專利名稱：利用轉座子構建病毒活載體重組疫苗的方法
技術領域：
本發明涉及一種構建犬2型腺病毒和皰疹病毒I型活載體重組疫苗的新方法，尤 其是公開一種利用轉座子構建病毒活載體重組疫苗的方法，屬于疫苗制備技術領域。
背景技術：
目前，用于遺傳性疾病基因治療和重組活載體疫苗構建的載體系統有十余種，其 中DNA病毒載體在疫苗研究中最為常用，主要有腺病毒、皰疹病毒、痘病毒和桿狀病毒等。重組DNA病毒的構建策略過去主要基于同源重組原理，包括①細胞內同源重組， 即在兩段基因組DNA分子之間進行重組。一旦發生同源重組，即可得到預期的重組病毒，無 需純化，但是，重組效率較低。②位點特異性同源重組，即發生在兩條DNA鏈特異位點上的 重組，重組的發生需一段同源序列即特異性位點(又稱附著點)和位點特異性的蛋白因子 即重組酶參與催化。重組酶只能催化特異性位點間的重組，不能催化其它任何兩條同源或 非同源序列之間的重組。③細菌內同源重組，即在大腸桿菌內通過同源重組的方法構建重 組病毒質粒載體，經酶切線性化后再轉染病毒包裝細胞系，從而得到重組病毒。與哺乳動物 細胞比較，在大腸桿菌內進行挑克隆、鑒定等操作更加便利，但是，由于在大腸桿菌中病毒 序列的遺傳選擇壓力較小，發生突變導致病毒活力下降的可能性高于細胞內重組。④酶切 連接，即在病毒質粒中通過連接反應插入一個表達盒，而不是進行同源重組。其優點是質 粒的構建和擴增快速，轉染效率高。不足之處在于在大腸桿菌中病毒序列的遺傳選擇壓力 較小，發生突變導致病毒活力下降的可能性要高于真核細胞內重組；單一酶切位點比較稀 少，且稀有內切酶的價格昂貴。目前，已報道的狂犬病-犬2型腺病毒活載體重組疫苗(扈榮良等，prevention ofrabies virus infection in dogs by a recombinant canine adenovirus type-2encodingthe rabies virus glycoprotein. Microbes and Infection,2006 ；8 (4) 1090-1097)釆用的是細菌內同源重組和酶切連接方式獲得重組病毒；狂犬病-皰疹病毒I 型^舌^^體重組疫苗(/S榮良等，a recombinant pseudorabies virus expressing rabies virusglycoprotein :safety and immunogenicity in dogs.Vaccine. 2008 ；26 (10) 1314-21)采用的是細胞內同源重組技術。以上重組病毒的構建方法與本發明涉及的轉座機 制相比，存在重組效率低或易發生突變的缺點。轉座子(Transposon)又稱跳躍因子，是不必借助于同源片段，在轉座酶 (Transposase)的介導下便可在質粒之間或質粒與基因組之間轉移位置的DNA片段。因為 具有隨機重組的特性，轉座子已廣泛應用于新基因的發現和功能研究，以及培育轉基因動物等。

發明內容
本發明公開一種利用轉座子構建病毒活載體重組疫苗的方法，具有高效、廉價和 穩定的優點。
本發明的采用以下技術解決方案將平行表達報告基因(如綠色熒光蛋白基因)和保護性抗原基因(如狂犬病病 毒糖蛋白基因、豬瘟E2基因)的表達盒通過常規的分子克隆手段插入帶有轉座子序列的穿 梭載體(如PM0D-2<MCS>)，該插入位點的兩側為轉座子序列；然后，利用限制性內切酶將 帶有基因表達盒的轉座子從穿梭載體游離，并經瓊脂糖凝膠電泳純化；再利用轉座酶反應 體系處理(37°C，2小時)純化的轉座子和載體病毒的全基因組，反應結束后加入終止液，并 經70°C滅活10分鐘；最后，利用脂質體等真核細胞轉染試劑將反應物轉染載體病毒的包裝 細胞，獲得表達外源基因的重組病毒；經蝕斑克隆或有限稀釋法純化后，即可作為重組疫苗 免疫動物。本發明利用轉座子構建病毒活載體重組疫苗的方法，其特征在于在轉座酶的作 用下，使攜帶外源基因表達盒的轉座子與載體病毒的全基因組發生重組，然后將重組產物 轉染病毒的包裝細胞，獲得表達外源基因的重組病毒，經常純化后制成重組疫苗。所述的方法，其特征在于利用轉座子和轉座酶介導的DNA重組機制，構建犬2型 腺病毒和皰疹病毒I型活載體重組疫苗。所述的方法，其特征在于利用綠色熒光蛋白報告基因和狂犬病病毒糖蛋白保護 性抗原基因、豬瘟病毒E2保護性抗原基因，在轉座子和轉座酶的介導作用下，將平行表達 報告基因和保護性抗原基因的表達盒插入載體病毒的全基因組，并在細胞中獲得表達。所述的方法，其特征在于利用犬2型腺病毒和皰疹病毒I型DNA病毒，在轉座子 和轉座酶的介導作用下，對其基因組進行改造，并獲得表達外源基因的重組病毒。所述的方法，其特征在于利用犬2型腺病毒和皰疹病毒的包裝細胞MDCK和 Vero，將轉座子與載體病毒全基因組的重組產物轉染細胞，包裝出重組病毒。本發明的具體構建犬2型腺病毒和皰疹病毒I型活載體重組疫苗的方法，包括以 下步驟1.基因表達盒的構建利用商品化的真核表達質粒載體pIRESneo，通過常規的分子克隆技術構建平行表 達報告基因(如綠色熒光蛋白基因)和保護性抗原基因(如狂犬病病毒糖蛋白基因、豬 瘟E2基因)的表達盒。2.重組轉座子的構建通過常規的酶切、連接和轉化技術，將表達盒克隆至帶有轉座子序列的商品化穿 梭載體pM0D-2<MCS>，插入位點為兩段轉座子序列之間的多克隆酶切位點(圖1)。3.轉座酶介導的轉座反應根據轉座子穿梭載體的使用說明書，將重組轉座子經酶切游離(圖1)和瓊脂糖凝 膠電泳純化后，與載體病毒全基因組等量加入轉座酶反應體系，37°C反應2小時，反應結束 后加入終止液，70°C 10分鐘滅活轉座酶活性。4.重組病毒的包裝將轉座子與載體病毒全基因組的反應物，在轉染試劑(脂質體等)的介導下，轉染 載體病毒的包裝細胞，包裝重組病毒。5.重組病毒的純化與鑒定利用蝕斑克隆或有限稀釋法對重組病毒進行亞克隆3 5次，獲得純化的重組病毒。利用針對外源基因的免疫學方法(抗原或抗體檢測)或Southern雜交對重組病毒進 行鑒定。


圖1為EPICENTRE Biotechnologies公司的轉座子質粒載體；圖2為CL0NTECH公司的真核表達質粒載體。
具體實施方案下面結合實施例，對本發明做進一步描述。其作用被理解為是對本發明的闡釋而 非對本發明的任何形式的限制。實施例1 狂犬病-重組犬2型腺病毒的制備方法1.綠色熒光蛋白和狂犬病糖蛋白基因表達盒的構建利用商品化的真核表達質粒載體pIRESne0(圖2)的多克隆酶切位點EcoRV和 BamHI插入狂犬病病毒糖蛋白基因(序列參照GenBank :M31046)，利用Sma I和Xbal位點 插入綠色熒光蛋白報告基因(序列參照通用質粒pEGPF-Cl)，構建平行表達糖蛋白和綠色 熒光蛋白基因的表達盒。2.重組轉座子的構建通過Nru I和Bstll07 I位點將基因表達盒完整切下，利用T4連接酶插入穿梭載 體pM0D-2<MCS>中兩轉座子序列之間的Sma I位點(圖1)，轉化大腸桿菌DH5 a，獲得攜帶 表達盒的重組轉座子。3.轉座酶介導的轉座反應根據商品化轉座子穿梭載體的使用說明書，將重組轉座子經Pvu II酶切游離(圖 1)和瓊脂糖凝膠純化后，與犬2型腺病毒全基因組等量加入轉座酶反應體系中，37°C反應2 小時，反應結束后加入1 P 1終止液，70°C 10分鐘滅活轉座酶活性。轉座酶反應體系(lOiU) 反應緩沖液，0. 2iig腺病毒基因組DNA，0. 2iig重 組轉座子DNA，5U轉座酶，滅菌四餾水補至lOiU。4.重組病毒的包裝將轉座子與犬2型腺病毒全基因組的重組產物，在脂質體2000 (Invitrogen產品) 的介導下，轉染MDCK細胞，直到出現典型葡萄串狀細胞病變。5.重組病毒的純化與鑒定利用有限稀釋法(稀釋至每個細胞孔中含1個病變灶)對重組病毒進行亞克隆 3 5次，通過熒光顯微鏡下觀察熒光和細胞病變的一致性，判定重組病毒的純化程度。將純化的重組病毒肌肉注射5條狂犬病抗體陰性成年犬(雌雄隨機)，免疫前及免 疫后14天時分別采集犬靜脈血，分離血清。利用狂犬病熒光抗體病毒中和試驗(FAVN)檢 測血清狂犬病中和抗體滴度，以中和抗體有無為標準，判定重組病毒是否表達狂犬病病毒 糖蛋白(表1)。表1重組犬腺病毒免疫試驗 以上結果表明，重組病毒在犬體內表達了糖蛋白，并能誘導抗狂犬病病毒感染的 免疫反應。實施例2 狂犬病-重組皰疹病毒I型的制備方法1.綠色熒光蛋白和狂犬病糖蛋白基因表達盒的構建利用商品化的真核表達質粒載體pIRESne0(圖2)的多克隆酶切位點EcoRV和 BamHI插入狂犬病病毒糖蛋白基因(序列參照GenBank :M31046)，利用Sma I和Xba I位點 插入綠色熒光蛋白報告基因(序列參照通用質粒pEGPF-Cl)，構建平行表達糖蛋白和綠色 熒光蛋白基因的表達盒。2.重組轉座子的構建通過Nru I和Bstll07 I位點將基因表達盒完整切下，利用T4連接酶插入穿梭載 體pM0D-2<MCS>中兩轉座子序列之間的Sma I位點(圖1)，轉化大腸桿菌DH5 a，獲得攜帶 表達盒的重組轉座子。3.轉座酶介導的轉座反應根據商品化轉座子穿梭載體的使用說明書，將重組轉座子經PvuII酶切游離(圖 1)和瓊脂糖凝膠純化后，與皰疹病毒I型全基因組等量加入轉座酶反應體系中，37°C反應2 小時，反應結束后加入1 P 1終止液，70°C 10分鐘滅活轉座酶活性。轉座酶反應體系(10 ill) 反應緩沖液，0. 2iig皰疹病毒基因組DNA，0. 2iig 重組轉座子DNA，5U轉座酶，滅菌四餾水補至lOiU。4.重組病毒的包裝將轉座子與皰疹病毒I型全基因組的重組產物，在脂質體2000 (Invitrogen產品) 的介導下，轉染Vero細胞，直到出現典型病變(細胞變圓脫落)。5.重組病毒的純化與鑒定利用有限稀釋法(稀釋至每個細胞孔中含1個病變灶)對重組病毒進行亞克隆 3 5次，通過熒光顯微鏡下觀察熒光和細胞病變的一致性，判定重組病毒的純化程度。將純化的重組病毒肌肉注射5條狂犬病抗體陰性成年犬(雌雄隨機)，免疫前及免 疫后14天時分別采集犬靜脈血，分離血清。利用狂犬病熒光抗體病毒中和試驗(FAVN)檢 測血清狂犬病中和抗體滴度，以中和抗體有無為標準，判定重組病毒是否表達狂犬病病毒 糖蛋白(表2)。表2重組皰疹病毒免疫試驗 以上結果表明，重組病毒在犬體內表達了糖蛋白，并能誘導抗狂犬病病毒感染的 免疫反應。實施例3 豬瘟-重組犬2型腺病毒的制備方法1.綠色熒光蛋白和豬瘟病毒E2蛋白基因表達盒的構建利用商品化的真核表達質粒載體pIRESne0(圖2)的多克隆酶切位點EcoRV和 BamHI插入豬瘟病毒E2蛋白基因(序列參照GenBank :AF091507)，利用Smal和Xbal位點 插入綠色熒光蛋白報告基因(序列參照通用質粒pEGPF-Cl)，構建平行表達糖蛋白和綠色 熒光蛋白基因的表達盒。2.重組轉座子的構建通過Nru I和Bstll07 I位點將基因表達盒完整切下，利用T4連接酶插入穿梭載 體pM0D-2<MCS>中兩轉座子序列之間的Sma I位點(圖1)，轉化大腸桿菌DH5 a，獲得攜帶 表達盒的重組轉座子。3.轉座酶介導的轉座反應根據商品化轉座子穿梭載體的使用說明書，將重組轉座子經Pvu II酶切游離(圖 1)和瓊脂糖凝膠純化后，與犬2型腺病毒全基因組等量加入轉座酶反應體系中，37°C反應2 小時，反應結束后加入1 P 1終止液，70°C 10分鐘滅活轉座酶活性。轉座酶反應體系(lOiU) 反應緩沖液，0. 2iig腺病毒基因組DNA，0. 2iig重 組轉座子DNA，5U轉座酶，滅菌四餾水補至lOiU。4.重組病毒的包裝將轉座子與犬2型腺病毒全基因組的重組產物，在脂質體2000 (Invitrogen產品) 的介導下，轉染MDCK細胞，直到出現典型葡萄串狀細胞病變。5.重組病毒的純化與鑒定利用有限稀釋法(稀釋至每個細胞孔中含1個病變灶)對重組病毒進行亞克隆 3 5次，通過熒光顯微鏡下觀察熒光和細胞病變的一致性，判定重組病毒的純化程度。將純化的重組病毒肌肉注射5頭豬瘟抗體陰性的試驗豬(雌雄隨機)，免疫前及免 疫后14天時分別采集犬靜脈血，分離血清。利用細胞中和試驗和直接免疫熒光法檢測血清 豬瘟病毒中和抗體滴度(以血清稀釋度1 2X表示)，以中和抗體有無為標準，判定重組病 毒是否表達E2蛋白(表3)。表3重組犬2型病毒免疫試驗 以上結果表明，重組病毒在豬體內表達了 E2蛋白，并能誘導抗豬瘟病毒感染的免 疫反應。實施例4 豬瘟-重組皰疹病毒I型的制備方法1.綠色熒光蛋白和豬瘟病毒E2蛋白基因表達盒的構建利用商品化的真核表達質粒載體pIRESne0(圖2)的多克隆酶切位點EcoRV和 BamHI插入豬瘟病毒E2蛋白基因(序列參照GenBank :AF091507)，利用Sma I和Xba I位 點插入綠色熒光蛋白報告基因(序列參照通用質粒PEGPF-C1)，構建平行表達糖蛋白和綠 色熒光蛋白基因的表達盒。2.重組轉座子的構建通過Nru I和Bstll07 I位點將基因表達盒完整切下，利用T4連接酶插入穿梭載 體pM0D-2<MCS>中兩轉座子序列之間的Sma I位點(圖1)，轉化大腸桿菌DH5 a，獲得攜帶 表達盒的重組轉座子。3.轉座酶介導的轉座反應根據商品化轉座子穿梭載體的使用說明書，將重組轉座子經Pvu II酶切游離(圖 1)和瓊脂糖凝膠純化后，與皰疹病毒I型全基因組等量加入轉座酶反應體系中，37°C反應2 小時，反應結束后加入1 P 1終止液，70°C 10分鐘滅活轉座酶活性。轉座酶反應體系(10 ill) 反應緩沖液，0. 2iig皰疹病毒基因組DNA，0. 2iig 重組轉座子DNA，5U轉座酶，滅菌四餾水補至lOiU。4.重組病毒的包裝將轉座子與皰疹病毒I型全基因組的重組產物，在脂質體2000 (Invitrogen產品) 的介導下，轉染Vero細胞，直到出現典型病變(細胞變圓脫落)。5.重組病毒的純化與鑒定利用有限稀釋法(稀釋至每個細胞孔中含1個病變灶)對重組病毒進行亞克隆 3 5次，通過熒光顯微鏡下觀察熒光和細胞病變的一致性，判定重組病毒的純化程度。將純化的重組病毒肌肉注射5頭豬瘟抗體陰性的試驗豬(雌雄隨機)，免疫前及免 疫后14天時分別采集犬靜脈血，分離血清。利用細胞中和試驗和直接免疫熒光法檢測血清 中的豬瘟病毒中和抗體滴度(以血清稀釋度1 2X表示)，以中和抗體有無為標準，判定重 組病毒是否表達E2蛋白(表4)。表4重組皰疹病毒I型免疫試驗 以上結果表明，重組病毒在豬體內表達了 E2蛋白，并能誘導抗豬瘟病毒感染的免 疫反應。
權利要求
一種利用轉座子構建病毒活載體重組疫苗的方法，其特征為在轉座酶的作用下，使攜帶外源基因表達盒的轉座子與載體病毒的全基因組發生重組，然后將重組產物轉染病毒的包裝細胞，獲得表達外源基因的重組病毒，經常純化后制成重組疫苗。
2.權利要求1所述的方法，其特征在于利用轉座子和轉座酶介導的DNA重組機制，構 建犬2型腺病毒和皰疹病毒I型活載體重組疫苗。
3.權利要求1所述的方法，其特征在于利用綠色熒光蛋白報告基因和狂犬病病毒糖 蛋白保護性抗原基因、豬瘟病毒E2保護性抗原基因，在轉座子和轉座酶的介導作用下，將 平行表達報告基因和保護性抗原基因的表達盒插入載體病毒的全基因組，并在細胞中獲得 表達。
4.權利要求1所述的方法，其特征在于利用犬2型腺病毒和皰疹病毒I型DNA病毒， 在轉座子和轉座酶的介導作用下，對其基因組進行改造，并獲得表達外源基因的重組病毒。
5.權利要求1所述的方法，其特征在于利用犬2型腺病毒和皰疹病毒的包裝細胞 MDCK和Vero，將轉座子與載體病毒全基因組的重組產物轉染細胞，包裝出重組病毒。
6.權利要求1所述的方法，包括以下步驟1)基因表達盒的構建利用真核表達質粒載體pIRESneo，通過分子克隆技術構建平行表達報告基因(如綠 色熒光蛋白基因)和保護性抗原基因(如狂犬病病毒糖蛋白基因、豬瘟E2基因)的表達.品. 2)重組轉座子的構建通過常規的酶切、連接和轉化技術，將表達盒克隆至帶有轉座子序列的商品化穿梭載 體pM0D-2<MCS>，插入位點為兩段轉座子序列之間的多克隆酶切位點；3)轉座酶介導的轉座反應根據轉座子穿梭載體的使用說明書，將重組轉座子經酶切游離和瓊脂糖凝膠電泳純化 后，與載體病毒全基因組等量加入轉座酶反應體系，37°C反應2小時，反應結束后加入終止 液，70°C 10分鐘滅活轉座酶活性；4)重組病毒的包裝將轉座子與載體病毒全基因組的反應物，在轉染試劑的介導下，轉染載體病毒的包裝 細胞，包裝重組病毒；5)重組病毒的純化與鑒定利用蝕斑克隆或有限稀釋法對重組病毒進行亞克隆3 5次，獲得純化的重組病毒；利 用針對外源基因的免疫學方法或Southern雜交對重組病毒進行鑒定。
全文摘要
本發明公開了一種利用轉座子構建病毒活載體重組疫苗的方法，以綠色熒光蛋白為報告基因、分別構建表達狂犬病病毒糖蛋白和豬瘟E2蛋白基因的表達盒，并克隆至轉座子穿梭載體，在轉座酶的介導作用下，分別與提純的犬2型腺病毒和皰疹病毒I型全基因組發生重組，再利用轉染試劑(脂質體等)將重組產物分別轉染MDCK和Vero細胞，即可獲得4株以綠色熒光蛋白為報告基因的重組病毒，即表達糖蛋白的重組犬2型腺病毒、表達E2蛋白的重組犬2型腺病毒、表達糖蛋白的重組皰疹病毒I型和表達E2蛋白的重組皰疹病毒I型。免疫試驗證明，表達E2基因的犬2型腺病毒和皰疹病毒I型活載體重組疫苗均可在豬體內誘導抗豬瘟病毒感染的免疫反應，表達糖蛋白基因的犬2型腺病毒和皰疹病毒I型活載體重組疫苗均可在犬體內誘導抗狂犬病病毒感染的免疫反應。
文檔編號A61K39/187GK101850116SQ20101020232
公開日2010年10月6日 申請日期2010年6月18日 優先權日2010年6月18日
發明者劉曄, 張守峰, 張菲, 扈榮良, 范志強 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院軍事獸醫研究所