專利名稱：：一種精氨酸脫亞氨酶突變體及其制備與應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及生物
技術領域：
，具體涉及一種精氨酸脫亞氨酶突變體及其制備與應用。
背景技術：
：正常細胞的生長不需要精氨酸，因為它們能通過由精氨琥珀酸合成酶(argininosuccinatesynthetase,ASS)禾口精氨玻拍酸裂角軍酶(argininosuccinatelyase,AL)催化的一個兩步反應從胍氨酸合成精氨酸L-arginine+H2O^L-citrulline+NH3。然而月干細胞瘤(hepatocellularcarcinomas,HCC)、黑色素瘤(melanomas)和其他一些的肉瘤不表達精氨琥珀酸合成酶，因而它們是精氨酸的營養缺陷型，只能在含有精氨酸的環境中生長；在降解精氨酸的酶類存在條件下，精氨酸被清除使得這類腫瘤細胞進入“饑餓”狀態，進而其生長被抑制。因此，精氨酸降解酶可以作為肝癌、黑色素瘤等疾病的潛在臨床藥物。精氨酸脫亞氨酶(argininedeiminase，ADI)能催化精氨酸向胍氨酸的轉化，可被用來清除精氨酸。從惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)中提取的精氨酸脫亞胺酶(pADI)，在體外可以有效殺死腫瘤細胞(JonesJB，Theeffectofargininedeiminaseonmurineleukemialymphoblasts(Ph.D.dissertation),OklahomaCity,OK,UniversityofOklahoma，1981)，特別是肝癌和黑色素瘤相關的腫瘤細胞，但是從惡臭假單胞菌中提取的pADI在體內卻沒能表現出其應有的作用，研究發現是因為pADI在中性pH下幾乎沒有酶活性，并且因為惡臭假單胞菌中提取的PADI對實驗動物來說具有很強的免疫原性，進入機體后以后很容易誘導生成抗體，形成抗原-抗體免疫復合物從實驗動物的血液循環中被快速清除。Takaku等(HaruoTakakuetal.，Invivoanti-tumoractivityofargininedeiminasepurifiedfromMycoplasmaarginini,IntJCancer.,51:244_249，1992)從支原體(Mycoplasmaarginini)中分離出另一種精氨酸脫亞胺酶(aADI)。與惡臭假單胞菌來源的pADI不同，aADI在pH6.0-7.5表現出最高活性，并且在中性pH下非常穩定。但是，與pADI—樣，來源于低等微生物的精氨酸脫亞胺酶由于具有很強的抗原性，易于被人體通過循環系統迅速清除。蛋白質經化學修飾(如PEG修飾、明膠、多糖修飾等)后，可以有效地屏蔽蛋白質表面的抗原表位，降低或消除蛋白質本身固有的免疫原性，且修飾后的蛋白質分子量增大，可延長體內的清除速率，提高其半衰期，因而蛋白質修飾是解決免疫原性的優選方法。聚乙二醇PEG(Polyethyleneglycol)已被確認為一種安全的蛋白質化學修飾試劑，一些用PEG修飾的藥物已在臨床上使用。但是，對于用PEG修飾的蛋白，包括精氨酸脫亞胺酶，L-天冬酰胺酶等都會導致酶活性的下降，甚至完全喪失(MehvarR，Modulationofthepharmacokineticsandpharmacodynamicsofproteinsbypolyethyleneglycolconjugation,J.PharmPharmaceutSci.,3:125-136,2000)。HoltsbergFW等(HoltsbergFffetal.,Poly(ethyleneglycol)(PEG)conjugatedargininedeiminase:effectsofPEGformulationsonitspharmacologicalproperties，JControlRelease.80259-271,2002)在研究聚乙二醇修飾精氨酸脫亞氨酶時發現，當一個精氨酸脫亞氨酶結合8-10個PEG2cicicici分子時，其酶活性僅保留了不到50%，進一步修飾，當結合的PEG分子超過20個時，其活性基本完全喪失，因此，對于該類蛋白質，需在活性保留和蛋白質PEG修飾率之間進行優選和平衡，才能達到藥物的臨床要求。
發明內容本發明的目的是克服現有技術中存在的問題，提供一種Mycoplasmaarginini來源的部分賴氨酸突變的精氨酸脫亞氨酶突變體及其制備與應用。常規的PEG修飾不但導致被修飾蛋白活性的下降，而且由于不能控制修飾的位點，導致產物都是不均一的混合物。WangYS等(WangYSetal.，Structuralandbiologicalcharacterizationofpegylatedrecombinantinterferonalpha~2banditstherapeuticimplications,AdvDrugDelivRev.,54547-570,2002)a2a(IFNa2a)的PEG修飾時發現，當用12KDsuccinimidylcarbonatePEG(SC-PEG)修飾時，IFNα2a分子中包括N端氨基，Lys,His等共有14個基團可能被修飾，對于單修飾的PEG-IFNa2a，最終分析證明修飾制備所得的PEG-IFNa2a是由14種不同位點結合有一個PEG分子組成的混合物，而且這14種PEG-IFNα2a的活性是不一致的，其相對生物學活性最高保留了37%，最低僅保留了6%。因而，一個可能實施的方案，是通過基因突變，盡量減少精氨酸脫亞胺酶上賴氨酸殘基的數目，減少PEG修飾后活性大量損失的可能性以及不均一帶來的產物批次間的差異。本發明的第一個方面是提供一種精氨酸脫亞胺酶突變體，具有降解精氨酸為胍氨酸的酶活性，其氨基酸序列與氨基酸序列為SEQIDNO:1的精氨酸脫亞胺酶相比，含有K9N,K59Q,K66R,K93E,K111R,K119Q,K121Q,K122E,K126E,K178I,K196I和K209G,K243E,K249D，K279Y突變中的一種或多種的組合。例如，對于K9N突變，可以是精氨酸脫亞胺酶含有單獨的K9N突變，也可以是含有K59Q,K66R,K93E,K111R,K119Q,K121Q,K122E,K126E,K178I,K196I和K209G，K243E,K249D,K279Y突變中的一種或多種與K9N突變的組合。更佳的，所述精氨酸脫亞胺酶突變體的氨基酸序列含有K9N，K59Q，K66R，K93E，K111R,K119Q,K121Q,K122E,K126E,K178I,K196I,K209G,K243E,K249D,K279Y突變。優選的，所述精氨酸脫亞胺酶突變體具有SEQIDNO:2或SEQIDNO:3所示的氨基酸序列。本發明實施例具體列舉了同時含有K9N，K59Q,K66R,K93E,K111R,K119Q,K121Q,K122E,K126E,K178I，K196I和K209G，K243E,K249D,K279Y突變及各點單突變的突變體，鑒于同時發生這15個賴氨酸突變的突變體仍能保持降解精氨酸的活性，本
技術領域：
的技術人員可知，這些突變對精氨酸脫亞胺酶的降解精氨酸活性基本沒有影響，因此即使只發生了這15個賴氨酸中的一種或多種的突變，獲得的突變體也仍然能保持降解精氨酸的酶活性。進一步的，上述精氨酸脫亞胺酶突變體經一種低免疫原性或無免疫原性的聚合物修飾，從而獲得一種低/無免疫原性的聚合物-精氨酸脫亞胺酶突變體。所述無免疫原性的聚合物可以是天然來源的，如明膠，葡聚糖，也可以是人工合成的，如聚乙二醇。在本發明的實施例中，聚乙二醇的分子量為從約5000到40，000。優選地，從約20，00到40，000，最優選地為20，000。上述這些聚合物能夠通過連接基團與精氨酸脫亞胺酶突變體序列中的Lys的ε-氨基和N端的α-氨基結合。連接基團可以是任何生物相容性基團，包括但不限于EDC、戊二醛、酯基、醛基、酰胺基、氨基甲酸酯基、順丁烯二酰亞胺基團等。在本發明的實施例中，生物相容性基團是羥琥珀酰亞胺或醛基。采用本發明的方法，上述聚合物可以通過連接基團與精氨酸脫亞胺酶突變體序列中的所有Lys的ε-氨基和N端的α-氨基結合，具有SEQIDNO:2序列的精氨酸脫亞胺酶突變體經線性PEG2cicicici修飾后(結合了約11個PEG2cicicici分子)，其酶活性約為17U/mg，活性保留率為55%，遠高于同樣條件下未突變精氨酸脫亞胺酶被同樣條件修飾后的活性，具體見實施例5。本發明第二方面，公開了一種多核苷酸，所述的多核苷酸編碼所述精氨酸脫亞胺酶突變體。進一步的，所述多核苷酸具有SEQIDNO5的核苷酸序列。本發明第三方面，公開了含有前述的多核苷酸的序列的表達載體。本領域的技術人員熟知的方法能用于構建含精氨酸脫亞胺酶突變體的編碼序列和合適的轉錄/翻譯控制信號的重組表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組技術等。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mRNA合成。重組表達載體可以是本領域熟知的細菌質粒、噬菌體、酵母質粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒如腺病毒、逆轉錄病毒或其他載體。此外，表達載體優選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用于選擇轉化的宿主細胞的表型性狀。本發明實施例具體列舉了以pET39b作為載體。本發明第四方面，公開了一種重組的宿主細胞，所述宿主細胞含有前述表達載體、或者染色體中整合有前述多核苷酸。宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；真菌細胞如酵母；CHO等。用重組表達載體轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態細胞可在指數生長期后收獲，用如CaCl2等法處理，所用的步驟在本領域眾所周知。如果需要，轉化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方法磷酸鈣共沉淀法，常規機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等。本發明實施例具體列舉了以大腸桿菌BL21DE3作為宿主細胞。本發明第五方面，公開了一種制備所述精氨酸脫亞胺酶突變體的方法，該方法包括(1)用含有編碼精氨酸脫亞胺酶突變體的多核苷酸的重組表達載體轉化或轉導合適的宿主細胞；(2)在合適的培養基中培養宿主細胞；(3)從培養基或細胞中分離、純化蛋白質。宿主細胞可以用常規方法培養表達本發明的精氨酸脫亞胺酶突變體。根據所用的宿主細胞，培養中所用的培養基可選自各種常規培養基。在適于宿主細胞生長的條件下進行培養。當宿主細胞生長到適當的細胞密度后，用合適的方法誘導選擇的啟動子，將細胞再培養一段時間。在上面的方法中的重組多肽可在細胞內、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞夕卜。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規的復性處理、用蛋白沉淀劑處理、離心、滲透破菌、分子篩層析、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析和其它各種液相層析技術及這些方法的結合。在本發明的第六個方面，公開了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發明的精氨酸脫亞胺酶突變體(修飾或未修飾聚合物)以及藥學上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)緩沖液、氨基酸、糖類、注射用水及其組合。藥物制劑應與給藥方式相匹配。本發明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規方法進行制備。此外，本發明的聚合物-raADI還可與其他治療劑一起使用。本發明第七個方面提供了上述精氨酸脫亞胺酶突變體(修飾或未修飾聚合物)在制備治療病毒感染、腫瘤以及阿爾茨海莫氏病的藥物中的應用。本發明的化合物的治療有效量是能有效地抑制腫瘤生長的量。通常，治療以小劑量開始，然后逐漸增加劑量直至達到完全分解機體內的精氨酸。通常，本發明的化合物的治療劑量可以是從約5到30U/kg，每2天一次到大約每兩周一次。已有報道表明ADI通過降解精氨酸而體現出抗病毒的效果(ClarkMikeA.,UnitedStatesPatent7204980:Methodsforinhibitingviralreplicationinvivo)以及P可爾茨海莫氏病的治療(LouwCetal.,ArgininedeiminasesTherapeutictoolsintheetiologyandpathogenesisofAlzheimer'sdisease,JEnzymeInhibMedChem.,22121-126,2007)，而本發明所制備的raADI-Lys-和PEG-raADI-Lys-具有相同的效果，而且具有更好的安全性，因此同樣的，本發明所制備的raADI-Lys-和PEG-raADI-Lys-也可以用于這些領域。本發明的突變體與天然精氨酸脫亞氨酶相比，不但在復性后有很高的體外活性，更重要的是在PEG修飾后仍有很高的活性保留率，且產物均一度更高。圖1表示天然支原體(mycoplasmarginini)來源的精氨酸脫亞胺酶(raADI)與精氨酸脫亞胺酶突變體(raADI-Lys—15)之間氨基酸序列比對。圖2精氨酸脫亞胺酶突變體的誘導表達SDS-PAGE圖。泳道1為天然ADI(raADI)未誘導空白對照，2號樣品為天然ADI(raADI)誘導3小時樣品，3_5號泳道為ADI突變體(raADI-lys_15)誘導3小時后樣品，6號泳道為未誘導的ADI突變體(raADI-Lys_15)空白對照。突變后的ADI在SDS-PAGE上的表觀分子量偏大。圖3層析后的樣品SDS-PAGE圖。泳道1為ADI突變體(raADI-Lys_15)，泳道2為天然ADI(raADI)，泳道3為低分子量蛋白MARKER。圖4表示精氨酸脫亞胺酶(raADI)和精氨酸脫亞胺酶突變體(raADI-Lys—15)的PEG修飾產物10%SDS-PAGE圖。泳道1為ADI突變體(raADI-Lys45)，泳道2為天然ADI(raADI)，泳道3為ADI突變體的PEG化產物mPEG2(1(1(1(1-raADI-Lys-15，泳道4為天然ADI的PEG化產物mPEG2Q_-raADI，泳道5為高分子量蛋白MARKER。圖5表示mPEG2_Q-raADI-LyS_15及raADI對荷瘤小鼠生長的影響。橫坐標為時間(周)，縱坐標為存活率(％)。序列說明SEQIDNO:1天然精氨酸脫亞胺酶的氨基酸序列，其氨基酸序列系克隆自精氨酸支原體(mycoplasmarginini)SEQIDNO:2含15個賴氨酸突變的精氨酸脫亞胺酶突變體的氨基酸序列SEQIDNO:3含12個賴氨酸突變的精氨酸脫亞胺酶突變體的氨基酸序列SEQIDNO4天然精氨酸脫亞胺酶的DNA編碼序列SEQIDNO:5含15個賴氨酸突變的精氨酸脫亞胺酶突變體的DNA編碼序列SEQIDNO:6含12個賴氨酸突變的精氨酸脫亞胺酶突變體的DNA編碼序列具體實施例方式在本發明的公開中，以下的縮寫可能被應用ADI，精氨酸脫亞胺酶；raADI，重組支原體(mycoplasmarginini)來源的精氨酸脫亞胺酶；raADI-Lys_15，含15個賴氨酸突變的重組精氨酸脫亞胺酶突變體；raADI-Lys_12，含12個賴氨酸突變的重組精氨酸脫亞胺酶突變體；PEG，聚乙二醇(Polyethyleneglycol)；mPEG,甲氧基聚乙二醇；mPEG2_Q-raADI，分子量為20，000的甲氧基聚乙二醇修飾的精氨酸脫亞胺酶；HiPEG2cicicicrraADI-LyiT15,分子量為20，000的甲氧基聚乙二醇修飾的精氨酸脫亞胺酶突變體(含15個賴氨酸突變)；HiPEG2cicicicTraADI-LyiT12,分子量為20，000的甲氧基聚乙二醇修飾的精氨酸脫亞胺酶突變體(含12個賴氨酸突變)；NHS，N-羥基琥珀酰亞胺；SPA，琥珀酰亞胺丙酸酯；PB，磷酸緩沖液；PBS，磷酸鹽緩沖液。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。實施例1重組精氨酸脫亞胺酶突變體的表達，純化與鑒定1.1重組精氨酸脫亞胺酶突變體的表達與復性為了獲得高生物活性的賴氨酸部分突變的重組精氨酸脫亞胺酶，本發明的研究者從對于賴氨酸隨機點突變的精氨酸脫亞胺酶突變體中，篩選出了一種賴氨酸部分突變的精氨酸脫亞胺酶的突變體，與原序列SEQIDNO:1相比，部分點突變的精氨酸脫亞胺酶突變體僅保留了部分不顯著影響活性的Lys殘基。測序表明，上述突變體的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示，其中有15個賴氨酸被其他氨基酸所替代，命名為raADI-Lys—15，具體突變位點分別是K9N，K59Q，K66R，K93E，K111R,K119Q,K121Q,K122E,K126E,K178I,K196I,K209G,K243E,K249D,K279Y。其DNA編碼序列參見SEQIDNO:5。用常規方法構建于pET39b表達載體上，鑒定后常規轉化表達宿主菌BL21DE3。并參照MisawaS等的方法進行復性和純化(MisawaSetal.，High-levelexpressionofMycoplasmaargininedeiminaseinEscherichiacolianditsefficientrenaturationasananti-tumorenzyme,JBiotechnol.,36:145-55,1994)。其復性和純化方法進行了適當改進，具體方法簡述如下raADI-Lys_15重組菌經37度高密度發酵，ImMIPTG誘導表達3小時(參見圖2)，離心，收集菌體，高壓勻漿破碎菌體，離心收集包涵體并洗滌。Ig包涵體溶解在15ml的增溶液(6M鹽酸胍，5mMEDTA,IOmMTris,pH8.5)中，室溫攪拌3小時。加入75μ1β-巰基乙醇繼續攪拌30min。然后將增溶液用1800ml的復性液(IOmMPB,pH至7.2)緩慢稀釋，復性溶液在15°C緩慢攪拌復性48小時。1.2重組精氨酸脫亞胺酶突變體的純化DEAE陰離子層析柱經IOmMPB(pH7.2)緩沖液充分平衡后將復性液上樣，經10倍柱床體積的0.5mol/L的NaCl梯度洗脫，收集活性raADI-Lys_15峰，然后在raADI-Lys_15目標峰中加入硫酸銨至1.Omo1/L,Phenyl-SpharoseHP疏水層析柱經1.Omol/L的硫酸銨(含IOmMPB,pH7.2)充分平衡后，將已加入硫酸銨DEAE目標峰上柱，硫酸銨由1.Omol/L降至0.lmol/L線性洗脫純化。疏水層析洗脫峰經脫鹽柱G25脫鹽除去硫酸銨，再次上DEAE陰離子層析柱純化，以除去樣品中含有的微量硫酸銨，并濃縮樣品。每克包涵體最終獲得約80毫克蛋白，經測序驗證，序列符合SEQIDNO:2。raADI基因序列(SEQIDNO:4)通過全合成獲得，與raADI-Lys—15—樣，構建于pET39b表達載體并轉化BL21DE3宿主菌。蛋白表達，復性及純化步驟亦同raADI-Lys_15—致。最終每克包涵體最終獲得約30毫克蛋白。1.3重組精氨酸脫亞胺酶突變體的酶活性測定ADI以精氨酸(Arg)為底物，產物胍氨酸能與血尿氮試劑(BUN)在100°C高溫下反應顯紅色。反應體系中加入終濃度IOmM的Arg，5ygADI，補充20mMPB(pH7.2)至500ul，37°C準確反應30min后，取50ul反應液加入5ml血尿氮試劑(BUN)中，混勻，沸水浴lOmin，最后測0D540，以胍氨酸為標準品作標準曲線。空白對照為不加ADI的血尿氮試劑(BUN)。從標準曲線上換算反應底物胍氨酸的含量(ymol)。酶活力單位的定義1個酶活力單位(U)定義為37°C，Imin內催化1μmol精氨酸完全轉化為1μmol胍氨酸的ADI酶量。用考馬斯亮藍法測定ADI蛋白含量，計算ADI酶的比活力。最后測得純化后的各種ADI比活如下raADI和raADI-Lys-15比活力分別約為33U/mg，30U/mg。實施例2根據實施例1中獲得的突變體中的突變位點，參考實施例1的方法制備15個突變點單點突變后的蛋白，檢驗各突變點單突變后的活性殘留，結果如下表所示表1精氨酸脫亞胺酶突變體單點突變后的活性殘留<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>氨基酸突變后氨基酸比活殘留率氨基酸突變后氨基酸比活殘留率K121Q85%K27996%K122E96%結果表明，上述單點突變的精氨酸脫亞胺酶突變體也能保留85%以上的活性殘留。鑒于實施例1和2的結果，本
技術領域：
的技術人員可知，這些突變點無論是單突變還是多突變對精氨酸脫亞胺酶的降解精氨酸活性均基本沒有影響，因此即使只發生了這15個賴氨酸中的部分突變，獲得的突變體也仍然能保持降解精氨酸的酶活性，且本
技術領域：
的技術人員根據本文記載的方法，也能獲得這15個賴氨酸突變任意組合的突變體。實施例3根據實施例2的結果，人工合成另一段精氨酸脫亞胺酶突變體，氨基酸與DNA序列分別參見SEQIDNO:3和SEQIDNO:6，與SEQIDNO:2相比，此突變體序列只發生了K9N，K59Q,K66R,K93E,K111R,K119Q,K121Q,K122E,K126E,K178I,K196I,K209G突變，共12個，命名為raADI-LyS_12。其表達、復性、純化與活性測定與實施例1相同，比活力仍為30U/mg左右。證明實施例1中發生的15個賴氨酸突變可以隨即組合，而并不顯著影響其活力。實施例4精氨酸脫亞胺酶突變體的PEG化修飾取實施例1和實施例3制得的IOOmL4mg/mL的raADI或raADI-Lys45、raADI-Lys42突變體溶液(緩沖體系為IOOmMBicine，pH8.0)，按140摩爾比加入PEG試劑(mPEG-SPA-20KD，北京凱正公司)。室溫下攪拌反應2小時。修飾后的產物用Phenyl-S印haroseHP純化，收集相應目標峰，最后用G25脫鹽柱除去(NH4)2S04。以raADI和raADI_Lys_15、raADI-Lys"12突變體制備所得產物分別命名為mPEG.^-raADI和mPEG20000-raADI-Lys15>mPEG20000-raADI-Lys12。實施例5=PEG化ADI的分析與鑒定精氨酸脫亞胺酶的修飾程度的測定參照NagA等描述的方法(NagAetal.,Acolorimetricassayforestimationofpolyethyleneglycolandpolyethyleneglycolatedproteinusingammoniumferrothiocyanate,AnalBiochem.，237(2):224-231，1996)有所改進:50ul修飾產物經蛋白酶K酶切1小時后，加入Iml硫氰酸鐵/氯仿(11)試劑，劇烈振蕩半小時，測510nm的吸光度值。以不同濃度的mPEG_20kD的吸光度值做標準曲線，計算出樣品中PEG的含量。酶活性測定方法同ADI活性的測定。結果見表2。表2精氨酸脫亞胺酶和精氨酸脫亞胺酶突變體的PEG修飾產物的活性保留情況<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>從表2中可見，天然的ADI在不同批次間平均修飾數目與比活之間的差異較大，而ADI突變體不同批次間的差異較小，且ADI突變體結合了約11個mPEG2(1_分子后，保留了45-55%的體外活性，活性殘留率明顯較天然ADI高。對于實施例2制備的單突變突變體也采用同樣的方法經PEG修飾后檢測活性殘留，其活性殘留與天然ADI相比略有提高。實施例6:H22移植瘤模型藥效試驗為驗證mPEG2_(1-raADI-LyS_15抑制肝細胞性肝癌的作用，隨機選取40只6周齡Balb/C小鼠制備荷瘤鼠模型，每只鼠于背部皮下注射5X105個小鼠肝癌細胞H22，荷瘤后讓瘤體生長到大約直徑0.5cm,分成4組，分別為mPEG2_-raADI-LyS-15治療組、mPEG20000-raADI治療組、raADI治療組、生理鹽水對照組。分別肌注10UmPEG2Q_-raADI-Lys-15，10UmPEG2Q_-raADI、10UraADI以及生理鹽水0.02ml/次只。每周給藥一次，共給藥二周，停藥后小鼠繼續飼養觀察10周。與raADI治療組、mPEG2_-raADI治療組和生理鹽水對照組比較，mPEG2_(1-raADI-LyS_15對H22荷瘤小鼠生存率明顯提高，至觀察期結束，荷瘤小鼠60%存活，在統計學上均有顯著差異(圖5)。在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。10權利要求一種精氨酸脫亞胺酶突變體，具有降解精氨酸為胍氨酸的酶活性，其氨基酸序列與具有SEQIDNO1的氨基酸序列的精氨酸脫亞胺酶相比，含有K9N，K59Q，K66R，K93E，K111R，K119Q，K121Q，K122E，K126E，K178I，K196I和K209G，K243E，K249D，K279Y突變中的一種或多種的組合。2.如權利要求1所述精氨酸脫亞胺酶突變體，其特征在于，所述精氨酸脫亞胺酶突變體的氨基酸序列含有K9N,K59Q,K66R,K93E,K111R,K119Q,K121Q,K122E,K126E,K178I,K196I和K209G，K243E,K249D,K279Y突變。3.如權利要求1所述精氨酸脫亞胺酶突變體，其特征在于，所述精氨酸脫亞胺酶突變體具有SEQIDNO:2或SEQIDNO3所示的氨基酸序列。4.如權利要求1-3任一所述精氨酸脫亞胺酶突變體，其特征在于，所述精氨酸脫亞胺酶突變體經一種低免疫原性或無免疫原性的聚合物修飾。5.如權利要求4所述精氨酸脫亞胺酶突變體，其特征在于，所述低免疫原性或無免疫原性的聚合物選自明膠、葡聚糖或聚乙二醇。6.如權利要求5所述精氨酸脫亞胺酶突變體，其特征在于，所述低免疫原性或無免疫原性的聚合物為聚乙二醇，聚乙二醇的分子量為5000到40，000。7.如權利要求6所述精氨酸脫亞胺酶突變體，其特征在于，所述聚乙二醇的分子量為20，000。8.如權利要求4-6任一所述精氨酸脫亞胺酶突變體，其特征在于，所述精氨酸脫亞胺酶突變體經低免疫原性或無免疫原性的聚合物修飾后，活性保留率高于同樣條件下未突變精氨酸脫亞胺酶被同樣條件修飾后的活性保留率。9.一種多核苷酸，所述的多核苷酸編碼權利要求1-8任一權利要求所述精氨酸脫亞胺酶突變體的氨基酸序列。10.一種表達載體，它含有權利要求9所述的多核苷酸序列。11.一種重組的宿主細胞，所述宿主細胞含有權利要求10所述表達載體，或者染色體中整合有權利要求9所述多核苷酸。12.—種制備權利要求1-8任一權利要求所述精氨酸脫亞胺酶突變體的方法，該方法包括1)用含有編碼精氨酸脫亞胺酶突變體的多核苷酸的重組表達載體轉化或轉導合適的宿主細胞；2)在合適的培養基中培養的宿主細胞；3)從培養基或細胞中分離和純化蛋白質。13.一種藥物組合物，它含有安全有效量的權利要求1-8任一所述精氨酸脫亞胺酶突變體，以及藥學上可接受的載體或賦形劑。14.權利要求1-8任一所述精氨酸脫亞胺酶突變體在制備治療病毒感染、腫瘤或阿爾茨海莫氏病的藥物中的應用。全文摘要本發明涉及一種部分賴氨酸突變的精氨酸脫亞氨酶突變體及其制備與應用。本發明的精氨酸脫亞胺酶突變體具有降解精氨酸為胍氨酸的酶活性，其氨基酸序列與具有SEQIDNO1的氨基酸序列的精氨酸脫亞胺酶相比，含有K9N，K59Q，K66R，K93E，K111R，K119Q，K121Q，K122E，K126E，K178I，K196I和K209G，K243E，K249D，K279Y突變中的一種或多種的組合。本發明的精氨酸脫亞胺酶突變體相比天然精氨酸脫亞氨酶，經PEG修飾后，活性殘留保持率提高，且由于賴氨酸的數目減少，產物更均一，可應用于肝細胞瘤、黑色素瘤等的臨床治療。文檔編號A61P31/12GK101812438SQ201010132859公開日2010年8月25日申請日期2010年3月25日優先權日2010年3月25日發明者傅曉瑜,凌建群,尚玉栓,溫曉芳,王葉飛,王玉姣,范敏,裘霽宛,黃巖山申請人:江蘇泰康生物醫藥有限公司