一種新型轉基因質粒載體及其構建方法、體內含新型重組基因家蠶的培育方法
【專利摘要】本發明涉及一種新型轉基因載體及其構建、體內含有新型重組基因家蠶培育方法，這種新型轉基因家蠶具有一種重組的含MMP酶切位點的絲素重鏈蛋白基因，這項發明屬于農業昆蟲優良品種培育利用領域；新型轉基因載體構建流程圖見附圖；利用MMPs酶切位點可被MMPs酶切的特點，將MMPs酶切位點引入到家蠶絲素中，使家蠶絲素具有新的性能，達到通過生物學方法對家蠶絲素改性的目的；本專利將含有MMPs酶切位點的重組絲素蛋白基因克隆到PiggyBac轉座子載體上并將該載體通過顯微注射的方法注入家蠶蠶卵內，蠶卵經孵化后通過選擇眼睛發綠色熒光的個體確定培育成功的新型轉基因家蠶。
【專利說明】一種新型轉基因質粒載體及其構建方法、體內含新型重組 基因家蠶的培育方法

【技術領域】
[0001] 本發明屬于農業昆蟲優良品種培育利用領域，具體涉及一種新型重組基因家蠶培 育方法領域。

【背景技術】
[0002] 作為一種天然材料，蠶絲在生物醫學領域有著強勁的優勢，如生物相容性，安全 性，可降解性，良好的機械性能等。蠶絲作為醫用材料有著很多的要求，也會產生一些局限， 例如作為組織工程支架，它的降解速率要求和組織細胞的生長速率相一致，但是現有蠶絲 不能更好地被控制在合適的時間里被降解；作為藥物輸送體系，藥物作用部位對蠶絲本身 的識別性很低，如果蠶絲具有更好的導向作用將在藥物輸送過程中發揮更大的作用；當蠶 絲參與腫瘤等疾病的治療過程中，作為傳感器，快速的反應時間還需要進一步的探索研究。 目前使用的蠶絲多為天然蠶絲，而從基因水平利用轉基因技術對蠶絲蛋白進行改造，使改 造后的蠶絲蛋白具有更好的生物相容性，降解性以及特有的藥物輸送靶向性等特性將有著 很好的潛在價值。
[0003] 基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases, MMPs)是降解細胞外基質 (extra-cellular matrix, ECM)的最重要的酶系，占 ECM降解酶總活性的70%以上，MMPs的 活化被認為是ECM降解的限速環節。利用MMPs酶切位點可被MMPs酶切的特點，已有相關 技術創新出現，如黃迪南等的發明專利：基質金屬蛋白酶導向性重組人腫瘤壞死因子融合 蛋白及制備(專利申請號=2007100280375)。但目前還沒有關于將MMPs酶切位點引入重組 絲素重鏈蛋白，構建新型家蠶絲素的報導。目前對家蠶絲素改性的方法有物理方法，如將蠶 絲制成微球/納米顆粒等，但物理方法改性不能改變絲素的生物化學特性。也有化學方法， 如絲素蛋白的接枝改性等。化學方法對家蠶絲素進行加工改性，需要消耗更多的能源，甚至 造成環境污染。


【發明內容】

[0004] 本發明的目的在于培育一種新型轉基因家蠶，這種新型轉基因家蠶具有一種重組 的絲素重鏈蛋白基因，并且這種重組絲素重鏈蛋白含有MMP酶切位點，解決化學方法耗能 多，環境污染問題，物理方法不能改變絲素的生物化學特性問題
[0005] 發明技術方案：本專利將MMP酶切位點引入到重組絲素重鏈蛋白基因中，構建一 種新型家蠶轉基因質粒載體，并將這種新型載體采用顯微注射法注入到產下一定時間內的 蠶卵中，通過觀察蠶蛾眼部的熒光現象鑒定轉基因是否成功，培育一種新型轉基因家蠶，這 種新型轉基因家蠶的培育方法將成為用生物學方法改造家蠶絲素，使家蠶絲素蛋白具有 MMP酶切位點的基礎技術，達到絲素改性的目的。
[0006] 本發明第1個目的是采用基因克隆技術構建一種新型家蠶轉基因質粒載體，這種 質粒載體具有一種重組的絲素重鏈蛋白基因，并且這種重組絲素重鏈蛋白含有MMP酶切位 點，通過以下方案實現：
[0007] 首先采用乙醇沉淀法提取家蠶(菁松）基因組，然后利用設計的引物PCR擴增出家 蠶重鏈N端和C端基因序列片段，接著運用pMD-18T simple載體連接技術，PCR技術，酶 切技術，T4DNA連接酶技術構建新型家蠶轉基因質粒載體(構建流程圖見圖1)。
[0008] 本發明第2個目的是將已構建的新型家蠶轉基因質粒載體采用顯微注射法注入 到產下一定時間內的蠶卵中，通過觀察蠶蛾眼部的熒光現象鑒定轉基因是否成功，培育一 種新型轉基因家蠶，這種家蠶基因組具有一種重組的絲素重鏈蛋白基因，并且這種重組絲 素重鏈蛋白含有MMP酶切位點，通過以下方案實現：
[0009] 首先將已構建的新型家蠶轉基因質粒載體pBac[3XP3-EGFPafm]-FibH-GS-site 與Piggybac Help Plasmid進行等量混合，采用顯微注射法將混合質粒注入產下一定時間 內的蠶卵中。通過觀察后代蠶蛾眼部的熒光現象鑒定轉基因是否成功，并通過基因組PCR 法及測序鑒定獲得新型轉基因家蠶。
[0010] 本發明的有益效果是：
[0011] 1、本發明提供的技術中將家蠶(菁松)基因組中絲素重鏈的N端和C端基因以及基 質金屬蛋白酶的酶切位點基因序列克隆進PiggyBac載體中，采用顯微注射的方法進行家 蠶蠶卵的轉基因，達到了培育一種新型轉基因家蠶的效果。這種新型轉基因家蠶具有一種 重組的絲素重鏈蛋白基因，并且這種重組絲素重鏈蛋白含有MMP酶切位點。
[0012] 2、本發明提供的技術中將眼特異啟動子3XP3啟動子調控下轉錄的綠色熒光蛋 白基因置于PiggyBac載體中與重組絲素重鏈蛋白基因一同轉入家蠶蠶卵中。達到了直觀 分離培育成功的新型轉基因家蠶的效果。
[0013] 3、生物學方法改造家蠶絲素，可減少絲素產品加工的步驟，從而減少能源的消耗。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014] 圖1用于構建一種新型家蠶轉基因質粒載體的流程圖
[0015] 圖2新型家蠶轉基因質粒載體的PCR驗證
[0016] 圖3體視顯微鏡下觀察對照組和實驗組蠶蛾
[0017] 圖4PCR擴增檢測轉基因蠶蛾基因組
[0018] 圖5轉基因蠶蛾基因組中片段Fib H-GS-site的測序結果。

【具體實施方式】
[0019] 本發明結合具體實施例作進一步說明。應理解，這些實施例僅用于說明目的，而不 用于限制本發明范圍。
[0020] 實施例1
[0021] 本發明采用基因克隆技術構建一種新型家蠶轉基因質粒載體，這種質粒載體具有 一種重組的絲素重鏈蛋白基因，并且這種重組絲素重鏈蛋白含有MMP酶切位點。具體步驟 如下：
[0022] 1，設計新型家蠶轉基因質粒載體構建流程
[0023] 設計用于構建一種新型家蠶轉基因質粒載體的流程，見圖1。其中fibroin H指絲 素重鏈基因，PCR指聚合酶鏈式反應技術，FibH-N指絲素重鏈蛋白N端基因序列，A，B，F分 別指 Asc I，BamH I，Fse I 酶切位點，pMD-FibH-N 指克隆有 FibH-N 的 pMD-18T simple 載 體(購于Takara公司），FibH-GS-site-C指帶有MMPs酶切位點的絲素重鏈蛋白C端基因序 列。
[0024] 2,家蠶(菁松）基因組提取
[0025] 取家蠶(菁松）5齡三天蠶的中腸，放入預冷的研缽中，加入液氮快速研磨 成粉狀；將粉末刮入I. 5ml EP管中，加入抽提緩沖液（IOMm Tris-Cl (PH8. 0)，0. IM EDTA(PH8. 0)，0. 5%SDS) 700 μ 1，室溫放置lh，再加入蛋白酶K至終濃度為500 μ g/mL，同時 加入RNase至終濃度為50 μ g/ml，放置于56°C水浴鍋中水浴5h (每隔Ih搖晃一次）；取出 消化后的樣品，加入等體積苯酚，搖勻后，12000rpm離心IOmin,取上清650 μ 1至新的I. 5ml EP管中；加入等體積的酚/氯仿/異戊醇（25 :24 :1)，搖勻后，12000rpm離心lOmin，取上清 600 μ 1至新的I. 5ml EP管中；加入等體積的酚/氯仿（1 :1)，搖勻后，12000rpm離心IOmin, 取上清550μl至新的1.5mlEP管中；加入等體積的氯仿，搖勻后，12000rpm離心10min，取 上清500 μ 1至新的I. 5ml EP管中；加入900 μ 1預冷的無水乙醇，再加入100 μ 13M NaAC (ΡΗ5. 2)，置于-20°C冰箱中冰凍15min ;12000rpm離心lOmin，沉淀DNA，棄上清；用lml70% 冰乙醇洗滌沉淀2次，然后盡量棄上清，自然晾干，使乙醇揮發殆盡；加入40μ1 dd H20滅 菌dd H20,溶解沉淀2h或者4°C過夜，_20°C保存備用。
[0026] 3,聚合酶鏈式反應（PCR)擴增絲素重鏈蛋白基因目的序列
[0027] (1)引物設計
[0028] 以家蠶(菁松）基因組為模板，利用Primer Premier5. O設計以下引物：
[0029] Asc ! ： Fib-H-p I i^iictiGGCGCGCCtucmuatcaiigaaaaat^-.V X O O O O C5 CO O GGCGCGCC Fib-H-p2 51-cgC3GATCCtgcaccgactgcagcactagtg-3 5 BaniH i: GGATCC 5'-c ^GCj ATCCgetgetgetgiittccccattii Ligtttutauuc Big-o-p3 ^ ---- ' ' 一 BamH i： GGATCC tggtggtggtggttccagcgtcagttacggagcrgg-S5 Fse I : Fib-H-p4 5,-ucgGGCCGGCCtataiitattcttauttiiau-3 , GGCCGGCC
[0030] 其中Fib-H-Pl和Fib-H-p2是用來擴增家蠶絲素重鏈N端基因的引物對， Fib-H-pl和Fib-H-p2分別為上游引物和下游引物。Big-〇-p3和Fib-H-p4是用來擴增家蠶 絲素重鏈C端基因的引物對，Big-〇-p3和Fib-H-p4分別為上游引物和下游引物，Big-〇-p3 引物中含有MMPs酶切位點序列。
[0031] (2)PCR擴增：利用設計的引物對提取的家蠶基因組進行PCR擴增獲得家蠶絲素重 鏈N端和C端基因序列片段。PCR擴增體系如下 ：
[0032]

【權利要求】
1. 一種新型家蠶轉基因質粒載體，其特征在于，質粒載體含有重組絲素重鏈蛋白基因， 重組絲素重鏈蛋白含有基質金屬蛋白酶（MMPs)酶切位點。
2. 根據權利要求1所述的一種新型家蠶轉基因質粒載體，其特征在于，質粒載體為 PiggyBac轉座子載體。
3. 根據權利要求1所述的一種新型家蠶轉基因質粒載體，其特征在于，PiggyBac轉座 子含有眼特異啟動子3XP3啟動的綠色熒光蛋白基因。
4. 一種新型家蠶轉基因質粒載體構建方法，其特征在于，步驟如下： A :采用沉淀法提取家蠶基因組； B :PCR擴增絲素重鏈蛋白基因目的序列； C、構建新型家蠶轉基因質粒載體。
5. 根據權利要求4所述的新型家蠶轉基因質粒載體構建方法，其特征在于，PCR擴增絲 素重鏈蛋白基因目的序列過程，先PCR引物設計，以家蠶(菁松)基因組為模板，利用Primer Premier5. O設計引物，引物中含有MMPs酶切位點序列。
6. 根據權利要求4所述的新型家蠶轉基因質粒載體構建方法，其特征在于，構建新型 家蠶轉基因質粒載體，其載體構建方法如下： (1) 構建質粒：將引物Fib-H-pl和Fib-H-p2的PCR產物直接連接至pMD-18T simple 載體中，構建質粒pMD-FibH-N ; (2) 制備感受態細胞； (3) 轉化、存菌； (4) 質粒提取； (5) DNA的瓊脂糖凝膠電泳及膠回收； (6 )對提取好的質粒pMD-FibH-N和經瓊脂糖凝膠電泳及膠回收的PCR產物 FibH-GS-site-C進行雙酶切；酶切后膠回收FibH-N序列和FibH-GS-site-C序列，并用 T4DNAligase 連接； (7) 第6步連接產物膠回收后以引物對Fib-H-pl和Fib-H-p4PCR擴增含MMPs酶切位 點的重組絲素重鏈蛋白基因； (8) 對第7步PCR產物的膠回收產物和轉基因載體質粒pBac[3XP3-EGFPafm]進行雙 酶切； (9) 酶切后膠回收目的序列，并用T4DNA Iigase連接，構建新型家蠶轉基因質粒載體， 并將連接產物轉化至感受態細胞中。
7. -種新型轉基因家蠶的培育方法，其特征在于，將已構建的新型家蠶轉基因質粒載 體采用顯微注射法注入到產下一定時間內的蠶卵中，通過觀察蠶蛾眼部的熒光現象鑒定出 已經成功進行轉基因的家蠶，并通過基因組PCR法及測序鑒定獲得的轉基因家蠶進行培 育，其步驟如下： (1) 質粒提取：將已構建的PiggyBac轉座載體提取待用； (2) 顯微注射：將PiggyBac轉座載體注入蠶卵內的方法是在PiggyBac轉座子載體與 Help質粒混合后，以0. 4 μ g/μ 1注射到非滯育的早期胚胎中； (3) 家蠶飼育； (4) 突光篩選：篩選具有PiggyBac轉座載體的家蠶； (5) 轉基因蠶蛾的PCR擴增測序：進一步檢測篩選出的家蠶是否具有轉基因。 (6) 家蠶培育：對具有轉基因的家蠶進行常規培育。
8. 根據權利要求7所述的新型轉基因家蠶的培育方法，其特征在于，PiggyBac轉座子 載體與Help質粒體積比例為1 :1。
9. 根據權利要求7所述的新型轉基因家蠶的培育方法，其特征在于，注射量為15-20ng (10-15nl)DNA。
10. 根據權利要求7所述的新型轉基因家蠶的培育方法，其特征在于，早期胚胎為產卵 后1?3h〇
【文檔編號】A01K67/04GK104212833SQ201310209747
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2013年5月30日 優先權日:2013年5月30日
【發明者】黃國平, 孫春鳳, 陳克平, 姚勤, 陳慧卿, 張春霞, 張志燕 申請人:江蘇大學