺失了 SJMHEl的兩個PCR產物；C通過第三次PCR得到了缺失SJMHEl的SjHSP60 (D)；D用SjHSP60⑶體內免疫小鼠，小鼠脾和淋巴結中⑶4+⑶25+Foxp3+Tregs比例顯 著增加；E用SjHSP60(D)體內免疫小鼠，檢測小鼠脾和淋巴結中CD4+CD25+Foxp3+Tregs比 例的流式細胞術檢測圖；F用SjHSP60(D)體外處理小鼠脾和淋巴結細胞，CD4+CD25+Foxp3+Tregs比例顯著 增加；G用SjHSP60 (D)體外處理小鼠脾和淋巴結細胞，檢測CD4+CD25+Foxp3+Tregs比例 的流式細胞術檢測圖；圖8 去除SjHSP60全長序列中一段多肽(第435到第458個氨基酸，SJMHE1)的 引物設計法和三步PCR示意圖。
具體實施例方式在本發明中所使用的術語，除非有另外說明，一般具有本領域普通技術人員通常 理解的含義。下面結合具體的制備實施例和應用實施例，并參照數據進一步詳細地描述本發 明。應理解為這些實施例只是為了舉例說明本發明，而非以任何方式限制本發明的范圍。在以下的實施例中，未詳細描述的各種過程和方法是本領域中公知的常規方法。 所用試劑的來源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現時標明，其后所用相
6同試劑如無特殊說明，均與首次標明的內容相同。本發明實施例中所提及的表達載體pGEX-6p_l可從GE Healthcare公司購買(貨 號28-9546-48)。日本血吸蟲總cDNA的獲取日本血吸蟲感染性釘螺(陽性釘螺)購自江蘇省血吸 蟲病防治研究所。感染性釘螺可以釋放出具有感染性的尾蚴(日本血吸蟲發育階段之一， 此階段具有感染性)從而用來攻擊感染實驗性小鼠。然后尾蚴在小鼠體內可以繼續發育為 童蟲，最終發育為日本血吸蟲成蟲，寄居在小鼠的門靜脈系統。剖殺小鼠后，可以通過灌注 小鼠門靜脈系統取出成蟲，從而可以用來抽提日本血吸蟲總RNA，最后再逆轉錄成日本血吸 蟲總cDNA。實施例一 SjHSP60同源性的序列比對分析，交叉性表位分析，及其天然表達的檢 測。1、根據Genebank中SjHSP60基因(序列號為:AY813151)全長cDNA序列，先行 設計引物上游引物為5，-cgcggatcccaaccggtgacaatgttacgag-3，(含BamHI酶切位點及 起始密碼字 ATG),下游引物為 5，-ccgctcgagattaagagcaggcagtgtttac-3，(含 XholI 酶 切位點及終止密碼子TAA)，由上海英濰捷基貿易有限公司(Invitrogen)合成；通過PCR 方法從日本血吸蟲總cDNA中擴增SjHSP600RF全長序列，送生物技術公司(上海英濰捷基 貿易有限公司，Invitrogen)測序，并回收PCR產物；測序結果如SEQ. ID. NO. 2所示，再通 過在線生物學工具Biology WorkBenchftittp://workbench, sdsc. edu/)將其翻譯成氨基 酸序列；并與人和小鼠的HSP60 (Genebank中基因序列號分別為人HSP60-BC003030，小鼠 HSP60-NM010477)進行序列比對。SJHSP60開放閱讀框ORF的全長序列，如SEQ. ID. NO. 2所示，共1719bp。SJHSP60開放閱讀框ORF的全長序列翻譯后的氨基酸序列為如SEQ. ID. NO. 1所示， 共572個氨基酸。2、綜合應用在線表位預測軟件IEDB(http://tools, immune印itope. org/main/ index, html)，SYFPEITHI(http://www. syfpeithi. de/home. htm)分析 SjHSP60 分別與人 HSP60,小鼠HSP60的交叉性T細胞表位。3、用 BamHI (NEB, #R3136V)和 XholI (NEB, #R0146V)將質粒 pGEX_6P_l 和此上(1) 中回收的PCR產物進行雙酶切；酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳進行分離鑒定后，再分別割膠 回收質粒和PCR片斷的雙酶切產物；通過T4DNA連接酶(NEB，#M0202S)進行載體和PCR產 物的連接，構建重組表達載體pGEX-SjHSP60 ；轉化Ε. coli BL21感受態細胞，37°C培養過 夜后，挑取單克隆菌落，接種于含Amp的LB培養液中，37°C振搖培養過夜后，抽提質粒后行 雙酶切鑒定，進一步送測序公司鑒定。鑒定成功后，將菌液進行1 100擴大培養，至OD 值達0. 6-0.8時，加入IPTG使其終濃度為0. 05mmol/L，37°C誘導表達5h ；收集菌液，4°C 高速離心20min，用IXPBS重懸細菌沉淀；通過超聲破碎儀和反復凍融法裂菌；再次4°C 高速離心20min，分別取上清和沉淀，以及未裂解的總蛋白進行SDS-PAGE電泳分析蛋白的 表達量及分布情況；鑒定為可溶性表達后，通過融合蛋白GST親和層析法，用Glutathione Sepharose 4B(GE Healthcare, 17-0751-01)進行融合蛋白 GST_SjHSP60 的純化；并用蛋白 酶PreScission Protease(GE Healthcare, 270843)對融合蛋白進行酶切，最后得到純化的 SJHSP60 ；經過SDS-PAGE電泳分析純化結果，純度> 95%。純化的SjHSP60交由上海中科院英沐生物科技有限公司制備抗SjHSP60的單克隆抗體(mti-SjHSP60mAb)。制備可溶性 的成蟲(SWA)和蟲卵抗原(SEA)，通過Weatern Blot實驗檢測mti_SjHSP60mAb的特異性 和抗體效價；驗證成功后，再用mti-SjHSP60mAb，通過免疫組織化學方法，檢測日本血吸 蟲成蟲(雌蟲和雄蟲)和蟲卵中SjHSP60的天然表達和分布情況。結果如圖1和表1所示，SjHSP60與人、小鼠HSP60序列上具有高度的同源性，序 列的一致性分別達到72%和70% ；通過T細胞表位預測后，發現SjHSP60，與人HSP60，與小 鼠HSP60，均具有一系列相同或高度相似的MHCI和MHCII類交叉性T細胞表位。表 1 實施例二 SjHSP60體內免疫小鼠或體外剌激小鼠淋巴細胞，觀察SjHSP60對 CD4+CD25+Foxp3+Tregs 的影響。1.將實施例一(3)中純化的 SjHSP60，濾菌并通過 Polymyxin B-Agarose (Sigma， P1411)去除其中的類毒素及其相關分子，然后再通過Limulus amebocyte Iysate(LAL)檢 測試劑盒E-TOXATE Kits (Sigma, ET0200)，驗證純化蛋白的內毒素去除效果，< 0. 001FU/ ml(0. lpg/ml)，最后用 DC Protein Assay (BIA-RAD，500-0111)進行蛋白定量。將 SjHSP60 與不完全弗氏佐劑IFA (Sigma，F5501)等體積混合，使SjHSP60濃度為250ug/ml，反復渦懸 振蕩混勻。對BALB/c小鼠(SPF級，6-8周齡，雌性，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公 司)進行腹股溝皮下免疫，劑量為25ug/100ul/只，首次免疫后，隔兩周再同樣免疫一次， 設PBS免疫組為對照組。整個過程小鼠飼養于SPF級動物房(南京醫科大學實驗動物中 心)。末次免疫結束后一周，剖殺小鼠，分離各組小鼠的脾和淋巴結，研磨過濾后，制備成單 細胞懸液；再經紅細胞裂解液去除紅細胞，制備成單淋巴細胞懸液；進行細胞計數后，對各 組每只小鼠取 IXlO6 個細胞，按 MouseRegulatory T Cell Staining Kit (eBioscience， 88-8111-40)操作說明書進行淋巴細胞的染色標記，再經流式細胞儀FACSCalibur檢測 CD4+CD25+Foxp3+Tregs 比例。2.分離正常BALB/c小鼠的脾和淋巴結，按此上(1)中方法，制備成單淋巴細胞懸液；細胞計數后，分別轉移至96孔圓底培養板，5X IO5個細胞/孔；再分三組進行刺激，分 別是 SJHSP60 組(0. lug/ml) /PBS 組 / 無刺激(Medium)組，每組設 4 孔；在 37°C，5% CO2 細 胞孵箱培養3天后，收集各組細胞并進行計數，每組取IX IO6個細胞，同此上(1)中方法檢 測 CD4+CD25+Foxp3+Tregs 比例。結果如圖2所示，體內外實驗均證明，SJHSP60可以增加⑶4+CD25+Foxp3+Tregs比 例。實施例三探究SjHSP60能否在炎癥模型中發揮抑制炎癥及免疫病理反應的作用。1.按實施例二(1)中方法，分兩組SjHSP60組/PBS組，體內免疫DBAl小 鼠(南京大學國家遺傳工程小鼠資源庫，6-8周齡，雌性)。建立膠原誘導型關節炎 (CIA)小鼠模型混合牛源 II 型膠原(CII)Bovine Collagen Type II (BD, 354257)和 Mycobacteriumtuberculosis H37RA(Difco, 3114),用 IXPBS 稀釋，使兩者濃度分別為 2mg/ml,3mg/ml ；在混合體系中再加入等體積的不完全弗氏佐劑CFA，渦懸振蕩儀上混勻 2min,反復6-8次，每隔30min —次；于首次免疫SjHSP60/PBS后一周，在兩組小鼠尾部皮 下免疫混合抗原誘導CIA，IOOul/只。誘導后一周，對兩組小鼠再分別免疫SjHSP60/PBS — 次。誘導后4周，開始動態觀察兩組小鼠關節炎癥表現，隔天一次；按如下標準進行炎性癥 狀嚴重程度評分O分正常，無癥狀；1分紅斑，只有踝關節輕微腫脹；2分紅斑，從踝關節到跖骨、掌指關節輕微腫脹；3分紅斑，從踝關節到掌指關節中度腫脹；4分紅斑，從踝關節到指尖嚴重腫脹；每側肢體最高分為4分，最低分為0分；每只小鼠總得分最高為16分，最低為0分。2.與此上(1)中觀察時間點同步，使用電子數顯游標卡尺(購自溫州三和量具儀 器有限公司)測量各組小鼠左后肢踝關節直徑。3.誘導后7周剖殺各組小鼠，取各組小鼠前爪固定于含10%福爾馬林的IXPBS 中，送標本至上海瑞金醫院傷骨科研究所進行X光檢測。4. X光檢測后，將標本繼續固定于含10%福爾馬林的IXPBS中，交由江蘇省人民 醫院病理科進行標本脫鈣、石蠟包埋、切片及病理HE染色；顯微鏡下觀察HE病理結果。結果如圖3所示，SjHSP60免疫組的CIA小鼠，其關節的炎性癥狀，關節腫脹度，關 節損害程度以及病理炎癥反應都顯著減輕。實驗例四觀察SjHSP60能否增加CIA小鼠⑶4+⑶25+FOXp3+TregS，從而發揮免疫 抑制作用。1.分離CIA誘導后3W和7W各組(HSP60組/PBS組)小鼠脾和淋巴結，按實施例 二(1)中方法，檢測各組小鼠⑶4+⑶25+Foxp3+Tregs比例。2.在剖殺此上(1)中各組小鼠前，對各組小鼠采血，并分離出血清；再經ELISA 檢測各組血清中CII特異性抗體(IgG，IgG2a, IgGl)，具體操作是用高親和力酶標板預 包被CII，5ug/ml，4°C包被過夜；棄去包被液，PBS-T洗板2_3遍；5%脫脂牛奶進行封閉， 200ul/孔，37 °C孵育2小時；棄去封閉液，PBS-T洗板2_3遍；1 20稀釋各組血清后，加入酶標板，IOOul/孔，4°C孵育過夜；棄去血清，PBS-T洗板3-4遍；加入稀釋后的二抗HRP anti-mouse IgG (Boster，BA1050) 1 10000 稀釋，HRP anti-mouse IgG2a (BD, 553391) 和 HRP anti-mouse IgGl (BD，559626)均 1 1000 稀釋，IOOul/孔，37 °C 孵育 1 小時；棄 去二抗，PBS-T洗板4-5遍；加入TMB顯色液(eBioscience，00-4201-56)，室溫避光放置 10-15min后，加入2N H2SO4終止反應，IOOul/孔；最后在酶標儀上進行讀值。3.取此上(1)中分離后得到的各組每只小鼠的淋巴細胞，分別轉移至96孔圓底 細胞培養板，4 X IO5個/孔，每只小鼠設9個孔，再各分為三組處理=Medium組(不刺激)/ ConA刺激組(2ug/ml)/CII刺激組(5ug/ml)，3孔/組；按實施例四(5)中方法，通過3H摻入 法檢測各組淋巴細胞增殖情況培養至56小時，加入氚胸腺嘧啶(3H-thymidine,3H-TDR)， 0. 5 μ Ci/孔；繼續培養16小時(總計培養3天)后，經Beckman液體閃爍計數儀檢測細胞 的3H-TDR摻入情況，從而反映出CII特異性的細胞免疫應答水平。結果如圖4所示，SjHSP60使CIA模型小鼠體內CD4+CD25+Foxp3+Tregs比例顯著增 加；進一步的實驗也證明，針對C II特異性的體液和細胞免疫應答都有明顯的抑制。實施例五SjHSP60體外分別刺激小鼠CD4+T細胞，⑶4+⑶25—T細胞，進一步觀察 SjHSP60 如何增加 CD4+CD25+Foxp3+Tregs。分離正常BALB/c小鼠脾和淋巴結，制備成單淋巴細胞懸液；用試劑盒⑶4+T celllsolation Kit (MACS, 130-090-860)分選出 CD4+T 細胞；剩余的 CD4-淋巴細胞經 50ug/ ml絲裂霉素，37°C，5% CO2處理30min后，作為抗原遞呈細胞(APC)使用。再取部分⑶4+T 細胞，進一步再用 CD4+CD25+Regulatory T Cell Isolation Kit (MACS, 130-091-041)去除 ⑶4+CD25+TregS，從而分離出⑶4+⑶25—T細胞。具體分選步驟均參照產品說明書。通過流 式細胞術檢測⑶4+Τ細胞和⑶4+⑶25—Τ細胞純度，純度分別> 90%和> 95%。將兩種細胞 分別轉移96孔圓底培養板，2 X IO5個細胞/孔，再加入APC, 2 X IO5個/孔；CD4+T細胞和 CD4+CD25—T細胞再各自分兩組處理，刺激組(SjHSP60，0. lug/ml)/不處理組(Medium)；在 37°C,5% CO2細胞孵箱培養3天后，收集各組細胞并計數；每組取1 X IO6個細胞，流式細胞 術檢測⑶4+⑶25+FOXp3+TregS比例。此實例中相關具體方法可參考實施例二(1)。結果如圖5 所示，SjHSP60 增加 CD4+CD25+Foxp3+Tregs 可通過誘導 CD4+CD25T 細 胞轉化而來。 實施例六觀察SJHSP60增加CD4+CD25+Foxp3+Tregs是否可通過直接擴增 CD4+CD25+Tregs，擴增后的CD4+CD25+Tregs免疫抑制力如何。1.按實施例二(2)中方法分離正常BALB/c小鼠的脾和淋巴結，制備成單淋 巴細胞懸液；用CD4+CD25+Regulatory T Cell Isolation Kit按照說明書步驟分選出 ⑶4+CD25+TregS。參照實施例五中方法，流式細胞術檢測⑶4+⑶25+Tregs的細胞純度，純度 >95%。轉移⑶4+CD25+TregS至96孔圓底細胞培養板，2乂105個細胞/孔；再分三組處 理anti-CD3(BD，553057)刺激組(lug/ml)/SjHSP60 刺激組(0. 5ug/ml)/SjHSP60 (0. 5ug/ ml)+anti-ra3(lug/ml)刺激組，均為5孔/組。按實施例四(3)中方法，通過3H摻入法檢 測各組⑶4+⑶25+Tregs的增殖情況。2.按此上(1)中具體方法分選并刺激處理⑶4+CD25+Tregs，培養3天后，收集并計 數；轉移至96孔圓底細胞培養板，1 X IO5個/孔，4孔/組。再按實施例五中方法分選正常 BALB/C小鼠⑶€細胞(作為APC使用)和⑶4+CD25T細胞，分別加入每孔⑶4+⑶25+Tregs，IXlO5個/孔。共培養3天后，同樣按實施例四(3)中方法，通過3H摻入法檢測各組 ⑶4+CD25-T細胞的增殖情況，進而反映各組⑶4+CD25+TregS的抑制力。結果如圖6所示，SJHSP60還可通過直接擴增CD4+CD25+Tregs，增加 ⑶4+CD25+Foxp3+Tregs ；且擴增后的⑶4+⑶25+Tregs具有更強的免疫抑制力。實施例七去除SjHSP60全長序列中第435到第458氨基酸的多肽(SJMHEl)后， 得到SjHSP60(D)，觀察SjHSP60(D)是否還能增加小鼠CD4+CD25+Foxp3+Tregs比例。1.應用在線蛋白質結構和功能預測軟件Phyre server (http//www. sbg. bio. ic. ac. uk/phyre/)，預測SjHSP60蛋白分子的空間結構以及表面功能殘基(蛋白_蛋白作 用位點)O2.按附圖中圖8所示設計引物Pl (5，_3，) cgcggatcccaaccggtgacaatgttacgagP2(5， _3， ) :cacacctgttcgctgtatgccttcctcaattgctP3(5， _3， ) :attgaggaaggcatacagcgaacaggtgtgcgP4(5， _3， ) ccgctcgagattaagagcaggcagtgttta以實施例一(3)中構建的重組表達載體pGEX_SjHSP60為模板以P1/P2為上下游 引物進行PCR I ；以P3/P4為上下游引物進行PCRII ；兩次PCR后，得到了缺失SJMHEl且有 部分重疊的兩個PCR產物。3.等摩爾混合此上⑵中PCR I和PCRII產物(質量比大約為3. 5 1)，以此為 模板，以P1/P4為上下游引物，進行PCRIII，得到了缺失SJMHEl的SjHSP60(D)，共1816bp。 其全長cDNA序列和經過翻譯出來的氨基酸序列分別為SEQ. ID. NO. 4和SEQ. ID. NO. 3所示。4.回收此上(3)中PCR III產物；按實施例一(3)中方法，用回收的PCR III 產物和PGEX-6P-1構建重組表達載體pGEX-SjHSP60(D)；誘導表達和純化SjHSP60 (D)； 再進行內毒素的去除和定量驗證，最后進行蛋白定量。按實施例二(1)中具體方法，用 S JHSP60 (D)以及多肽SJMHE1(由上海生工公司合成，純度> 99%，序列如SEQ. ID. NO. 5 所示)體內免疫正常BALB/c小鼠，設PBS免疫組為對照組，檢測各組小鼠脾和淋巴結中 CD4+CD25+Foxp3+Tregs 比例。5.按實施例二⑵中方法，用SjHSP60⑶/多肽SJMHE1/PBS體外刺激正常BALB/ c小鼠的脾和淋巴結細胞，檢測各組小鼠脾和淋巴結中⑶4+⑶25+FOXp3+TregS比例。結果如圖7所示，經過軟件預測發現，SjHSP60的三維空間結構表面，除了 SJMHE1， 還存在其它一些功能性殘基(蛋白_蛋白作用位點)；進一步體內外實驗證明，缺失SJMHEl 的SJHSP60 (D)仍可增加小鼠脾和淋巴結中CD4+CD25+Foxp3+Tregs比例。結合圖2分 析，可以發現與SJMHEl相比較，SJHSP60和SJHSP60 (D)體內免疫小鼠(in vivo)增加 CD4+CD25+Foxp3+Tregs比例的能力更強一些；而體外刺激淋巴細胞(in vitro), SJMHE1, SJHSP60和SjHSP60(D)三者增加CD4+CD25+Foxp3+Tregs比例的能力無明顯差異。本發明不限于這些公開的實例方案，本發明將覆蓋在專利書中所描述的范圍，以 及權利要求范圍的各種變型和等效變化。
權利要求
一種增加CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞的抗原，是日本血吸蟲熱休克蛋白60KDa，它的全長氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。
2.權利要求1所說的增加⑶4+⑶25+FoXp3+調節性T細胞的抗原作為增強 ⑶4+CD25+FOXp3+調節性T細胞抑制效應的免疫抑制劑的應用。
3.權利要求1所說的增加CD4+CD25+FOXp3+調節性T細胞的抗原在制備治療免疫反應 引起的炎癥性疾病藥物中的應用。
4.權利要求1中所說的增加CD4+CD25+FOXp3+調節性T細胞的抗原在制備防治關節炎 所致的炎性癥狀和免疫病理藥物中的應用。
5.一種增加⑶4+CD25+FOXp3+調節性T細胞的抗原，是缺失了第435至第458個氨基酸 的日本血吸蟲熱休克蛋白60KDa，它的氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 3所示。
6.權利要求5所說的增加⑶4+⑶25+FoXp3+調節性T細胞的抗原作為增強 ⑶4+CD25+FOXp3+調節性T細胞抑制效應的免疫抑制劑的應用。
7.權利要求5所說的增加CD4+CD25+FOXp3+調節性T細胞的抗原在制備治療免疫反應 引起的炎癥性疾病藥物中的應用。
8.權利要求5中所說的增加CD4+CD25+FOXp3+調節性T細胞的抗原在制備防治關節炎 所致的炎性癥狀和免疫病理藥物中的應用。
全文摘要
本發明屬于免疫學領域，具體涉及一種可以增加CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞的血吸蟲來源的蛋白抗原分子-日本血吸蟲熱休克蛋白60KDa(SjHSP60)及其應用。SjHSP60全長氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，與感染宿主的HSP60具有一系列相同或高度相似的交叉性T細胞表位。用SjHSP60體內免疫小鼠或體外刺激小鼠脾、淋巴結細胞，均可顯著增加CD4+CD25+Foxp3+Tregs。在實際應用上，SjHSP60可有效地減輕關節炎所致的炎性癥狀和免疫病理反應，因此在誘導免疫抑制，應用于治療免疫性疾病方面具有廣闊的前景。
文檔編號A61P37/06GK101921325SQ20101013314
公開日2010年12月22日 申請日期2010年3月25日 優先權日2010年3月25日
發明者劉豐, 周莎, 汪雪峰, 蘇川, 賀蕾 申請人:南京醫科大學