專利名稱：治療藥的制作方法
技術領域：
本發明涉及利用巨噬細胞的吞噬能力、實現功能異常巨噬細胞的正常化、或對各 種的感染性病原體有效的治療藥。本發明的治療藥(藥物或制劑)是根據治療上和/或診 斷上的目的所賦予的一切物質及這些物質的集合體為對象、其制劑是藥物(有時含藥物載 體)與藥物載體的合劑。
背景技術：
I.巨噬細胞首先，對在本發明的治療藥的作用中發揮主要功能的巨噬細胞進行簡述。對巨噬細胞的形態、功能，例如高橋潔等著“維持生命的巨噬細胞”(文光堂，2001 年)中已有詳細，但有關本發明的背景描述如下。所謂巨噬細胞是構成單核吞噬細胞體系 (MPS =Mononuclear PhagocyteSystem)的細胞。血中的單核細胞(monocyte)來自骨髓細 胞中的造血干細胞，在骨髓中分裂、分化流到血中，固定在各種的組織上向以各種名稱命名 的單核細胞(monocytic cell)分化。該細胞在結合組織中稱組織細胞，在肝臟中稱肝竇星 形細胞(Kupper cell)，在肺中稱肺胞巨噬細胞，在淋巴節/脾臟中稱巨噬細胞，在體腔中 稱胸腔/腹腔巨噬細胞，在骨骼中稱破骨細胞，在皮膚中稱蘭格漢斯細胞，在神經組織中稱 微膠細胞，在腦中稱小膠質細胞細胞，在滑膜中稱A型細胞，具有組織獨特的性質。1. 一般特性(1)是直徑約15 20 μ m的單核細胞，富含細胞質，易粘在玻璃或塑料表面上，利 用偽足運動、具有強的異物吞噬作用。(2)擔當防御生物的細胞。(3)具有排除異物功能和免疫功能。(4)對T淋巴球提示抗原信息建立免疫。(5)被干擾素活化形成細胞性免疫的效應物(effector)。(6)比淋巴球耐X射線。2.巨噬細胞的生理性意義(1)吞噬功能作為巨噬細胞的功能，最熟知的是吞噬作用。這種功能可視為生命誕生、生命進化 時自單細胞的時代所具備的最基本的功能之一。因此，巨噬細胞的特征之一，是巨噬細胞的 存在具有種橫斷(species-transversely)的普遍性。該特征估計提供研究巨噬細胞功能 為對象的一大優點。即，假如是進行哺乳動物的疾病為對象的治療藥的開發研究時，哺乳動 物以外的巨噬細胞也可以功能性地作為研究材料使用。這方面，取決于巨噬細胞是系統發 育所保存的細胞。
(2)防御生物功能作為巨噬細胞的功能，次重要的是防御生物作用。這種作用稱作非特異性防生物作用，近年的研究在逐漸搞清巨噬細胞的防生物作用也有特異性。原來非特異性的叫法是 對T細胞賦予特征的抗原特異性或與免疫記憶相對應的叫法，由于現在還沒證明嚴格意義 上的抗原特異性或免疫記憶存在于巨噬細胞中，所以巨噬細胞的防生物作用稱非特異性并 不錯。然而，例如根據病原體的種類，似乎巨噬細胞的應答呈現質的不同，而且該質的不同 的應答的一部分，呈現與識別巨噬細胞表面病原體的受體的不同相對應的狀態，如果從細 胞應答對異物(或環境)的刺激角度考慮，則也可以說巨噬細胞的作用是特異性。現在，根據上述觀點，一般在不斷地對巨噬細胞為中心的防生物作用尋找先天免 疫系統(The innate immune system)，對T細胞為中心的防生物作用尋找獲得免疫系統 (The acqnired immune system)。此外，如果考慮巨筮細胞的系統發生的普遍性，雖然理所 當然，但先天免疫系統也還是系統發生的高度被保存的防生物系統。(3)先天免疫系統巨噬細胞為中心的先天免疫系統當然在不具有獲得免疫系統的生物種，即使是具 有獲得免疫系統的生物種，也發揮稱之為異物識別、排除系統的防生物系統的主要作用。既 使是具有獲得免疫系統的生物，病原體等的異物的識別、排除在大部分的情況下也由先天 免疫系統的功能維持，但這種功能不充分的情況則動員獲得免疫系統。這種情況，特異性異 物識別也必須由巨噬細胞等的抗原提示，排除外來異物時，發揮排除系統主要作用的還是 巨噬細胞等的構成先天免疫系統的細胞。(4)排除異物另外，內因性的異物(例如，除去病毒感染細胞)等，雖然獲得免疫是利用特征性 的細胞傷害性T細胞排除，但該細胞傷害性T細胞的增殖與成熟兩方，都必須是接受巨噬細 胞等的抗原提示的另外的T細胞。即，獲得免疫為了發揮充分的功能，則先天免疫系統以完 全且按照目的起作用為前提。(5)功能不全因此，巨噬細胞的吞噬或抗原提示等的功能不全，毫無疑問地變成免疫缺陷的潛 在性的原因。具體地來講，首先，作為與1.1 (巨噬細胞的一般特性)中所述的諸點有關的 功能不全與疾病已知以下所述的幾點。即1)作為吞噬異物作用異常的吞噬功能異常癥，已知白血球粘接缺乏癥、謝迪亞 克-東綜合癥等。任何一種情況吞噬功能均有異常，后者時，由于溶酶體酶向吞噬空腔的輸 送有異常，故殺菌能力降低，吞噬能力明顯地亢進。2)作為防生物功能異常的疾病，可列舉慢性粘膜皮膚念珠菌病。患這種病患者的 巨噬細胞移遷能力降低，念珠菌的殺菌能力也降低。3)作為排除異物功能和免疫能力異常的疾病，可列舉維-奧綜合癥(免疫力降 低)。患者呈現巨噬細胞活動異常、抗體依賴性細胞傷害作用缺乏等復雜的免疫異常。4)作為抗原信息提示功能異常，已知不論T細胞，B細胞正常還是重病引起免疫缺 陷的主要組織適合(MHC)類別II抗原缺乏病。5)作為被干擾來活化、有關細胞性免疫效應基因問題的功能異常，已知缺干擾素 受體的幼兒成為不能防結核菌感染的結核菌感染致死的干擾素受體缺乏癥。
此外，缺乏獲得免疫細胞的哺乳動物雖然存在且可生存，但缺乏巨噬細胞，動物不 能存在。而且，識別、排除異物為中心的防生物系統，在不斷探明總稱為進行細胞間的信息 傳遞的細胞因子的生理活動物質起重要的作用。巨噬細胞進行產生分泌的細胞因子的種類 極富有多樣性。因此，就識別、排除異物來看，對個體的動態平衡性維持也必須有巨噬細胞 的功能。(6)解剖學的特征 巨噬細胞解剖學的特征依具有固定在各種組織上固有性格的組織獨特的巨噬細 胞而不同。這也可由作為個體與環境接點的粘膜組織看出在呼吸器官、消化器官、泌尿生 殖器官的粘膜下層分別存在獨特的巨噬細胞。這些組織獨特的巨噬細胞進行與組織獨特的 內外環境的生物應答。這顯示巨噬細胞對超越異物的識別、排除而對生體動態平衡性的維 持起重要的作用。組織獨特的巨噬細胞生理上的意義大多是未知的問題。而從新的觀點評 價組織獨特的巨噬細胞的存在意義時，當然在與各種病態的關系上會引人注目。(7)與病態的關系因為，如果根據巨噬細胞與處于免疫系統重要位置的生理上的意義，則組織獨特 的巨噬細胞的功能異常是極大地顯示關系到誘發組織特性的病態的緣故。事實上，作為炎 癥性腸疾病之一的克朗氏病(Crohn' s disease)，還有很多類風濕病等的自身免疫疾病、 骨質疏松癥等的高令性疾病等難治性疾病，往往以某些形式伴有巨噬細胞的功能異常。與 結核菌等的分枝桿菌的慢性感染、或分枝桿菌本身的問題不同，肺胞巨噬細胞的功能異常 估計在于病態的背景。因此，開發治療藥以增大作為標的細胞的巨噬細胞的吞噬能力，結果 增大巨噬細胞內治療藥的濃度，在提供包括現在沒有有效治療法的結核等感染病的難治性 疾病的新型治療法方面，可以稱之為是極重要的且有合理性的課題。II.巨噬細胞的功能異常與疾病(1)作為感染性病原體的巨噬細胞據世界衛生組織(WHO)調查，結核、艾滋病、瘧疾等是世界性規模且最應該重視的 慢性難治性感染性。據說，例如每年發生800萬以上的人患結核病，死亡300萬人。對這些 疾病開發有效的治療藥(藥物/制劑)是當急的課題，其社會意義極大。然而，有關病原體感染的預防、除去，在人體內起最主要作用的細胞之一是巨噬細 胞。實際上，巨噬細胞分布在生物體內的臟器、器官等的所有部位上。這些巨噬細胞其形態、 功能根據所存在的臟器、器官而不同，但在發揮預防和除去病原體感染方面是共同的。另外，感染性病原體在進化的過程中，獲得回避巨噬細胞攻擊的種種手段。此外， 感染性病原體中，有很多潛伏在巨噬細胞中，宿主巨噬細胞的病原體。這樣寄生在巨噬細胞 中成功的病原體，當然成為慢性的且反復引起感染癥的原因，導致致命的結果也不少。艮口， 這種情況，本應當預防、除去病原體感染的巨噬細胞轉變成為起感染性病原體媒體作用的 細胞。(2)巨噬細胞內的病原體在結核中可以發現其典型例。即，雖然病原體(結核分支桿菌、或牛分支桿菌)被 作為初期感染途徑的肺胞巨噬細胞吞噬，但仍穩定地存在于此時形成的吞噬體中。即，病原 體本來應被消化的這些吞噬細胞可作為“掩蔽所”生存。此外，以往作為原因菌的麻風分支 桿菌、作為非定型分枝桿菌癥原因菌的鳥分支桿菌、或作為衣原體癥原因菌的肺炎衣原體、沙眼衣原體、或鸚武熱衣原體等尚未確立根治療法，但發現擔心漫延的難治性感染疾病的 許多原因菌、或在巨噬細胞成為感染病原體媒體方面有共同性。現在，對預防結核菌、艾滋病毒等傾注于極大的精力。然而，一旦出現了感染并不 存在有效的治療法。姑且，即使對感染病原體存在直接具有殺菌作用的化合物，但一般通過 簡單地給與適用的治療藥，對殺滅特定的病原體(本發明中的殺滅意味著殺死消滅病原體 的全部或一部)要在保持病原體巨噬細胞內達到足夠的濃度當然不容易。

發明內容
因此，通過給與有效的治療藥，即使可以殺滅細胞外的病原體，但作為病原體媒體 的巨噬細胞依然作為病原體供給源存在，仍在繼續供給病原體。對現在寄生在巨噬細胞內 的病原體的沒有完全根治療法的理由可在如上所述的方面而知。本發明把這種問題作為課 題，反之，如果可以殺滅作為病原體媒體的病原體感染巨噬細胞、或殺滅病原體感染巨噬細 胞內的病原體，則可以從根本上治療上述許多的慢性難治性感染癥。因此，本發明的目的在 于提供根據巨噬細胞的功能異常、或以巨噬細胞為媒體對所患疾病的治療藥。本發明者們潛心進行研究的結果，把殺滅作為病原體媒體的病原體感染巨噬細 胞、殺滅病原體感染巨噬細胞內的病原體、或對因疾病功能異常的巨噬細胞發生作用為目 的，形成了全新的構想，從而完成了本發明。本發明的治療藥，其特征在于使巨噬細胞的吞噬能力增強，殺滅巨噬細胞內的病 原體。另外，本發明的治療藥，其特征在于使巨噬細胞的吞噬能力增強，誘導保持病原體 的巨噬細胞至細胞死亡。此外，本發明的治療藥，其特征在于使巨噬細胞的吞噬能力增強，對處于功能異常 狀態的巨噬細胞發生作用。另外，期望本發明的治療藥是用于分枝桿菌癥、艾滋病、衣原體癥或弓漿蟲病任何 一種的藥。因此，可以有效地治療由巨噬細胞保持病原體造成的疾病。此外，期望本發明的治療藥是用于克朗氏病、類風濕病、癌或免疫缺陷綜合癥的 藥。因此，可以有效地治療巨噬細胞處于功能異常狀態造成的疾病。艾滋病被包括在免疫 缺陷綜合癥中。另外，期望前述巨噬細胞是存在粘膜組織中的細胞。因此，可以有效地治療在呼吸 器、消化器或生殖器等的引起病原體初感染的部位的疾病。此外，期望前述巨噬細胞是存在腹腔、大網膜、乳色斑、肺胞、肺間質、肺臟、門靜脈 區域、脾臟、骨髓、胸腺、消化管、腭扁桃體、腎上腺、腦垂體、甲狀腺間質、胰島、副甲狀腺、松 果體、睪丸、卵巢、輸卵管、子宮、胎盤、皮膚、髓膜、腦質、脈絡叢的任何一個部位的細胞，或 者，期望前述巨噬細胞是小膠質細胞、小膠質細胞的前體細胞、小膠質細胞細胞、小膠質細 胞細胞的前體細胞、前述存在巨噬細胞的前體細胞、存在巨噬細胞類緣細胞、或存在巨噬細 胞類緣細胞的前體細胞。因此，可以有效地治療在體內種種的臟器或組織中產生的疾病。此外，本發明的治療藥，其特征在于含有PLGA(聚(乳酸/乙醇酸)共聚物)，是用 于結核的藥。另外，還期望含有利福平。因此，可提供殺滅結核菌的治療藥。
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此外，期望含分子量1500 150000的PLGA。因此，可以提供被巨噬細胞吞噬且生 物降解性的微粒子制劑。另外，期望含分子量1500 75000的PLGA。因此，可提供被巨噬細胞吞噬且在巨 噬細胞內易放出藥物的微粒子制劑。此外，還期望再含有PVA (聚乙烯醇)、PEG (聚乙二醇)、PE0 (聚環氧乙烷)、糖、蛋 白質、肽、磷脂質或膽甾醇的至少一種。因此，可提供對應于巨噬細胞的種類而被急劇吞噬 的微粒子制劑。還有，還提供再含有PVA、PEG、PE0、糖、蛋白質、肽、磷脂質或膽留醇的至少一種，其 主要的粒徑為1 6i!m的微粒子制劑。因此，有效利用巨噬細胞的吞噬功能可有效地進行 巨噬細胞內。還有，優選通過吞噬使巨噬細胞的吞噬能力增強。還有，優選是含有分子量5000 20000的PLGA、針對結核的治療藥。還有，優選是通過膜乳化法制備的治療藥。本說明書也包含作為本申請優先權基礎的特愿2002-247871的說明書和/或附圖 所述的內容。


圖1是對比說明本發明與以往的治療藥的巨噬細胞內藥劑濃度的圖。圖2是表示本發明實施方案的微粒子制劑的粒徑分布的圖。圖3是對比說明利福平采用本發明給與和以往所用的溶液給予進入NR8383細胞 的量為何種程度不同的圖。圖4是說明RFP-PLGA微粒子的利福平保持能力因PLGA微粒子的組成不同所放出 的利福平量不同的圖(其1)。實驗值包括誤差5%。圖5是說明RFP-PLGA微粒子的利福平保持能力因PLGA微粒子的組成不同所放出 的利福平量不同的圖(其2)。實驗值包括誤差5%。圖6是說明吞噬結核菌的巨噬細胞通過吞噬RFP-PLGA微粒子可殺滅巨噬細胞內 結核菌的圖。生存率按5個等級進行評價、1 以下、2 5 25%、3 25 50%、4 50 75%、5:75%以上。再者，給與的利福平單獨給與(圖中用RFP表示)時為100 y g/mL，利 用RFP-PLGA給與(圖中用RFP-PLGA表示)時為5 y g/mL(估算值)。圖7是通過使用脂多糖使肺胞巨噬細胞NR8383的吞噬能活化，利用與佐藤肺癌 細胞的共培養增強對處于功能異常狀態的NR8383的佐藤肺癌細胞影響的細胞毒性效果的 圖。(□)表示沒有進行脂多糖處理的NR8383對佐藤肺癌的細胞傷害效果、(■)表示脂 多糖(1 u g/mL)處理的NR8383對佐藤肺癌細胞的細胞傷害性效果(共培養4小時)。再 者，細胞傷害效果(％)由培養液中放出的乳酸脫氫酶量算出，進行評價。
具體實施例方式以下，邊參照附圖邊對本發明的適用實施方案詳細地進行說明。但本發明其技術 范圍不受這些實施方案限制。全面地具備巨噬細胞，而且巨噬細胞的一種特異機能可例舉吞噬作用。吞噬作用是使尺寸大約1 P m左右以上的固體物積極地進入巨噬細胞內的功能。然而，如果積極地吞噬人工制的固體物，則可能在巨噬細胞內以通常不能達到的 濃度使固體物積累。這樣的固體物雖然一般可制成粒子提供但要使之積極吞噬，必須將有 利于吞噬的粒徑、粒子的表面特性(應當帶有電荷、應當具有一定的柔軟結構等)等最優 化。例如，聚乳酸酯與聚乙二醇混合的材料作為基材可以制備被巨噬細胞容易吞噬的粒子。此外，如果混合作用于感染病原體或病原體感染巨噬細胞的藥物制備的粒子，則 隨著粒子的吞噬，藥物也積極地進入巨噬細胞內。本發明的根本在于積極地利用巨噬細胞具有的吞噬功能，治療巨噬細胞功能異常 相關的疾病(1.2的(5)、(7)、II. (1)、分枝桿菌癥、艾滋病、衣原體病、弓漿蟲病或癌等)。此 外通過制備使對這些病有效的藥物含有巨噬細胞可吞噬的微粒子(藥物載體)中的制劑， 期望達到上述目的。通常，作為藥物載體與藥劑的合劑的制劑，當然回避基于巨噬細胞的吞噬用的設 計很必要。然而本發明基于與以往完全不同的構想，在積極地利用巨噬細胞的吞噬活性方 面具有新穎性。如前述巨噬細胞防御生物的一種功能是具有吞噬作用。吞噬作用是巨噬細胞特征 性地識別的固有的功能，可以卷入巨噬細胞以外的細胞所不能卷入的大尺寸的粒子。細菌 等的病原微生物被巨噬細胞吞噬在巨噬細胞內被分解。因此巨噬細胞的吞噬功能的生物學 上的意義之一是對病原微生物給予傷害。但巨噬細胞因吞噬被活化，有時可能發生抗病原 微生物。這是作為吞噬導致巨噬細胞活化所熟知的現象，因此，就連癌細胞，巨噬細胞也可 進行傷害。所以，利用吞噬將巨噬細胞活化，如果能增強吞噬活性，則可以更有力地殺滅病 原微生物。被巨噬細胞吞噬的粒子，估計需要具備以下的性質(可吞噬性)。艮口，o粒徑為1 6 ii m，把這樣的粒子稱微粒子。o粒子表面使用巨噬細胞培養液(生物體內巨噬細胞周邊的體液)潤濕，但不應 立即溶解而作為一定時間粒子存在。o粒子在20 45°C的溫度范圍內是固體。o粒子的比重比巨噬細胞培養液(生物體內巨噬細胞周邊的體液)的比重大。o粒子在表面具有可滲透水或離子的表面層。另外，如果考慮向生物體內給與粒子，則粒子表面必須具有生物體適合性高的高 分子層，至到進入巨噬細胞內一直保持粒子的形態，另外進入巨噬細胞后，或沒進入的情況 也必須在生物體內分解代謝變成對生物體無毒的成分(生物體內分解性)。作為滿足以上的2個條件、可容易地成型加工成粒子的高分子，聚(乳酸/乙醇 酸)共聚物(以下稱“PLGA”)或聚乳酸(以下稱“PL”)成為候補對象。PL疏水性比PLGA 高，分解需要的時間長。另外，PLGA分解速度依賴于單體的比例進行變化。分子量大的PLGA 分解需要的時間長。PLGA的分子量在1000以下時，在20 45°C的范圍有成為液體存在的 可能性。因此，在20 45°C的溫度范圍內成為固體存在的PLGA的分子量優選1，500以上。此外，PLGA粒子中含有的藥物從粒子內的放出，在分子量20000左右PLGA的情況 大致以0次放出藥物。即，放出量往往保持一定。然而，觀察到從分子量44000及75000左右的PLGA粒子中不是0次放出，一定時間后變成脈沖型放出藥物。而且，觀測脈沖型的藥 物放出的時間，使用分子量大的PLGA制劑時慢。即，從PLGA粒子中放出藥物的方式依賴于 PLGA的分子量。此外，與藥物放出相關的PLGA的分解速度，不僅隨著PLGA的分子量增加而 變慢，而且由于預測巨噬細胞內等生物體內的分解速度比試管內快，因此估計如果是分子 量到150000的范圍可有效地在生物體內使用。從以上的觀點看出，由分子量1500 150000、乳酸與乙醇酸的摩爾比50 50 75 25的PLGA制的粒徑1 6 y m的微粒子制劑(容許范圍)、由分子量5000 75000、 乳酸與乙醇酸的摩爾比50 50 75 25的PLGA制的粒徑1 6 y m的微粒子制劑(適 用的范圍)容易被巨噬細胞吞噬，而且，估計對在巨噬細胞內從內包藥物的微粒子制劑中 邊保持一定的持續性邊放出藥物的目的最適用。提供可特異性地殺滅保持感染癥病原體的巨噬細胞的新型治療藥積極地利用保持以結核菌為首的種種感染性病原體的巨噬細胞的特異性的吞噬 活性，下述的治療藥對殺滅巨噬細胞內的病原體或保持病原體的巨噬細胞本身有效果。(1)使巨噬細胞吞噬能力增強的治療藥(2)對巨噬細胞內的感染病原體有直接殺滅效果的治療藥(3)對巨噬細胞作用的治療藥(1)的治療藥優選對感染病原體保持/非保持的巨噬細胞選擇性地有可吞噬的性 質。以前，熟知存在使巨噬細胞的吞噬能力活化的物質(公知事項)。然而，完全沒有開發 積極利用這種性質作用于巨噬細胞內病原體的治療藥物的嘗試(新型事項)。(2)、(3)的 類型不僅直接作用于病原體的各種藥物成為對象，而且具有改變病原體保持/非保持巨噬 細胞生理功能作用的DNA或RNA等遺傳基因本身也可作藥物使用。以前完全沒有開發(1)、 (2)、(3)組合的對除去感染性病原體的有效的治療藥的探索，本發明的治療藥是針對感染 性病原體的治療有效的新型的治療藥(新型事項)。例如，Antimicrobial Agents and Chemotherapy 1998 年第 42 卷第 10 號 PP. 2682-2689中，公開了 PLGA中含有利福平的粒子的抗結核作用。然而，該論文中完全沒 有敘述有關利用PLGA粒子使吞噬能力增強。此外，含有利福平的PLGA粒子，由于作為抗結 核藥的藥效并沒有比單獨的利福平提高，所以明確可知具有與本發明的粒子不同的性狀。 此外，如圖4及圖5所示，PLGA的分子量對控制利福平的放出很重要。但上述論文中沒有 記載制備PLGA時使用的PLGA的分子量。由于可能使用具有與本發明的粒子不同分子量的 PLGA,因此推測不會達到具有作為抗結核藥的功能。制備有抗結核藥活性的PLGA粒子時， 必須正確地使用有關PLGA的分子量、單體比及制得粒子的直徑，必須評價利用吞噬細胞吞 噬的粒子的進入和巨噬細胞內的抗結核活性。綜述上述的各點，則上述論文中所述的PLGA 粒子，并沒有記載PLGA的單體比、粒子的直徑處于本發明中的“適用范圍”等，有關涉及材 料確認一定的通用性的PLGA粒子的正確的性狀，也沒有抗結核藥作用。因此，是不可能成 為否定本發明的新穎性、進步性的引用文獻的論文。此外，PharmaceuticalResearch2000 年第 17 卷第 8 號 pp. 955-961 中公開了使 用分子量82500的PLGA制的含利福平粒子的制備方法，但該粒子的制備方法與本發明不 同。PharmaceuticalResearch 2001 年第 18 卷第 9 號 pp. 1315-1319 中公開了使用分子量 82500的PLGA的含利福平PLGA粒子的結核菌殺滅效果。觀察該效果，含利福平PLGA粒子的抗結核活性也沒到達到試管內利福平單獨的效果，動物實驗也不能說有明顯的治療效 果。為了含利福平PLGA粒子呈現抗結核作用，粒子必須具有適度的分解性與高的利福平內 包率。然而，上述論文中沒有進行有關控制這種活性的性狀的研究，僅調查了抗結核活性。 眾知由于分子量大的PLGA粒子其分解性與內包率降低，故估計使用82500這種高分子量的 PLGA是不呈現抗結核作用的原因。如上所述以往雖然進行了與本發明公開的內容相類似的 研究，但迄今還沒有進行如本發明想到利用巨噬細胞的吞噬活性，且通過實現活化，謀求殺 滅細胞內寄生病原體的探索。另外，雖然制備了含利福平PLGA，但沒有進行有關可達到本 發明的目的的制備方法或材料特性的適用的研究。只略微地在Pharmaceutical Research 2001年第18卷第10號pp. 1405-1410中有假想含利福平PLGA粒子進入巨噬細胞中的記 載。然而，該情況并不是積極地使含利福平PLGA粒子進入巨噬細胞，或制備打算活化的制 劑，實際上也沒有研究含利福平PLGA粒子的吞噬率等。即，試管內使用該論文所述的含利 福平PLGA粒子的利福平在巨噬細胞內濃度僅微量地停留在0. 45 u g/106細胞中。使用本 發明的含利福平PLGA微粒子的情況不僅使吞噬活化，而且使利福平在巨噬細胞內的濃度 達到6 y g/106細胞，達到13倍以上。以上說明想對巨噬細胞誘導吞噬殺滅巨噬細胞內的 病原微生物，只單一地使微粒子含藥劑則難達到目的。而且迄今的任何論文也沒有報道使 用作為結核菌的標的細胞的肺胞巨噬細胞研究含利福平PLGA粒子殺滅細胞內結核菌。如 參照前述的“維持生命的巨噬細胞”所知，巨噬細胞不能把使用組織特異性高、存在于血中 的巨噬細胞得到的結果直接地對組織特異性巨噬細胞，例如，肺胞巨噬細胞作為可能適用 的結果是眾所周知的事實。即，本發明的新穎性不用說概念的新穎性，而且作為支持該概念 的實施例，可列舉使用肺胞巨噬細胞，而且誘導該細胞的吞噬活性，又實際上在肺胞巨噬細 胞內保持高的藥物濃度，且制造提供該制劑實際上殺滅肺胞巨噬細胞內結核菌比單一利福 平明顯優異的含利福平PLGA粒子。另外，眾知通過使巨噬細胞吞噬粒子，由巨噬細胞增強非特異性的抗菌物質，例如 過氧化S、氧自由基的產生。例如 European Journalof Pharmaceutical Sciences 2000 年第15卷pp. 197 207中公開了通過使巨噬細胞吞噬PLGA粒子，由性格與血中單核細胞 類似的培養巨噬細胞增強過氧化氫的產生。然而，沒有記載巨噬細胞通過吞噬PLGA增強吞 噬活性。此外，由于巨噬細胞的活化極富多樣性，所以利用吞噬增強過氧化氫的產生，不能 立即直接地與吞噬增強相連系。實際的感染癥治療時，使(1)型的治療藥含有(2)或(3)型的治療藥的制劑有效 果。即，為了(2)、(3)型的治療藥在巨噬細胞內有效地發揮作用，(1)的治療藥使巨噬細胞 的吞噬能力增強，發揮將(2)、(3)型的治療藥運搬到巨噬細胞內的作用。即，本發明為對象 的治療藥如圖1所示，容易被巨噬細胞吞噬，巨噬細胞內治療藥物的濃度比只單一地給與 治療藥的情況高。即，與右邊以往進入存在于藥液中的巨噬細胞的藥劑相比，左邊本發明封 入藥劑的微粒子積極地進入巨噬細胞內使巨噬細胞內的藥劑濃度升高。因此，權利要求書 中所述的所謂“使巨噬細胞的吞噬能力增強”，意味著巨噬細胞內的治療藥的濃度比單一地 給與治療藥的情況高。具體的適用例結核作為本發明所公開的有關治療藥有效性的一個例子，對結核加以描述。結核菌由 于飛散通過呼吸道進入肺胞中，被肺胞巨噬細胞吞噬。通常被吞噬的病原體，處于在細胞內由于蛋白質分解酶的攻擊而被分解命運。然而，結核菌回避蛋白質分解酶的攻擊，在巨噬細 胞內進行生存。該巨噬細胞內的結核菌移動到巨噬細胞外，繼續地向宿主體內供給結核菌。 作為現在抗結核菌藥劑，使用雷米封、利福平、硫酸鏈霉素、乙胺丁醇等的藥物。任何一種藥 物對巨噬細胞外的結核菌均有效，但對肺胞巨噬細胞內的結核菌沒有效果。這可以得出主 要原因是對殺滅肺胞巨噬細胞內的結核菌不能獲得足夠的藥物濃度。因此，利用肺胞巨噬細胞的吞噬作用要在肺胞巨噬細胞內殺滅結核菌，如果得到 足夠的藥物濃度，也可以殺滅肺胞巨噬細胞內的結核菌。此時吞噬作用變成選擇性地使巨 噬細胞內的藥物濃度升高而得到利用。A.增強巨噬細胞吞噬能力的治療藥以PLGA為例，說明增強巨噬細胞吞噬能力的治療藥的制法及其效果。I.利用PLGA微粒子制劑增強巨噬細胞的吞噬能力(本項中PLGA微粒子本身就是 藥效成分)1. PLGA微粒子制劑制備方法(a)材料(1) PLGA (聚(乳酸/乙醇酸)共聚物)摩爾比為75 25、分子量20000 (和光純 藥公司PLGA-7520)(2) PVA (聚乙烯醇)聚合度500(b) PLGA微粒子制劑的制備(1)把 PLGA 500mg 溶解于二氯甲烷 1. 5mL 中。(2)使 PVC 溶解于水成為 0.3% (w/v)。(3)把(2)的PVA水溶液8mL加到(1)的溶液中攪拌3分鐘形成水包油型(o/w 型)乳液。(4)把(3)加到(2)的PVA水溶液200mL中，在520轉/分鐘的條件下，室溫攪拌 3小時。(5)采用離心分離(3000轉/分鐘，15分鐘)，使微粒子制劑沉降、分離，再加2次 蒸餾水10mL，經離心分離進行洗滌。(6)在干燥器內減壓干燥一晝夜。(7)把制得的微粒子制劑的粒徑分布示于圖2。由圖2清楚地看出制得的微粒子 制劑在直徑約2 ym有峰、在1 10 ym之間具有分布。該粒子在常溫下是固體。由制備使 用的PLGA(500mg)與回收的制劑的總重量計算出收率為約90%。(8)其他的例把其他制得的PLGA微粒子(分子量及組成)的性狀歸納如下。l.PLGA-5005(PLGA 分子量 5000，乳酸 / 乙醇酸 50 50)2. PLGA-5010(PLGA 分子量 10000，乳酸 / 乙醇酸 50 50)3. PLGA-5020(PLGA 分子量 20000，乳酸 / 乙醇酸 50 50)4. PLGA-7505 (PLGA 分子量 5000，乳酸 / 乙醇酸 75 25)5. PLGA-7510(PLGA 分子量 10000，乳酸 / 乙醇酸 75 25)PLGA微粒子制劑制備方法，除了 PLGA的種類以外，其他與1. (b) (1) (6)相同。制得的微粒子制劑的平均粒徑使用任何一種PLGA的情況均約為2 u m。由制劑使用的PLGA(500mg)與回收的制劑的總重量計算的收率約為90%。2.通過吞噬PLGA微粒子制劑的肺胞巨噬細胞的吞噬增強效果(1)在培養基(Ham F_12K、15%牛胎兒血清)中把肺胞巨噬細胞(NR8383細胞) 制成1 X 106個/mL,加到24孔板中，然后添加PLGA-7520微粒子制劑0. 04,0. 4、4 y g，在三 氧化碳氣體培養器(37°C )中進行培養。(2)培養1小時后，除去培養液，添加含0. 25%胰蛋白酶/磷酸緩沖液的生理食鹽 水(以下稱PBS)0. lmL在室溫下放置5分鐘后，除去培養上清液，進行洗滌。(3)然后，加0. lmL的培養基與80%硅石蝕態懸浮液(percoll) (Pharmacia公司 制)0. lmL混合制備40% Percoll溶液，在1. 5mL的樣品管中重層成加有該溶液的70% Percoll 0. lmL，進行離心分離(8000轉/分鐘，10分鐘).(4)離心分離后回收界面上存在的細胞，用PBS對細胞洗滌后添加培養基 lmL，添加用粒徑2.0iU的熒光素硫代異氰酸酯(FITC)標記的聚苯乙烯膠乳粒子 (FITC-PSLP)IXIO7個，進行培養1小時。使用熒光性的FITC進行標記是為了容易進行定量。(5)培養后進行離心分離(700轉/分鐘，5分鐘)，向沉降層的巨噬細胞中加入PBS lmL，反復進行2次離心操作。(6)除去PBS后，向細胞中添加10%甲醛水/PBS 0. lmL,固定5分鐘后，加蒸餾水 lmL，除去上清液，再加蒸飽水lmL，除去上清液。除去上清液后，加0. lmL的蒸餾水使細胞懸 浮，取該懸浮液0. 02mL，擴展在玻璃片上使之干燥。(8)在熒光顯微鏡下進行多視野攝影，測定每100個細胞中有卷入了 FITC-PSLP的 NR8383細胞的數。(8)巨噬細胞的FITC-PSLP吞噬量因使用PLGA微粒子制劑的變化如表1所示。低 量添加PLGA微粒子制劑時對巨噬細胞吞噬能力的效果不顯著，而添加0. 4 ( y g/mL)使吞噬 能力活化的效果特別明顯。表1PLGA微粒子制劑對吞噬細胞吞噬能力的增強作用 II.利用脂多糖增強巨噬細胞吞噬能力1.脂多糖制備方法(a)材料(1)革蘭氏陰性菌pantoea屬成團泛菌(b)脂多糖的制備
(1)在7L的肉汁培養基(胰胨10g/L，酵母提取物5g/L、NaC110g/L、葡萄糖lg/L、 PH7. 5)中加入成團泛菌，在35°C振動培養1夜，收集約70g的濕菌體。(2)把約70g的菌體懸浮在500mL的蒸餾水中，添加500mL的90%熱苯酚，在65 70°C攪拌20分鐘、冷卻、回收水層。將回收的水層透析1夜除去苯酚，使用分子量20萬分 離膜在2個大氣壓的氮氣下對透析內液進行超濾濃縮。(3)將得到的粗脂多糖冷凍干燥物溶解在蒸餾水中，裝入陰離子交換層析 (Pharmacia 公司制，Q-Sepharose Fast Flow)中，使用含 10mM 三 _HC1 (pH 7. 5)及 10mM 的NaCl的緩沖液將試料溶液通入色譜柱，使用200 400mM NaCl/10mM三-HC1 (pH7. 5)使 Limulus活性級分洗出。在與前述相同條件下對該洗出液進行超濾，脫鹽及濃縮、冷凍干燥， 可以由約70g的濕菌體得到約300g的精制脂多糖。2.肺胞巨噬細胞利用脂多糖的吞噬增強效果(1)在培養基(Ham F_12k、15 %牛胎兒血清)中制備肺胞巨噬細胞 (NR8383) 1 X 106個/mL，加到24孔板中，然后添加脂多糖使之成為1 P g/mL,使用二氧化碳 氣體培養器(37°C )進行培養。(2)培養1小時后，把細胞移到1.5mL的樣品管中，采用離心分離(2000轉/分鐘， 5分鐘)除去培養液，添加0. 25%胰蛋白酶/PBS0. OlmL在室溫下放置5分鐘后，進行離心 分離(2000轉/分鐘，5分鐘)除去培養上清液，使用PBS進行洗滌。(3)然后，加入0. lmL的培養基與60% Percoll 0. lmL混合制備30% Percoll溶 液，進行離心分離(8000轉/分鐘，10分鐘)。(4)離心分離后，回收液表面上存在的細胞，使用PBS將細胞洗2次后，添加培養基 lmL,添加粒徑2. 0 ii m的FITC-PSLP 1 X 107個，培養1小時。(5)培養后，除去上清液，添加0. 25%胰蛋白酶/PBS 0. lmL在室溫下放置5分鐘 后，添加培養基lmL，進行離心分離(700轉/分鐘，5分鐘)。(6)向沉降層的巨噬細胞中加入PBS lmL進行離心分離(700轉/分鐘，5分鐘)， 除去上清液，再添加PBS lmL后，進行離心分離(700轉/分鐘，5分鐘)除去上清液。(7)除去上清液后，向細胞中添加10%甲醛水/PBS 0. lmL,固定5分鐘后，加蒸餾 水lmL，除去上清液，再加蒸餾水lmL，除去上清液。(8)除去上清液后，加0. lmL的蒸餾水使細胞懸浮，取該懸浮液0. 02mL，擴展在玻 璃片上，使之干燥。(9)在熒光顯微鏡下進行多視野攝影，測定每500個細胞中卷入了 FITC-PSLP的 NR8383細胞的數。(10)利用脂多糖的巨噬細胞的FITC-PSLP吞噬量的增加如表2所示。由表2看出 由于脂多糖，巨噬細胞的吞噬能力被活化。表2利用脂多糖的巨噬細胞吞噬能力的活化 B.作用于巨噬細胞內病原體的治療藥利福平(抗結核菌藥)利用吞噬RFP-PLGA微粒子制劑向巨噬細胞內的有效遷移1.內包利福平的PLGA微粒子制劑的制備(a)材料(l)PLGA(聚(乳酸/乙醇酸)共聚物)摩爾比為75 25或50 50，分子量 5000、10000 或 20000，和光純藥公司PLGA-5005、5010、5020、7505、7510、7520。(2)利福平(3) PVA (聚乙烯醇)聚合度500(b) RFP-PLGA微粒子制劑的制備(1)將 PLGA 500mg 與利福平(0、50、100、200mg)溶解于二氯甲烷 1. 5mL 中。(2)把PVA溶解于水使之成為0. 3 % (w/v)。(3)向(1)的溶液中加入(2)的PVA水溶液8mL攪拌3分鐘形成o/w型乳液。(4)向⑵的PVA水溶液200mL中加入(3)，在520轉/分鐘的條件下，室溫攪拌 3小時。(5)采用離心分離(3000轉/分鐘，15分鐘)使微粒子制劑沉降分離，再加蒸餾水 10mL 2次，經離心分離進行洗滌。(6)在干燥器內減壓和干燥1晝夜。(7)把制得的RFP-PLGA粒子(分子量及組成)歸納如下。1. RFP-PLGA 5005 (PLGA 分子量 5000，乳酸 / 乙醇酸 50 50)2. RFP-PLGA 5010 (PLGA 分子量 10000，乳酸 / 乙醇酸 50 50)3. RFP-PLGA 5020 (PLGA 分子量 20000，乳酸 / 乙醇酸 50 50)4. RFP-PLGA 7505 (PLGA 分子量 5000，乳酸 / 乙醇酸 75 25)5. RFP-PLGA 7510 (PLGA 分子量 10000，乳酸 / 乙醇酸 75 25)6. RFP-PLGA 7520 (PLGA 分子量 20000，乳酸 / 乙醇酸 75 25)制得的微粒子制劑的粒度分布與性狀完全與單一 PLGA微粒子制劑(A. I. 1. (b) (7))相同。(8)把500mg的PLGA中含有利福平0、50、100、200mg的微粒子制劑4mg溶解于二 氯甲烷lmL中后，使用分光光度計測定475nm的吸光度。(9)把RFP-PLGA微粒子制劑(PLGA分子量20000，乳酸/乙醇酸75 25制的微 粒子PLGA-7520)中的回收利福平量示于表3。由該結果明顯地看出利福平被高效地制劑 化。表3RFP-PLGA微粒子制劑的內包利福平量
14 2.其他的RFP-PLGA微粒子制劑的制備方法(膜乳化法公知)使用膜乳化法制備RFP-PLGA微粒子制劑膜乳化法是對兩種不互混的液體的一方(分散相)進行加壓，借助多孔玻璃膜 (SPG膜)分散在另一方液體(連續相)中的乳化方法，采用這種方法可以制得具有均勻粒 徑的乳液。(a)材料(l)PLGA(聚(乳酸/乙醇酸)共聚物)摩爾比為75 25、分子量10000，和光純 藥公司PLGA 7510(2)利福平(3) PVC (聚乙烯醇)聚合度500(b) RFP-PLGA微粒子制劑的制備(1)把PLGA 500mg與利福平lOOmg溶解于二氯甲烷10mL中。(2)把PVA溶解于水中使之成為0. 3% (w/v)。(3)借助SPG膜(伊勢化學工業、細孔徑0.49 ym)把⑴的溶液分散在⑵的PVA 水溶液10mL中，形成水包油型(o/w型)。(4)向⑵的PVA水溶液200mL中加入(3)，采用520轉/分鐘，在室溫下攪拌3 小時。(5)采用離心分離(3000轉/分鐘，15分鐘)，使微粒子制劑沉降進行分離，再加蒸 餾水10mL 2次，采用離心分離進行洗滌。(6)在干燥器內減壓干燥1晝夜。(7)制得的微粒子制劑的平均粒徑是1.98 ym。由制劑使用的PLGA(500mg)與回 收的制劑的總重量計算的PLGA的收率是約90%。而，利福平的收率是約75%。該粒子在 常溫是固體。3.采用膜乳化法的其他例把采用膜化法制備的RFP-PLGA 7510微粒子制劑以外的RFP-PLGA微粒子(分子 量及組成)歸納如下。1. RFP-PLGA 5005 (PLGA 分子量 5000，乳酸 / 乙醇酸 50 50)2. RFP-PLGA 5010 (PLGA 分子量 10000，乳酸 / 乙醇酸 50 50)3. RFP-PLGA 5020 (PLGA 分子量 20000，乳酸 / 乙醇酸 50 50)4. RFP-PLGA 7505 (PLGA 分子量 5000，乳酸 / 乙醇酸 75 25)5. RFP-PLGA 7520 (PLGA 分子量 20000，乳酸 / 乙醇酸 75 25)
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這些的RFP-PLGA微粒子制劑的制備方法，除了 PLGA的種類以外，其他與上述的膜 乳化法相同。制得的微粒子制劑的平均粒徑，PLGA 5005為2. 20 y m、PLGA 5010為2. 66 y m、 PLGA 5020 為 2. 29 ii m、PLGA 7505 為 2. 00 ii m、PLGA 7520 為 1. 85 ii m。由制備使用的 PLGA(500mg)與回收的制劑的總重量計算的PLGA的收率均是約90%。另外，利福平的收率， PLGA 5005 為約 87%、PLGA 5010 為約 78%、PLGA 5020 為約 67%、PLGA 7505 為約 91%、 PLGA7520 為約 58%。4.從RFP-PLGA微粒子放出利福平(1)把采用膜乳化法制得的各RFP-PLGA微粒子50mg分散在保持于37°C (溫度) 的pH 7. 4磷酸緩沖液(離子強度0. 154M) 5mL中。(2)經時地離心分離收集上清液，向殘留的微粒子中加入pH7. 4磷酸緩沖液(離子 強度 0. 154M) 5mL 中。(3)測定在上清液中溶出的利福平濃度。測定使用分光光度計在475nm的波長下 進行測定。(4)把從各RFP-PLGA微粒子中向上清液中放出的利福平的比例示于圖4及圖5。 由本實驗數據顯示出利福平從PLGA分子量為5000及10000的PLGA 5005、PLGA 5010和 PLGA 7505,PLGA 7510中放出的速度快。由這些結果顯示出PLGA的組成其分子量為5000 10000、乳酸與乙醇酸的比為50 50或75 25借助了巨噬細胞吞噬的藥劑的遷移優異。5.通過吞噬RFP-PLGA微粒子制劑(PLGA 7520)細胞內利福平濃度的選擇性增加(1)把制得的RFP-PLGA微粒子制劑再分散到PBS中，進行離心分離(400轉/分 鐘，5分鐘)除去大的粒子，把制成顯微鏡觀察為約1 3i!m尺寸的微粒子制劑(重量約 30% )用于以下的實驗。(2)把在培養基中培養成5X105個/0.9mL的NR8383細胞加到24孔板上，然后添 加各RFP-PLGA微粒子制劑0. 12mg/0. lmL，進行培養12小時。(3)培養后，除去培養液，添加0. 25%胰蛋白酶/PBS 0. lmL在室溫放置5小時后， 除去培養上清洗，進行洗滌。(4)然后，加0. lmL的培養基與80%percoll 0. lmL混合成40% percoll，把該溶 液與加到1.5mL樣品管中的70%perColl 0. lmL進行重層，進行離心分離(8000轉/分鐘， 10分鐘)。(5)離心分離后，回收界面上存在的細胞，使用PBS洗滌細胞后，使用二氯甲烷抽 提進入細胞中的利福平。(6)用475nm的吸光度確定利福平的量。(7)作為對照，制備含于各RFP-PLGA微粒子制劑0. 12mg中的同量的利福平的二甲 亞砜(DMS0)溶液。把該溶液加到加有lmL培養基的24孔板上，然后添加NR8383細胞。(8)培養細胞12小時后，回收細胞(5X105個)，使用二氯甲烷抽提細胞中的利福平。(9)把利福平被巨噬細胞卷入的量示于圖3。利福平的添加量在40(ii g/5X105個 /孔/mL)時，與過去的含利福平的培養基相比，本實施例的RFP-PLGA微粒子制劑的情況顯 示出卷入了約19倍的利福平。
C.增強巨噬細胞的吞噬能力作用于巨噬細胞內的病原體的藥物(A+B)通過吞噬RFP-PLGA微粒子制劑的巨噬細胞的吞噬能力增強效果1. RFP-PLGA微粒子制劑的制備(a)材料(l)PLGA(聚(乳酸/乙酸酸)共聚物)摩爾比為75 25或50 50，分子量 5000、10000 或 20000，和光純藥公司PLGA-5005、5010、5020、7505、7510、7520。(2)利福平(3) PVA (聚乙烯醇)聚合度500(b) RFP-PLGA微粒子制劑的制備(1)把PLGA 500mg與利福平lOOmg溶解于二氯甲烷1. 5mL中。(2)把PVC溶解于水使之成為0. 3 % (w/v)。(3)把(2)的PVA水溶液8mL加到(1)的溶液中攪拌3分鐘形成o/w型乳液。(4)把(3)加到(2)的PVA水溶液200mL中，采用520轉/分鐘，在室溫下攪拌3 小時。(5)采用離心分離(3000轉/分鐘，15分鐘)使微粒子制劑沉降分離，再加蒸餾水 10mL 2次，采用離心分離進行洗滌。(6)在干燥器內減壓干燥一晝夜。(7)制得的微粒子制劑的粒度分布及性狀與單一 PLGA的微粒子制劑(A. I. 1. (a) (7))相同。(8)使微粒制劑分散在PBS中，采用離心分離(400轉/分狀，5分鐘)除去大的微 粒子制劑，把調整到用顯微鏡觀察約1 3 ym尺寸的微粒子制劑用于以后的實驗。2.利用吞噬RFP-PLGA微粒子(PLGA-7520)巨噬細胞增強吞噬活性(1)在培養基(Ham F-12K，15 %牛胎兒血清)中制備肺胞巨噬細胞 (NR8383) 1 X 106個/mL,加到24孔板上，然后添加PLGA微粒子制劑0. 012、0. 12、1. 2 y g，在 二氧化碳氣體培養器(37°C )中進行培養。(2)培養1小時后，把細胞移到1. 5mL的樣品管中，除去培養液，添加0. 25%胰蛋 白酶/PBS 0. lmL在室溫下放置5分鐘，除去培養上清液，進行洗滌。(3)然后加0. lmL的培養基和90% per coll 0. lmL使percoll濃度成為45%后， 進行離心分離(8000轉/分鐘，10分鐘)。(4)離心分離后，回收液表面的細胞，用PBS將該細胞洗2次后，添加與(1)所用相 同的培養基lmL，添加粒徑2. 0 ii m的FITC-PSLP 1 X 107個，進行1小時培養。(5)培養后，除去上清液，添加0. 25%胰蛋白酶/PBS 0. lmL在室溫放置5分鐘后， 添加培養基lmL，進行離心分離(700轉/分鐘，5分鐘)。(6)向沉降層的巨噬細胞中加入PBS進行離心分離(700轉/分鐘，5分鐘)，除去 上清液，再添加PBS lmL后，進行離心分離(700轉/分鐘，5分鐘)除去上清液。(7)除去上清液后，向細胞中添加10%甲醛水/PBS 0. lmL,固定5分鐘后，加蒸餾 水lmL，離心分離(700轉/分鐘，5分鐘)，除去上清液。然后，加0. lmL的蒸餾水使細胞懸 浮，取該懸浮液0. 02mL，擴展在玻璃氣上，使之干燥。(8)在熒光顯微鏡下進行多視野攝影，測定每500個細胞中卷入FITC-PSLP的巨噬
1細胞(NR8383細胞)的數。(9)巨噬細胞通過吞噬RFP-PLGA微粒子制劑的FITC-PSLP吞噬量的增加如表4所 示。表明巨噬細胞的吞噬能力被RFP-PLGA微粒子制劑活化。表4吞噬RFP-PLGA微粒子制劑的NR8383細胞的FITC-PSLP吞噬增強作用 由以上的結果表明，(l)PLGA微粒子制劑及脂多糖使巨噬細胞的吞噬能力活化。 另外，表明(2)利福平向巨噬細胞內遷移由于包含在PLGA微粒子制劑中格外增大。還表明 (3)即使利福平被含在PLGA微粒子制劑內，巨噬細胞吞噬能力也被活化。因此，含利福平 PLGA微粒子制劑，活化了巨噬細胞的吞噬能力，結果利福平在巨噬細胞內濃度增大，可以達 到對保持在巨噬細胞內的病原體有效地作用的本發明的目的。上述的結果是表示利用作為 本發明基本概念的“使巨噬細胞的吞噬能力增強”的構想，使作用于巨噬細胞內病原體的治 療藥有效地進入巨噬細胞內的新型治療藥的一個實例。3.吞噬RFP-PLGA微粒子制劑的巨噬細胞內結核菌殺滅效果(a)巨噬細胞內結核菌(BCG)的生存率測定法(1)用生理食鹽水溶解干燥BCG疫苗(12mg/mL)進行攪拌后，把KRD培養基(3 4mL)移到T-25培養燒瓶中加入BCG懸浮液40 u L，在干式溫育箱37°C下進行培養。(2)實驗是按1 4的比例把菌液與玻璃球珠加到樣品管中，使用旋渦攪拌機攪拌 1分鐘后，再采用超聲波洗滌機的5分鐘超聲波處理進行菌體的分散。(3)把1 X 106個/ml濃度的NR8383加到6孔板上(總體積5mL)。把結核菌(BCG) 按每個細胞10個(multiplicity of infection (MOI) = 10)添加到細胞培養液中。(4)在37°C，二氧化碳氣體培養器中使感染4小時后，進行離心分離2，000轉/分 鐘，5分鐘(SCT 15B)后，除去上清液。使用無血清培養基同樣地重復2次離心分離，除去細 胞外的菌。(5)把濃度1 X 106個/mL的NR8383種到24孔板上。(6)把各RFP-PLGA微粒子按每1個細胞10個的比例添加到NR8383的培養液中。(7)在37°C，二氧化碳氣體培養器中使吞噬4小時后，使用0. 25%胰蛋白酶除去細 胞外的粒子。(8)加 80% Percoll 制備 40% Percoll 細胞液，再加 70% Percoll 形成密度梯 度。進行10000轉/分鐘，5分鐘(S0RVALL Biofuge fresco)離心分離后，回收40%、70% Percoll間界面的細胞，分離細胞和RFP-PLGA。
(9)使用PBS同樣地重復2次離心分離除去Percoll。(10)使用氟二乙酸酯熒光素(FDA/Fluorescein diacetate)/乙啡啶硼化物 (Ethidium bromide, EB)染色法測定活菌與死菌的比率。FDA按5mg/mL的濃度溶解于丙酮 中，使用時將20 y L用lmL的PBS進行稀釋。EB按20 y g/mL的濃度溶解于PBS中，使用時 將50 y L用lmL PBS稀釋使用。染色是將FDA與ED等量混合使用。把該混合液1 P L加到 玻璃片上，在其上面再放1 P L菌液，放在室溫下2分鐘用熒光顯微鏡進行觀察。活菌利用 菌產生的酯酶活性分解FDA，發出綠色的熒光。而死菌由于沒有酯酶活性，故不出現FDA的 染色，被EB染色發出橙色的熒光。(b)利用吞噬進入巨噬細胞內的RFP-PLGA微粒子制劑殺滅結核菌的效果(1)為了研究巨噬細胞內RFP-PLGA微粒子殺滅結核菌的效果，把RFP-PLGA微粒子 給與預先吞噬結核菌的巨噬細胞(感染結核菌巨噬細胞)，使巨噬細胞吞噬該微粒子。(2)把研究吞噬移到巨噬細胞內的RFP-PLGA對巨噬細胞內結核菌呈現什么樣 的殺滅效果的結果示于圖6。即使是含利福平約為單獨利福平(100 y g/mL)的1/20的 RFP-PLGA微粒子給與量(M0I = 10，估計利福平是5 yg/mL，故微粒子制劑中的利福平相當 于單獨給與利福平時的1/20量)，利福平在巨噬細胞內濃度有意義地增高。RFP-PLGA微粒 子對感染結核菌肺胞巨噬細胞的給與，與單獨給與的利福平相比，以20倍以上的效率殺滅 細胞內的結核菌。即通過給予借助吞噬粒子的藥劑，無論是藥劑本身的抗結核作用，也都得 到20倍以上治療系數的提高。提供使巨噬細胞的吞噬能力增強對處于功能異常狀態的巨噬細胞發生作用的治 療藥眾知的是癌組織中通常多數的巨噬細胞進行浸潤。這因為癌細胞對生物體來講是 異物，基于排除癌細胞的目的，巨噬細胞發生積累。巨噬細胞功能正常時，傷害消滅癌細胞， 而巨噬細胞功能異常時不能傷害癌細胞，癌細胞成長以至形成腫塊。然而如前所述，通過巨 噬細胞的活化也可以對癌細胞給予傷害。因此，通過使巨噬細胞的吞噬能力增強，使功能異 常的巨噬細胞獲得傷害癌細胞作用，可以有效地治療癌。另外，如表2所示肺胞巨噬細胞的作用通過脂多糖(lyg/mL)的處理也增強 166%，肺胞巨噬細胞被脂多糖活化。而且，估計利用脂多糖活化吞噬能力的肺胞巨噬細胞 對肺癌細胞呈現細胞傷害作用。在此，例示脂多糖活化肺胞巨噬細胞傷害肺癌細胞作用的 例。具體的適用例肺癌列舉活化肺胞巨噬細胞的傷害肺癌細胞的效果作為適用例。1.脂多糖活化肺胞巨噬細胞及肺胞巨噬細胞與佐藤肺癌細胞的共同培養(1)把NR8383按1 X 106個/ml的濃度加到24孔板上(總體積1. 5mL)。進行控 制，加5%牛胎兒血清、F-12K培養基159 u LUOu g/mL脂多糖150 u L。(2)在37°C，二氧化碳氣體培養器中放置24小時。(3)把佐藤肺癌細胞調制成1 X 105個/mL的濃度，加到96孔板上，每孔加50 u L。(4)把(1)項處理殿8383調制成5\105、1\105、5\104、1\104個/11^的濃度，加 到96孔板上50 ii L (總體積100 ii L)。(5)在37°C，二氧化碳氣體培養器中放置4小時。
2.對與佐藤肺癌細胞共同培養的巨噬細胞對肺癌細胞的傷害作用(1)為了由從細胞內向培養液中放出的乳酸脫氫酶量評價上述1所述的被脂多糖 活化，與佐藤肺癌細胞共同培養的巨噬細胞對癌細胞的傷害效果，采用1000轉/分鐘離心 分離5分鐘后，分取上清液50 i! L加到另外的96孔板上。(2)接著力口入付屬于試劑盒(Cyto Tox 96Non-RadioativeCytotoxicity Assay, Promega, cat. G1780)的基質溶液50 y L測定乳酸脫氫酶量。再者，作為陽性控制，使用付 屬于試劑盒的乳酸脫氫酶酯稀釋液(5000倍稀釋液50 y L)。(3)使用鋁箔遮光、室溫放置30分鐘。(4)加停止液50 U L，使反應停止。(5)使用微量反應板讀數器(Model 550,BI0-RAD公司)測定495nm下的吸光度。(6)由各吸光度算出細胞毒性(％ )。(7)把NR8383對佐藤肺癌細胞的毒性效果示于圖7。與沒有進行脂多糖處理的NR8383相比，脂多糖處理的NR8383吞噬亢進，結果對佐藤肺癌的 細胞傷害效果顯示出依賴于細胞比增大。提供使巨噬細胞的吞噬能力增強、誘導保持病原體的巨噬細胞至細胞死亡的治療 藥本實施方案的治療藥，其特征在于通過使巨噬細胞的吞噬能力增強、誘導保持病 原體的巨噬細胞至細胞死亡。如表2所示，熟知作為巨噬細胞活化劑的脂多糖使巨噬細胞的吞噬能力增強。另 外，作為巨噬細胞活化因子的代表性細胞因子的干擾素、也使吞食能力增強。即，巨噬細 胞吞噬活性的增強是巨噬細胞活化的指標之一。本件所示的利用吞噬使吞噬能力增強，可 以說所有的吞噬刺激誘導所有的稱為吞噬增強的巨噬細胞的活化。另外，還知道隨著巨噬 細胞利用脂多糖或干擾素、活化，而誘發巨噬細胞的膜結構變化，在巨噬細胞內誘導膜結 合型腫瘤壞死因子(TNF)。因此，隨著利用吞噬這種刺激活化巨噬細胞而變成誘導膜結合型 TNF。艾滋病受艾滋病毒感染，破壞了 T細胞，由于免疫應答缺陷而發病。然而，艾滋病 毒感染不僅是對T細胞感染，而且也對巨噬細胞感染。這種感染由于艾滋病毒吸附在共同 出現在T細胞、巨噬細胞膜上的CD4蛋白質上而開始，感染艾滋病毒的巨噬細胞不陷于細胞 死亡而繼續地產生了艾滋病毒，如II. (2)中所述的成為感染病毒媒體。因此，如果可以誘導感染艾滋病毒的巨噬細胞至細胞死亡，則實現消滅感染病原 體媒體。作為可實現這種可能性的一個例子，列舉膜結合型TNF對感染艾滋病毒(HIV)的 巨噬細胞作用，可特異性地誘導該細胞至細胞死亡。具體的適用例利用呈現膜結合型TNF 細胞誘導HIV感染細胞死亡作TNF對感染病原體的細胞誘導細胞死亡的實施例，列舉TNF對HIV感染M0LT-4 細胞的作用。1.呈現膜結合型TNF細胞的制備(1)為了穩定地呈現膜結合型TNF按照已經發表的論文(Journalof Virology 1889年，第63卷，pp. 2504-2509)制備老鼠及人呈現膜結合型TNF質體(pMT 2 3 G/Hu-proTNF)。(2)然后，按10 1的比例把該質體與轉換株選擇用酯合耐新霉素遺傳基因的質 體混合，導入老鼠胎兒產生的纖維芽細胞(NIH3T3細胞)中。(3)把上述進行轉化操作的NIH 3T3細胞，在作為標示物的新霉毒800 u g/mL的存 在下，在37 °C，二氧化碳氣體培養器內培養約2個星期。(4)培養后，取得結合在細胞內的TNF的克隆。(5)得到的克隆，采用酶免疫測定法確認呈現膜結合型TNF。2.感染HIV的MOLT 4細胞的制備(1)感染HIV細胞，在37°C，二氧化碳氣體培養器內，在培養基(添加RPM 11640， 10%牛胎兒血清及青霉素(100U/mL)、鏈霉素(100 ii g/mL)中，使用感染HIV細胞(HTLV-III B 株)，按照已發表論文(Journal of Virology 1889 年，第 63 卷，pp. 2504-2509)使 M0LT4 感染。如果對M0LT4細胞感染艾滋病毒成立，則M0LT4細胞顯示出持續地繼續產生艾滋病 毒的特征。因此，產生艾滋病毒的話，M0LT4細胞則是感染艾滋病毒巨噬細胞的模型。(2)在這種感染條件下，感染HIV的M0LT4細胞的90%以上對HIV抗體成陽性。(3)因此，借助HIV感染細胞，將HIV導入M0LT4細胞的全部中，制得HIV感染 M0LT4細胞。3.利用呈現膜結合型TNF細胞誘導感染HIV細胞至細胞死亡(1)在24孔培養板上培養導入TNF質體的NIH3T3細胞使之大致成板一面。(2)然后，加一定量的HIV感染M0LT4細胞在37°C，二氧化碳氣體培養器內混合培 養3天。(3)為了研究所發現的膜結合型TNF對感染HIV細胞的作用，采用錐蟲藍色素排除 法測定感染HIV細胞的生存率。(4)結果，利用HIV感染M0LT 4細胞的40%與呈現膜結合型TNF細胞的混合培養 確認細胞死亡。由以上的例子清楚地說明膜結合型TNF對感染艾滋病毒(HIV)的細胞，特異性地 誘導細胞死亡。由此可以看出，保持病原體功能異常的巨噬細胞，通過吞噬病原體而活化， 結果誘導的膜結合型TNF誘導感染病原體的細胞至細胞死亡。巨噬細胞帶有病原體形成的疾病有分枝桿菌病、艾滋病、衣原體病、或弓漿蟲病 等，分枝桿菌病有結核分支桿菌或牛分支桿菌為原因菌的結核，麻風分支桿菌為原因菌的 7 ^或鳥分支桿菌等為原因菌的非定型分枝桿菌病，作為衣原體病的原因菌有肺炎、沙 眼衣原體或鸚武熱衣原體，任何一種均可有效地使用本發明。然而，本實施方案所示的 RFP-PLGA微粒子殺滅巨噬細胞內結核菌的效果，必須至少通過2次細胞內小胞膜結構，即 由誘發吞噬進入吞噬體內的RFP-PLGA微粒子中游離出利福平，透過吞噬體膜，再透過含結 核菌吞噬體的吞噬體膜才能實現。上述所示的原因菌在巨噬細胞內的保命戰略多種多樣。 分枝桿菌病、軍團病、弓漿蟲病通過原因菌在吞噬體內保命而在巨噬細胞內進行生存。李斯 特桿菌、衣原體病具有原因菌從吞噬體中脫出的特征。與原因菌在吞噬體內存在的情況相 比，從藥劑到達的觀點來看，如果藥劑一度透過巨噬體膜可期待藥效，故估計這些原因菌的 細胞內生存形態更容易。另外，艾滋病如果藥劑到達存在于細胞內的原因菌中則在可期待 藥效方面與李斯特桿菌等同樣。由以上看出本發明對上述所述的原因菌也是有希望的治
以下，列舉對各種疾病可有效地使用本發明的藥品。1)分枝桿菌病利福平、雷米封、乙胺丁醇、吡嗪酰胺、抗衣原體藥、卡那霉素、硫 酸鏈霉素、恩維霉素、乙硫異煙胺、環絲氨酸、左氧氟沙星、氨苯砜。2)艾滋病疊氮胸腺嘧啶、二去氧肌苷。3)衣原體病二甲胺四環素鹽酸鹽、多西環素鹽酸鹽、克拉霉素、司氟沙星、羅紅
霉素、左氧氟沙星。4)弓漿蟲病乙胺嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、乙酰螺旋霉素。5)瘧疾磷酸氯喹、硫酸奎寧、磺胺多辛、甲氟喹。6)癌5_氟尿嘧啶、阿霉素、順鉬、依托泊甙、絲裂霉素、長春新堿、紫杉酚、喜樹 堿、長春堿、環磷酰胺、鹽酸平陽霉素。7)克朗氏病抑氮磺胺吡啶、糖皮質激素。8)類類風濕病硫代蘋果酸金鈉、青霉胺、布西拉明、糖皮質激素。本說明書引用的一切刊物、專利及專利申請寫入說明書中直接作為參考。產業上利用的可能性根據本發明可提供可有效地治療因巨噬細胞功能異常，或巨噬細胞為媒體所患疾 病的治療藥。
權利要求
治療藥，其特征在于是含分子量5000～20000的聚(乳酸/乙醇酸)共聚物，且主要的粒徑為1～6μm的微粒子制劑，該微粒子制劑被巨噬細胞吞噬，使巨噬細胞的吞噬能力增強，殺滅存在于巨噬細胞內的結核病原體的全部或一部分。
2.權利要求1所述的治療藥，其特征在于還含利福平。
3.權利要求1或2所述的治療藥，其特征在于是通過膜乳化法制備的。
全文摘要
本發明目的是提供針對功能異常的巨噬細胞，或巨噬細胞為媒體所患疾病的治療藥，其特征在于是含分子量5000～20000的聚(乳酸/乙醇酸)共聚物，且主要的粒徑為1～6μm的微粒子制劑，該微粒子制劑被巨噬細胞吞噬，使巨噬細胞的吞噬能力增強，殺滅存在于巨噬細胞內的結核病原體的全部或一部分。
文檔編號A61K47/34GK101862456SQ201010168148
公開日2010年10月20日 申請日期2003年8月27日 優先權日2002年8月27日
發明者寺田弘, 杣源一郎, 牧野公子 申請人:寺田弘