專利名稱：黃連素作為制備腫瘤放射治療增敏藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于腫瘤放射治療增敏藥物領域，具體涉及黃連素作為制備腫瘤放射治療增敏藥物中的應用。
背景技術：
現有技術中，常用的放療增敏藥物包括(I)MISO(Misonodaxole) :MIS0是一個在臨床實驗階段得到充分肯定的乏氧細胞 增敏劑。(2)康萊特是從傳統中藥薏苡仁中提取制成的注射液。該藥已經廣泛應用于治 療各種惡性腫瘤，同時也是一種放射增敏劑。(3) SR-2508 (Etanidacole) :SR_2508為硝基咪唑的酰胺衍生物，其增敏效價與 MISO相近，但毒性較低，最大可耐受總劑量約為MISO的3倍。SR-2508對化療藥也有增敏作用。(4)AK-2123 :AK_2123為硝基咪唑類化合物，是一種親電子性的放射增敏劑，口服 或腫瘤內注射。它的增敏效應與MISO相近，而毒性卻低得多。另外，動物實驗研究均提示 使用AK-2123對熱療和化療亦有增敏作用。(5)912 :912是從中藥地龍(蚯蚓)提取的一種抗癌藥，離體實驗和整體實驗均有 一定的放射增敏作用。臨床試驗結果表明，912無毒副作用。(6)毛冬青毛冬青是一種冬青科植物，具有活血化瘀、清熱解毒等功效。臨床研 究表明，它對鼻咽癌患者有一定的放射增敏作用；頸淋巴結消失時的平均放射劑是量也明 顯低于單純放射組；能提高鼻咽癌患者的生存率。毛冬青聯合放療是安全的，不但不會增加 皮膚和胃腸道反應，而且對口咽粘膜反應還有一定的減輕作用。(7)枸杞多糖枸杞多糖是從中藥枸杞中提取的主要成分，對機體無毒性作用。枸 杞多糖單獨應用對腫瘤無明顯抑制作用，但動物實驗及臨床觀察表明，枸杞多糖與放射治 療聯合應用有增敏效果。臨床研究表明，枸杞多糖合并放療對原發性肺癌的近期療效有所 提尚。(8)漢防已甲素漢防已甲素是從中藥漢防已中提取出來的。上海第一醫學腫瘤 醫院高令山報道，采用漢防已甲素合用小劑是量放射線對97例晚期肺癌進行了觀察，結果 放射量為1500 2000rad(常規量為6000rad)肺部腫瘤不同程度縮小者占61. 9%，表明漢 防已甲素有一定的放射增敏作用。(9)紫杉醇(paclitaxel，商品名taxol)紫杉醇是一種紫杉的樹皮中分離出來的 天然產物，為新一代的抗腫瘤藥物。研究表明，其對卵巢癌、乳腺癌、非小細胞肺癌、惡性淋 巴瘤等有明顯療效。另外，研究發現當紫杉醇和射線合用時有較好的放射增敏作用，而且增 敏作用隨著藥物濃度增加而增大。黃連素又名小檗堿是從毛莨科植物黃連、黃柏中提取的一種季胺類化合物，分子 量為317. 8。在中國和印度黃連素是一種非常古老的藥物，臨床上長期用于臨床解熱，解毒和抗腸道細菌感染。近年來研究發現黃連素具有包括降血壓、抗心肌重構、抗心力衰竭、抗 血管粥樣硬化、降血脂、降血糖、介導細胞免疫在內的其它生化和藥理學活性。研究也發現 大劑量的黃連素具有抗腫瘤功效，可以抑制結腸癌細胞的增生，抑制食管癌，乳腺癌和前列 腺癌細胞的生長，但是大劑量使用時同時會毒性，雖然減小劑量可以消除毒性，但是劑量小 的時候無法產生抗腫瘤效果。同時目前未見黃連素作為放療增敏藥物的應用報道。

發明內容
本發明目的是提供黃連素的新用途，即黃連素在制備腫瘤放射治療增敏藥物中的 應用。本發明的另一目的是提供一種腫瘤放射治療增敏藥物。為達到上述目的，本發明采用的技術方案是一種腫瘤放射治療增敏藥物，所述腫 瘤放射治療增敏藥物活性成分為黃連素。上述技術方案中，所述腫瘤放射治療增敏藥物還包括本領域技術人員公知的輔助 配料，例如，將腫瘤放射治療增敏藥物制成局部注射劑型時，可以添加乙烯基吡咯烷酮水溶 膠以起緩釋藥物的作用；所述腫瘤放射治療增敏藥物的劑型包括靜脈注射劑型，局部注 射劑型，片劑，滴劑等多劑型。對上述技術方案所述腫瘤放射治療增敏藥物的研究發現(1)黃連素處理乳腺癌細胞可以誘導劑量依賴性的GcZG1期細胞阻滯和細胞凋亡 黃連素抑制50% MCF-7細胞和MDA-MB-231細胞的生長的劑量(IC5tl)大約為10 μ mol/L(48 小時)和大約5 μ mol/L(72小時)。(2)黃連素明顯降低了細胞周期調節相關蛋白cyclin B和抗細胞凋亡蛋白Bcl_2 的表達水平，而增加了凋亡蛋白Bax和caspase-3的表達水平。這些為黃連素作為腫瘤放 射治療增敏藥物提供了作用機制。(3)黃連素處理后的乳腺癌細胞明顯提高了細胞對放射治療的敏感性黃連素濃 度5 μ mol/L 24小時處理的MDA-MB-231細胞和MCF-7細胞輻射增敏比分別為1. 4207禾口 1. 5420。上述研究結果表明，黃連素可以用作制備腫瘤放射治療增敏劑，并且當腫瘤放射 治療增敏劑中黃連素濃度低至5 μ mol/L時，對細胞不會產生毒性；并且本領域技術人員公 知，當黃連素濃度低至5 μ mol/L時，對腫瘤細胞進行短時間(不超過24h)的處理無法產生 顯著的抗腫瘤作用。因此，優選的技術方案中，腫瘤放射治療增敏劑中黃連素濃度小于等于5 μ mol/L， 進一步優選的技術方案中，腫瘤放射治療增敏劑中黃連素濃度為2 μ mol/L 5 μ mol/L。應用上述腫瘤放射治療增敏藥物的方法，包括但不限于以下兩種方法(1)在腫瘤病人放射治療前不同時間(如30分鐘)靜脈注射不同劑量的黃連素針 劑(如50mg/kg)，然后給予放射治療，以提高腫瘤的放射治療療效。(2)在腫瘤病人放射治療前不同時間(如60分鐘)腫瘤局部注射不同劑量的含黃 連素水溶膠(如100mg/kg)，然后給予放射治療，以提高腫瘤的放射治療療效。由于上述技術方案運用，本發明與現有技術相比具有下列優點本發明所述腫瘤放射治療增敏藥物可以提高腫瘤放射治療的治療效果，降低腫瘤病人的放射治療的照射劑量，降低放射治療所帶來的毒副作用，從而提高病人的生存質量。


圖1是實施例中細胞存活率和黃連素用量與時間關系圖；圖2是實施例中黃連素誘導細胞凋亡的Armexin-V/PI染色和流式細胞分析結果 圖；圖3是實施 例中指數生長的MDA-MB-231和MCF-7細胞培養中加入不同濃度的黃 連素24小時處理后完成Wester blot法測定蛋白表達圖；圖4是實施例中MCF-7和MDA_MB_231兩種細胞(有/無黃連素處理)經不同劑 量輻射的生存曲線圖。
具體實施例方式下面結合附圖及實施例對本發明作進一步描述實施例(1)材料人乳腺癌細胞株MDA-MB-231及MCF-7購于美國細胞收藏中心(ATCC)， 并由發明人所在實驗室保存和培養；D-MEM培養基干粉，小牛血清，胰酶粉末購自Gibco公 司；標準蛋白質分子量、SDS-PAGE上樣緩沖液、RIPA蛋白裂解液、TE電泳緩沖液、IOX轉膜 液、30% Acry-Bis、Tris-Hcl、過硫酸銨(AP)、SDS、四甲基乙二胺(TEMED)、碘化丙啶(PI) 購自江蘇碧云天生物技術研究所；二甲基亞砜(DMS0)、瓊脂糖和Tween-20來自上海高科技 生物工程有限公司；caspase-3，bcl_2、bax、cyclin Dl等抗體購自美國Santa Cruzs生物 技術公司；RNase A 禾口 10 μ g/mL proteinase K 購自美國 Sigma Aldrich 公司。(2)細胞培養MDA-MB-231及MCF-7細胞培養于含10%小牛血清，谷氨酸胺及100 萬U/L青霉素和鏈霉素的D-EME培養基。細胞置于5% CO2, 37°C培養箱內培養，每2_3天 傳代1次，本實施例中取對數生長期細胞用于實驗。(3)照射條件細胞置于直線加速器下，射線性質為高能6兆伏X-線，照射野為 IOcmX 10cm，源皮距為100cm，劑量率為200cGy/min。照射時培養皿面上覆蓋1. 5cm厚等效 蠟板以調整照射劑量。(4) MTT法觀察乳腺癌MDA-MB-231及MCF-7細胞的生長在藥物處理前24小時細 胞(5X104/mL)接種至96孔板中，每個濃度設5個平行孔。加入不同濃度的黃連素繼續培 養24，48或72小時。細胞培養液中加入20 μ LMTT (5 μ g/mL)繼續培養4小時。吸棄培養 液，每孔加入150 μ L DMSO,搖床輕柔振蕩10分鐘，最后采用酶標儀(A570nm/A630nm吸光 值)檢測光密度，采用細胞存活率=加藥組值/對照組值X 100%方式計算細胞存活率。重復三次實驗，將三次實驗數據處理后得到實驗結果(平均值士誤差)，繪制細胞 存活率和黃連素用量與時間關系圖，結果參見圖1 黃連素明顯抑制細胞的生長，并顯現劑 量_效應和處理時間_效應的關系；黃連素抑制50% MCF-7細胞生長的劑量(IC5tl)在分別 為20· 1“11101/1(24小時)，10.4“11101/1(48小時)和 5. 3 μ mol/L (72 小時)；在另外一乳 腺癌細胞系MDA-MB-231，黃連素IC50分別為10. 3 μ mol/L (48小時)和4. 7 μ mol/L (72小 時)。這些實驗結果說明黃連素明顯地抑制乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細胞的生長，與黃 連素處理濃度和處理時間成正比，即表現為劑量_依賴和處理時間依賴性。MDA-MB-231細胞比MCF-7細胞對黃連素微敏感一些，但黃連素的IC5tl濃度都在大約10 μ mol/L(48小時) 和大約5 μ mol/L(72小時)，說明黃連素抑制乳腺癌細胞生長可能是細胞系非依賴性的。(5)流式細胞技術分析細胞周期的變化將乳腺癌細胞MDA-MB-231及MCF-7接種 于IOOmm培養瓶，待貼壁后(待細胞長至60-70%左右)分別加入不同濃度黃連素處理24 小時后收集各組細胞，采用l，800g離心速度離心5分鐘。棄去上清，用Ix PBS緩沖液洗滌 細胞1次，1，SOOg離心5分鐘，并收集細胞沉淀。細胞放置在冰上預冷的70%乙醇固定4 小時，離心后，以Ix PBS洗滌細胞兩次。離心后，懸浮細胞于500 μ L含300 μ g/mL RNase A 和 10μ g/mLproteinase K (美國 Sigma Aldrich 公司)的 PI 溶液中(10 μ g/mL)，3O 分鐘 后，經孔徑為53μπι的尼龍濾網過濾，FACS-Calibur流式細胞儀上檢測分析。分析結果參 見表1 黃連素處理誘導了劑量依賴性的G0/G1期細胞周期阻滯，降低了 S期細胞比例。但 對G2/M期比例并沒有產生明顯影響。而且，在黃連素處理的MCF-7和MDA-MB-231兩種細 胞中都可以觀察G0/G1期細胞周期阻滯。這些實驗結果說明黃連素可以誘導乳腺癌細胞周 期阻滯。隨著黃連素濃度的增加，乳腺癌細胞S期比例下降，同時出現明顯的G0/G1期細胞 阻滯。表1.黃連素對MDA-MB-231及MCF-7細胞周期的影響。 MDA-MB-231 細胞MCF-7 細胞
黃連素 -
(Hmol/L)G0/G1SG2/MG0/G1SG2/M
O44.39±2.7234.47±2.3421.15±10.7545.45±2.0434.26±0.9121.08±1.63
551.09±3.53*29.59±6.0619.33±8.4849.96±0.29*28.11±3.5721.23±3.72
1054.00±4.22*27.6ftt6.3418.40±7.6555.51±1.02*27.12±6.1216.71±5.62
2058.35士 1.04*21.28±1.2220.37±11.1159.03±0.43*21.63±3.6817.71±3.99
4063.98±1.11* 18.63±0.91 17.54±9.55 63.10±0.86* 19.04±0.94 18.01±1.14
— \注現已知腫瘤細胞主要是由于細胞周期破壞而導致了細胞的失控性生長，細胞 周期阻滯是乳腺癌許多化療藥物和放射治療的重要作用機理之一。< 0. 05 (與對照組 相比)。(6)磷脂酰絲氨酸外翻分析細胞凋亡(Armexin V和PI雙染法，采用Armexin-V/ PI染色和流式細胞分析方法可以將細胞分成4種屬性，其中Dl象限(Annexin-V7Pr)為 壞死細胞象限；D2象限(Armexin-VVPI+)為晚期凋亡細胞；D3象限(Armexin-V7Pr)為 未損傷正常細胞；D4象限(Armexin-VVPr)為早期凋亡細胞。)將對照組細胞和不同濃 度黃連素處理后的細胞用采用PBS洗2次，加入100 μ 1 binding buffer和FITC標記的 Annexin-V (20 μ g/ml) 10 μ 1，并室溫避光30分鐘。細胞再加入PI (50 μ g/ml) 5 μ 1，避光靜 置5分鐘后，最后加入400 μ 1 binding buffer，并立即用流式細胞儀定量檢測。以不加 ArmexinV-FITC及PI的一管作為陰性對照，分析結果參見圖2。從圖2的結果可以看出，在未處理的乳腺癌MDA-MB-231及MCF-7細胞處于IV 象限的細胞數量非常少，即分別5. 2%和3. 4%，而處在I和II象限的細胞幾乎是檢測不 至IJ。黃連素24小時處理的乳腺癌MDA-MB-231及MCF-7細胞凋亡及死亡細胞比例均增高， 在 MDA-MB-231 和 MCF-7 細胞分別 51. 2% 和 23. 3% (10ymol/L)以及 86. 6 % 和 66. 6 %(40μπιΟ1/ ，即IV象限的早期凋亡細胞數量隨著黃連素的濃度增高而呈明顯增加。而且 黃連素液使得處在I和II象限的細胞數量也明顯增多。這些實驗結果說明大劑量黃連素 可以誘導乳腺癌細胞的凋亡。
(7) Western-blot法分析黃連素對細胞周期和凋亡相關蛋白的影響收集細胞并 轉至于1. 5ml的Eppendorf管中離心(2500轉/分)5分鐘，棄上清，并加入100 μ 1 IP裂 解液，置于冰上2小時。4°C離心5分鐘(2，500轉/分鐘)，轉移上清液至新的Eppendorf 管，并采用分光光度計檢測樣品蛋白含量。加入蛋白上樣緩沖液(5X)混勻，置于恒溫混勻 器上，100°C 5分鐘，蛋白電泳后轉至醋酸纖維膜上。膜采用封閉液(5%脫脂奶粉，IXT-BST 緩沖液)封閉lh。洗滌，并加入一抗β-Actind 1000稀釋)，Bax(l 1000稀釋)， Bcl-2(1 500 稀釋)，Caspase 3(1 1000 稀釋)，Cyclin B(1 500 稀釋)，Cyclin DKl 500稀釋)經封閉液處理的醋酸纖維膜室溫撫育1小時。T-BST緩沖液洗膜3次， 加入二抗(1 1000稀釋)撫育1小時。T-BST緩沖液洗膜3次，最后加ECL發光劑，顯影、 定影，膠片洗滌和干燥后，掃描分析。分析結果參見圖3。如圖3所示，黃連素24小時處理后，Bax蛋白表達在MDA_MB_231及MCF-7兩種細 胞中都顯現劑量依賴性的明顯增加。同樣，Caspase-3蛋白表達水平也表現出劑量依賴性 的明顯提高。相反，Bcl-2和Cyclin Bl兩種蛋白的表達均出現降低，在5 μ mol/L處理后 就可見明顯的下降，且隨黃連素濃度的增加而降低。而黃連素并不影響Cyclin Dl蛋白表 達水平。(8)細胞克隆形成法5 μ mol/L黃連素處理4小時的細胞接受不同劑量的x -輻 射照射，然后接種到IOOmm培養皿。連續培養三周后，采用甲醇固定，加姬姆薩液染色30分 鐘，流水洗凈，最后觀察和記錄含有>50細胞的克隆個數。采用克隆形成率(PE)=(對照 組克隆數/實驗組細胞數)X 100%公式計算克隆形成率，采用存活分數=實驗組克隆形成 率/對照組克隆形成率公式計算存活分數。計算放射增敏比SER =對照組DO/實驗組DO。重復三次實驗，取三次實驗結果的平均值(所有數據誤差都在5%以下)，采用單 靶多擊模型完成擬合生存曲線，結果參見圖4。由圖4可知，與沒有用黃連素處理的細胞相比，黃連素處理后的MCF-7和 MDA-MB-231兩種細胞出現生存曲線無肩，成一直線。單靶多擊模型曲線回歸檢測后計算黃 連素濃度5 μ mol/L24小時處理的MDA-MB-231細胞和MCF-7細胞輻射增敏比分別為1. 4207 和1.5420。這些實驗結果說明黃連素增加乳腺癌細胞的放射敏感性。注，本實施例中，所有實驗均重復3-5次，取平均值，結果用歹± S表示。采用SAS 統計軟件對相關數據進行t檢驗，以P < 0. 5為有顯著性差異。克隆形成實驗中細胞存活 曲線及回歸方程采用SigmaPlot 9. 0分析。本實施例證明，黃連素通過抑制腫瘤細胞周期進程和影響細胞周期進程和細胞凋 亡相關蛋白的表達，從而增加腫瘤細胞對放射治療的敏感性。因此，本發明在黃連素在包括 乳腺癌在內的各種腫瘤放射治療前給藥和放射治療同時給藥可以提高腫瘤放射治療增敏 性，從而提高放射治療的治療效果。
權利要求
黃連素在制備腫瘤放射治療增敏藥物中的應用。
2. 一種腫瘤放射治療增敏藥物，其特征在于，所述腫瘤放射治療增敏藥物活性成分為黃連素。
3.根據權利要求2所述腫瘤放射治療增敏藥物，其特征在于，腫瘤放射治療增敏劑中 黃連素濃度小于等于5 μ mol/L。
4.根據權利要求3所述腫瘤放射治療增敏藥物，其特征在于，腫瘤放射治療增敏劑中 黃連素濃度為2 μ mol/L 5 μ mol/L。
全文摘要
本發明公開了一種腫瘤放射治療增敏藥物，所述腫瘤放射治療增敏藥物活性成分為黃連素。研究發現(1)黃連素處理乳腺癌細胞可以誘導劑量依賴性的G0/G1期細胞阻滯和細胞凋亡。(2)黃連素明顯降低了細胞周期調節相關蛋白cyclin B和抗細胞凋亡蛋白Bcl-2的表達水平，而增加了凋亡蛋白Bax和caspase-3的表達水平。(3)黃連素處理后的乳腺癌細胞明顯提高了細胞對放射治療的敏感性。本發明所述腫瘤放射治療增敏藥物可以提高腫瘤放射治療的治療效果，降低腫瘤病人的放射治療的照射劑量，降低放射治療所帶來的毒副作用，從而提高病人的生存質量。
文檔編號A61K31/4375GK101816653SQ201010158998
公開日2010年9月1日 申請日期2010年4月29日 優先權日2010年4月29日
發明者樊賽軍 申請人:蘇州基莫夫藥物開發有限公司