專利名稱：一種利用脂肪間充質細胞再生真皮組織的方法
技術領域：
本發明是一種利用人脂肪間充質細胞多向分化潛能，結合組織工程技術進行真皮 再生的方法，適用于整形外科及整形美容，屬于組織工程領域。
背景技術：
對抗衰老是全人類共同關注的話題。對人體肌膚起支撐作用的物質大部分存在于 真皮層，由膠原蛋白、彈性纖維和透明質酸構成的一個纖維網絡對皮膚起著支撐作用，其含 量的多少決定了皮膚的質地。這三種物質都是從真皮層中的成纖維細胞分泌而來成纖維 細胞不斷分泌膠原蛋白、彈性纖維和透明質酸來保持肌膚的光澤度和質感。25歲以后，成纖 維細胞以每年到2%的速度減少，隨之而來的就是膠原蛋白、彈性纖維和透明質酸的數 量均下降，體現出衰老的跡象。成纖維細胞的衰減是導致肌膚衰老的主要原因。成纖維細 胞來源于組織周圍的間充質細胞，在體內特定環境下間充質細胞具有分化為成纖維細胞的 能力。當前的美容醫學朝著簡單、微創、安全的方向發展，面部老化的治療也從過去的手 術治療向生物醫學制劑注射治療轉化。最早通過FDA驗證獲得商業應用的軟組織填充劑是 可溶性的膠原蛋白。從那以后，液體硅膠作為注射填充劑被廣泛使用，然而液體硅膠的并發 癥如移位變形等問題很難處理。當前使用最廣泛的填充劑是透明質酸。膠原和透明質酸注 射產品屬于生物可降解材料，對于矯正軟組織缺陷不能起到永久的效果。醫學界一直在尋 找一種填充劑能夠維持更長時間，同時具有較低的并發癥和副作用。本發明利用人脂肪間充質細胞的分化潛能，結合組織工程技術對人體損傷或衰 老的機體進行再生修復。本發明應用范圍包括皮下填充面部除皺，皮下填充美容，皮下填 充修復凹陷性缺失或損傷。下面以美容除皺為例闡述本發明的優點。美容除皺術已經有近 百年的歷史，目前常用的幾種方法簡述如下SMAS除皺簡單地說，就是人們常說的拉皮手術。即在皮下潛行分離，然后切除多 余皮膚、拉緊縫合。但術后易造成無表情，面部僵硬的“面具臉”。肉毒素(Botox) =Botox是一種神經毒素，灃入導致皺紋的肌肉內，作用于周圍運 動神徑末梢、神經肌肉接點及突觸處，抑制突觸前膜釋放神經遞質，阻斷乙酰膽堿的釋放， 從而使肌肉張力下降或癱瘓麻痹，皺紋也隨之消失，從而達到治療面部皺紋的效果。此方法 操作簡單，無腫脹瘀血，見效快，不發生過敏反應。但是這種方法是以破壞或減弱人體某些 正常生理功能為代價而達到去皺目的，因此消費者須慎重。此方法時效短，需要長期反復注 射才能維持效果。皮下埴充近年來在整形美容界，皮膚填充劑隨著材料和注射技術的進步正以空 前速度發展。整形美容消費市場對新型皮膚填充劑的需求正培育著新興產業。膠原類和透 明質酸類是該類注射劑的主要產品。這類填充術的主要特點是微創，手術簡單，見效快。但 是由于這類填充劑是生物可降解材料，故短期內皺紋會再現。其他填充劑如早期的愛貝芙 和伊凡露已經逐漸被透明質酸類填充物所取代。
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運用細胞技術和組織工程技術進行整形美容手術，是現代美容業發展的一個方 向。組織工程是20世紀80年代隨著現代醫學技術的發展，尤其是細胞生物學、分子生物學 和生物材料科學的發展而提出來的醫學新概念。組織工程的基本原理和方法是將體外培 養擴增的細胞吸附于一種生物相容性良好并可被機體吸收的生物材料上形成復合物，將細 胞/生物材料復合物植入機體組織、器官的病損部分，細胞在生物材料逐漸被機體降解吸 收的過程中形成新的在形態和功能方面與相應器官、組織相一致的組織，而達到修復創傷 和重建功能的目的。組織工程有三個基本的要素一是細胞；二是為細胞提供類似于細胞 外基質生長環境的三維支架材料；三是其他成分如生長因子、細胞黏附因子、細胞養分等， 為細胞的生長分化提供所需要的微觀生理環境。下面從種子細胞、支架材料、微生理環境三 個方面闡述本發明的先進性。組織工程中使用的種子細胞需滿足以下幾點要求增殖能力強，能進行大規模擴 增以產生足夠數量的細胞；活力和功能良好；細胞純度高；不發生免疫排斥反應；生物安全 性好。在種子細胞取材方面要考慮幾點原則細胞來源廣泛，來源充足；取材安全方便，供 區創傷小；細胞培養技術簡單易行，培養與擴增成本低。本發明中采用的脂肪來源的間充質 細胞完全滿足上述需求，被認為是一種非常理想的組織工程種子細胞。脂肪間充質細胞來 源非常豐富，平均每300毫升脂肪組織可以獲得2-6億個這樣的細胞。另外由于采用病人 自身的成體干細胞，避免了倫理爭議和免疫排斥反應。脂肪組織取材一般有兩種方法，即儀 器抽吸法和手術切取法。有實驗表明這兩種方法對脂肪干細胞的增殖能力和分化能力的影 響沒有顯著差異。儀器吸脂法由于操作簡單，創傷小，可作為臨床獲取組織工程種子細胞的 首選方法。組織工程支架材料為種子細胞提供類似于細胞外基質的，適合細胞生長、分化等 功能的三維生物學空間，克服了以往單一細胞移植中細胞不易存活、基質合成能力低下等 缺點。支架在細胞的生長分化過程中逐漸被機體降解吸收，從而達到對病變或缺損組織的 再生性修復。由于人體待修復的組織在形態、功能、結構等方面區別很大，對支架材料也有 不同的要求。但是以下幾點基本要求必須滿足生物相容性，無免疫原性；適當的降解速 率，降解產物無毒無副作用；適當的機械強度等。水凝膠作為支架材料用于人體軟組織的 修復具有巨大的優勢。水凝膠是一種在水中溶脹并保持大量水分而又可降解或不降解的 聚合物。某些水凝膠由于聚合物網絡中的大量水分而賦予了整個材料流體的性質；充盈有 大量水分的特性又與機體組織極其相似，使其成為一種理想的作為類似于細胞外基質的支 架材料；細胞非常容易種植其中；且能為細胞提供真正的三維空間的生存環境；其水凝膠 的特性易于營養成分的滲透移動，因此能有效地為細胞提供養分；柔軟、濕潤的表面以及組 織的親和力大大減少了材料對周圍組織的刺激性，使得水凝膠聚合物具有良好的生物相容 性。水凝膠特性又能使其利用簡單的注射方法很容易地填充入不規則形狀的損壞組織內， 從而避免使用固體支架時必須動手術而給病人帶來的機體損傷和痛苦。水凝膠由于上述各 種優點使其作為支架材料在組織工程中的應用已經引起越來越廣泛的興趣。在支架材料和種子細胞的復合體中，適當的微觀生理環境是構建具有生命活性的 各種組織和器官至關重要的因素。組織內環境包括了不同的細胞因子、組織特異性細胞外 基質以及細胞間相互作用等。其中各種營養成分(如氧)的供應是保證組織工程所構建的 各種組織具有生命活性的必要條件。本發明中使用水凝膠支架材料不僅有益于機體內各種營養成分在其中的運動從而為細胞提供養分，而且其水凝膠特性也有益于方便地在其中加 入細胞及細胞所需的各種成分。

發明內容
本發明的目的之一是提供一種方法和配方，將來源于自體脂肪組織的間充質干細 胞經體外培養增殖后混合入支架材料中移植入病人體內，移植體內的脂肪間充質干細胞在 局部微環境的作用下向真皮成纖維細胞分化，新生的真皮成纖維細胞能夠進一步激活注 射部位細胞膠原基質的分泌，從而對人體皮膚組織的缺損和衰老進行再生性的修復，本技 術的適用范圍包括皮下填充面部除皺，皮下填充美容，皮下填充修復凹陷性缺失或損傷寸。本發明中使用的種子細胞是從病人自身脂肪組織內分離純化制得，因而避免了倫 理爭議和免疫排斥反應。可以采用儀器抽吸法進行脂肪組織的取材，操作簡單，給病人帶來 的創傷和痛苦小。本發明中使用的種子細胞是脂肪組織內經分離、純化、培養得到的間充質干細胞。 這些細胞在一定的誘導條件或生理環境下能分化成為成纖維細胞。本發明中使用的支架材料是具有生物相容性和生物降解性能的高分子水凝膠。水 凝膠內混合入脂肪間充質干細胞和其他成分之后，可以通過注射器注入病人體內，手術過 程非常簡單，不留疤痕，避免了使用固體支架材料時所必須的手術，從而避免了給病人帶來 的機體損傷和痛苦，患者容易接受。本發明中使用的水凝膠支架材料可以通過注射器方便地填充入真皮層和形狀不 規則的缺陷內，因此本發明在整形外科中的應用范圍非常廣泛。本發明中使用的水凝膠支架材料非常易于各種成分的加入及其在內部的移動。這 些成分包括生長因子以及細胞增殖、分化、生長所必須的營養成分。


圖1、脂肪間充質干細胞圖2、脂肪間充質干細胞體外誘導分化成脂肪細胞(左)，骨細胞(右)圖3、脂肪間充質干細胞分化為皮膚成纖維細胞(左)，角蛋白抗體陽性(右)圖4、脂肪間充質干細胞分化為皮膚成纖維細胞(左)，角蛋白抗體陽性(右)圖5、注射前耳后組織活檢(左)，自體脂肪間充質干細胞注射后組織活檢(右)
實施例實施例一脂肪間充質干細胞的提取、培養及鑒定實施例二 脂肪間充質干細胞/水凝膠支架材料復合物的制備與檢測實施例三動物實驗實施例四自體脂肪間充質干細胞臨床治療頸紋實施例五自體脂肪間充質干細胞注射前后組織活檢對比實施例一脂肪間充質干細胞的提取、培養及鑒定1.脂肪間充質干細胞的提取與培養
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(1)將通過儀器吸脂法獲得的30毫升脂肪組織內血管、結締組織等多余成分剔除 后用含有抗生素的可注射級0. 8%的生理鹽水沖洗2-3遍，得到淡黃色的脂肪顆粒組織；(2)向凈化后的脂肪顆粒內加入2mg/ml的I型膠原酶溶液(美國Worthington公 司)于37°C消化60-90min，完全培養基(DMEM+10% FBS，均為美國Gibco公司)終止消化；(3) 150目篩網過濾人脂肪組織消化后的產物；(4)過濾后以1000轉/分鐘的轉速離心lOmin，完全培養基重懸，苔盼藍(中國國 藥集團)染色后計數；(5)在完全培養基中以1 X 105/cm2的密度將人脂肪間充質干細胞接種在T25的塑 料培養瓶(美國Corning公司)中，并置于37°C、5%的二氧化碳培養箱內培養；(6)細胞長至85%左右時進行細胞傳代。傳代時先移去血清培養基，然后每瓶加 入2ml 0.25%胰酶(Sigma，美國)室溫消化5分鐘，顯微鏡下觀察，待細胞變圓后加入血 清培養基終止消化，收集消化得到的細胞懸液以1500轉/分的轉速離心lOmin，完全培養基 重懸后以1 3的比例重新接種細胞，待細胞長滿后得到第一代細胞。(7)細胞培養擴增按照步驟(6)的方法重復進行。得到的脂肪間充質干細胞在顯微鏡下觀察如圖一所示。2.人脂肪間充質干細胞的鑒定(1)人脂肪間充質干細胞生物學特性檢測i.利用倒置顯微鏡觀察各代人脂肪間充質干細胞的細胞生長形態特征及測定細 胞生長周期，通過觀察測定人脂肪間充質干細胞原代及傳代細胞呈梭形貼壁生長，通過對 P1、P2、P3代周期測定，各代均在傳代第5-6天進入生長對數期，無明顯差異性存在。ii.利用免疫熒光的方法對人脂肪間充質干細胞相對特異性標記進行檢測。結果 顯示人脂肪間充質干細胞抗原⑶29、⑶44、⑶71、⑶106呈陽性表達，抗原⑶45、⑶34呈陰 性表達。(2)人脂肪間充質干細胞多向分化能力的檢測選取P1、P2、P3代人脂肪間充質干 細胞在成脂肪誘導液(基本培養基+胰島素+地塞米松+吲哚美辛)培養下，培養9天后 油滴樣的脂肪細胞出現，繼續培養脂肪油滴逐漸增大，第20天油紅染色鑒定脂肪細胞，結 果陽性。成骨誘導分析選用成骨誘導液(基本培養基+地塞米松+抗壞血酸甘油磷 酸鈉)培養，持續誘導培養22天后用茜素紅染色鑒定成骨細胞，結果陽性。脂肪間充質干細胞體外誘導分化結果如圖二所示。實施例二 脂肪間充質干細胞/水凝膠支架材料復合物的制備與檢測1.脂肪間充質干細胞/膠原蛋白水凝膠支架材料復合物的制備按照實施例一所述方法進行脂肪間充質干細胞的提取分離、培養擴增，將獲得的 脂肪間充質干細胞混入注射級膠原蛋白水凝膠中配制成細胞濃度為5Χ 106/ml的細胞懸浮 液。此懸浮液可用來進行皮下注射進行組織工程再生醫療應用。2.脂肪間充質干細胞/膠原蛋白水凝膠支架材料復合物的檢測(1)細胞成活率檢測利用苔盼藍排斥試驗對收集得到的細胞進行細胞成活率及 細胞數目進行測定，細胞存活率在95%以上；(2)細胞無菌、無病毒檢測參見《中國藥典》2005版第三部附錄XII A第73頁和 《組織工程醫療產品第12部分細胞、組織、器官的加工指南》相關規定，對培養中的各代細胞進行無菌、無外源性病毒檢測；(3)血清殘留檢測參見《中國藥典》2005版第三部附錄XIII D項規定標準，對細 胞收集處理后的細胞進行血清殘留檢測；(4)復合物免疫反應檢測在臨床實驗注射前，取100 μ 1復合物對臨床實驗患者 進行皮試，觀察無免疫反應出現。實施例三動物實驗將實施例二中的細胞/水凝膠復合物經Iml注射器進行裸鼠皮下注射。注射前將 裸鼠全麻，每個注射點的注射量控制在250ul左右，對照組采用等量生理鹽水代替注射物。 實驗組與對照組每次各選用裸鼠(體重約20g，健康，雄性)5只，兩組實驗同等條件下重復 三次。實驗組和對照組裸鼠在注射實驗30天后解剖觀察，采集注射部位的皮膚進行組織 切片染色檢查。結果表明實驗組裸鼠注射部位的真皮部位存在外源性人脂肪干細胞，且角 蛋白抗體陽性。脂肪間充質干細胞體內分化為皮膚成纖維細胞結果如圖三所示。實施例四自體脂肪間充質干細胞臨床治療頸紋在病人皺紋局部表面麻醉情況下，將實施例二中的細胞/水凝膠復合物沿頸紋注 射入真皮層，邊注射邊退針。手術完成后按照標準的隨訪跟蹤制度對臨床效果進行監測。結 果顯示在皺紋下方注射的復合物未引起免疫反應，復合物能夠起到支持組織結構的作用， 原有皺紋得到明顯改善。自體脂肪間充質干細胞臨床治療頸紋效果如圖四所示。實施例五自體脂肪間充質干細胞注射前后組織活檢對比局部表面麻醉情況下，依實施例四的方法在病人耳后真皮層注射細胞/水凝膠復 合物，同樣邊注射邊退針。手術后一個月在病人耳后注射部位和未注射部位分別取長7毫 米寬5毫米的皮膚組織，常規HE染色，結果顯示注射部位真皮層明顯增厚，有明顯的纖維組 織增生。自體脂肪間充質干細胞注射前后組織活檢對比效果如圖五所示。
權利要求
一種利用脂肪間充質干細胞再生真皮組織的方法，其特征在于種子細胞為脂肪間充質干細胞，取自病人自身的脂肪組織，經提取、純化、體外培養擴增后，均勻植入水凝膠支架材料內形成復合物，再注射入病人真皮層。
2.如權利要求書1所述的再生真皮組織的方法，其應用范圍有皮下填充除皺，皮下填 充美容，皮下填充修復凹陷性缺失或損傷。
3.如權利要求書1所述的種子細胞，其特征在于種子細胞是從脂肪組織內分離出來 的間充質干細胞，取自于病人自身脂肪組織。種子細胞經從脂肪組織中提取、純化、體外培 養擴增等一系列過程。
4.如權利要求書1所述的復合物，其特征在于將一定數量的種子細胞(細胞濃度為 IO5 108/ml)植入水凝膠支架材料內形成細胞均勻分散的細胞-水凝膠支架材料復合物。
5.如權利要求書4使用的水凝膠支架材料，其特征在于水凝膠支架材料是具有生物 相容性和生物降解性能的天然高分子或合成高分子材料。水凝膠支架材料是可以通過針頭 注射入病人體內的可流動的水凝膠。水凝膠成分為膠原蛋白、透明質酸或透明質酸鹽、泊洛 沙姆(poloxamer)、纖維素衍生物、海藻酸或海藻酸鹽、殼聚糖及其衍生物、纖維蛋白原中的 一種或幾種的混合物。
6.如權利要求書5所述的可供使用的可注射水凝膠支架材料包括膠原蛋白水凝膠， 其重量百分比濃度為0. 1-10% ；透明質酸或透明質酸鹽，其濃度為0. 1-5% ；泊洛沙姆 (poloxamer)，其濃度為15-30%；纖維素衍生物，其濃度為0.；海藻酸或海藻酸鹽，其 濃度為0. 1-10% ；殼聚糖及其衍生物以及以殼聚糖及其衍生物為基礎的混合物，其中殼聚 糖及其衍生物濃度為0. 1-10% ；纖維蛋白原以及以纖維蛋白原為基礎的混合物，其中纖維 蛋白原濃度為0. 1-5%。
7.如權利要求書6，細胞-水凝膠支架材料內可以含有血管生長因子以及細胞必需的 營養成分。
8.如權利要求書1，細胞-水凝膠支架材料復合物使用醫用注射器注射入病人真皮層。
全文摘要
本發明的目的之一是提供一種方法和配方，將來源于自體脂肪組織的間充質干細胞經體外培養增殖后混合入支架材料中移植入病人體內，移植體內的脂肪間充質干細胞在局部微環境的作用下向真皮成纖維細胞分化，新生的真皮成纖維細胞能夠進一步激活注射部位細胞膠原基質的分泌，從而對人體皮膚組織的缺損和衰老進行再生性的修復，本技術的適用范圍包括皮下填充面部除皺，皮下填充美容，皮下填充修復凹陷性缺失或損傷等。本發明中使用的種子細胞是從病人自身脂肪組織內分離純化制得，因而避免了倫理爭議和免疫排斥反應。可以采用儀器抽吸法進行脂肪組織的取材，操作簡單，給病人帶來的創傷和痛苦小。
文檔編號A61L27/38GK101961510SQ201010147120
公開日2011年2月2日 申請日期2010年4月15日 優先權日2010年4月15日
發明者徐妍, 文獻, 王影, 董運海, 魏翠, 黃金龍 申請人:王影