專利名稱：纖維連接蛋白n-端和c-端肝素結(jié)合域多肽在制備抗肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的藥物中應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種纖維連接蛋白N-端和C-端肝素結(jié)合域多肽在制備抗肝癌細(xì)胞的藥物中應(yīng)用。
背景技術(shù)：
FN是已知的多功能糖蛋白，具有多個(gè)與其它分子結(jié)合的位點(diǎn)，包括N末端和C端肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在獲得高純度FN的N端和C端肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域多肽(分別簡稱rhFNHN^和 rhFNHC36)的基礎(chǔ)上，我們研究rhFNHN^和rhFNHC36多肽對人高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞(MHCC97H) 粘附和侵襲功能的影響，并進(jìn)一步分析其分子機(jī)制。侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的重要生物學(xué)特性。癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移需要特殊的細(xì)胞-細(xì)胞間、細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)間的相互作用。這些相互作用受整合素、鈣粘合素和選擇素的調(diào)節(jié)。 其中整合素調(diào)節(jié)癌細(xì)胞粘附到細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞表面成份是關(guān)鍵的因素。因此，阻止癌細(xì)胞粘附至細(xì)胞外基質(zhì)蛋白是治療惡性腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的重要目標(biāo)。纖維連接蛋白(簡稱FN)是有粘附作用的一種糖蛋白分子。前期的體外研究顯示 FN錨定EMC在癌細(xì)胞的趨化性上發(fā)揮重要的作用。另一方面，對癌細(xì)胞的FN表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞FN的表達(dá)下降與癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。這些可解釋癌細(xì)胞FN表達(dá)的增加， 可相反地有效降低癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，這暗示著FN在抗癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用價(jià)值。我們的體外干預(yù)實(shí)驗(yàn)顯示游離FN可抑制肝癌細(xì)胞的粘附和轉(zhuǎn)移。暴露的FN細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)，處在游離與錨定狀態(tài)之間則無此作用。游離FN與癌細(xì)胞表面分子(整合素)相互作用增加同種細(xì)胞的粘度。因此，我們相信游離FN有抑制肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用。然而，F(xiàn)N的應(yīng)用面臨著許多的問題，如血資源的缺乏、血源性傳染病的傳播、其分子量達(dá)到420KD，利用基因工程技術(shù)全分子表達(dá)，目前還存在著難度。FN分子上有多個(gè)與錨定相關(guān)的活性位點(diǎn)，肝素結(jié)合區(qū)、膠原結(jié)合區(qū)、纖維蛋白結(jié)合區(qū)和細(xì)胞結(jié)合區(qū)。這些結(jié)合區(qū)域與多種細(xì)胞功能相關(guān)，包括粘附、 遷移、分化、細(xì)胞凋亡、形態(tài)改變，止血及修復(fù)損壞等等。因此，用FN多肽的功能區(qū)域來替代 FN是一個(gè)更可行的方法。對癌癥治療，有些報(bào)道顯示了這樣的作用。例如，F(xiàn)N中的RGD片段，包含粘附識(shí)別信號Arg-Gly-Asp，可抑制鼠肝細(xì)胞癌(HCC)肝內(nèi)轉(zhuǎn)移。CH50多肽，包含細(xì)胞I和肝素I雙結(jié)合區(qū)域片段，能起到抑制腫瘤生長、侵襲和血管生成。FNIII14多肽也能有效抑制淋巴瘤細(xì)胞粘附和轉(zhuǎn)移。肝素結(jié)合域是FN分子中的重要結(jié)構(gòu)。一個(gè)Q37AA) 位于它的N-端，包含5個(gè)I型同源結(jié)構(gòu)，另一個(gè)(272)位于C端，包含三個(gè)III型同源結(jié)構(gòu)。我們曾利用遺傳工程合成了重組N-端和C-端肝素結(jié)合域多肽(分別簡稱rhFNHN^* rhFNHC36)(其具體結(jié)構(gòu)和蛋白序列見專利公開文獻(xiàn)CN200810071172. 2)、并進(jìn)一步證實(shí)其具有結(jié)合肝素的活性。然而，這些多肽對腫瘤的治療作用仍未見報(bào)道。我們研究了 rhFNHN^ 和rhFNHC36多肽對人高轉(zhuǎn)移性肝癌細(xì)胞(MHCC97H)的粘附和侵襲性的作用，并分析這種現(xiàn)象的潛在分子機(jī)制。

發(fā)明內(nèi)容
針對以上現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種纖維連接蛋白N-端和 C-端肝素結(jié)合域多肽在制備抗肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的藥物中應(yīng)用。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，所述的二種重組纖維連接蛋白N端(又可寫成 N-端)和C端(C-端)肝素結(jié)合域多肽，其一的特征在于是由FN分子中N端的五個(gè)I型同源結(jié)構(gòu)組成，含有從Ser46-GlW82的237個(gè)氨基酸；編碼該多肽的DNA序列從403bp到 11 l!3bp，長71 lbp，PCR擴(kuò)增片斷長741bp，雙酶切后片斷長729bp ；由酵母表達(dá)的多肽分子量 *^.52kDa，纖維連接蛋白N端肝素結(jié)合域多肽(簡稱rhFNHN-四)。所述的另一種重組纖維連接蛋白C端肝素結(jié)合域多肽，其特征在于是由FN分子中的IH-12、111-13、111-14三個(gè)III型同源結(jié)構(gòu)組成，含有從Tyrl720-Tyrl991的272個(gè)氨基酸；編碼該多肽的DNA序列從M^bp到6244bp，長816bp，PCR擴(kuò)增片斷長835bp，雙酶切后片斷長828bp，由酵母表達(dá)的多肽分子量為36. 09kDa,纖維連接蛋白C端肝素結(jié)合域多肽(簡稱rhFNHC_36)。所述的 rhFNHN-29和rhFNHC-36詳細(xì)內(nèi)容見本申請人先前申請的專利申請?zhí)枮镃N200810071172.2 的公開文獻(xiàn)。本發(fā)明所述的rhFNHN-四和rhFNHC-36在制備抗肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的藥物中的應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的所采用的方法是1)采用結(jié)晶紫染色法檢測不同濃度 rhFNHN29和rhFNHC36對MHCC97H細(xì)胞粘附FN的影響，Matrigel試驗(yàn)和裸鼠肺轉(zhuǎn)移模型分別檢測Matrigel對MHCC97H細(xì)胞侵襲力的影響。2)采用^festern blotting檢測整合素和FAK磷酸化蛋白的表達(dá)、膠酶譜分析基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)活性以及EMSA法檢測活化蛋白-1 (AP-I)的活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為rhFNH^9和rhFNHC36均能抑制MHCC97H細(xì)胞的粘附和侵襲能力，rhFNHC36需要的濃度更低。這種抑制效應(yīng)是整合素α νβ 3介導(dǎo)的并可被酪氨酸磷酸化酶抑制劑解除。rhFNHN29和rhFNHC36可以促進(jìn)FAK酪氨酸磷酸化和AP-I的活性，從而降低整合素α ν，β 3和β 1的表達(dá)以及ΜΜΡ-9的活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)論為rhFNH^9和 rhFNHC36在抗肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的治療中具有潛在的應(yīng)用前景。本發(fā)明的有益效果是通過大量的試驗(yàn)，本發(fā)明所述的rhFNH擬9和rhFNHC36均能抑制MHCC97H細(xì)胞的粘附和侵襲能力，而且抑制MHCC97H細(xì)胞的粘附和侵襲能力所需的 rhFNHC36濃度更低。這種抑制效應(yīng)是整合素α ν β 3介導(dǎo)的并可被酪氨酸磷酸化酶抑制劑解除。rhFNHN^和rhFNHC36可以促進(jìn)FAK酪氨酸磷酸化和AP-I的活性，從而降低整合素 α ν，β 3和β 1的表達(dá)以及ΜΜΡ-9的活性。由此可見rhFNHN^和rhFNHC36能作為制備抗肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的藥物應(yīng)用，其治療肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移具有潛在的良好的應(yīng)用前景。


圖1為本發(fā)明的rhFNHN^和rhFNHC36多肽表達(dá)圖。圖中(A)部分是FN結(jié)構(gòu)。FN是由一系列結(jié)構(gòu)相同的的同源序列組成(FNI，F(xiàn)NII 和FNIII)。長方形代表I型結(jié)構(gòu)，菱形代表II型結(jié)構(gòu)，橢圓形物代表III型結(jié)構(gòu)。rhFNHN29 包含N-端肝素結(jié)合區(qū)域(HBD)，是由五個(gè)I型結(jié)構(gòu)組成。rhFNHC36包含C-端肝素結(jié)合區(qū)域，是由第12至14個(gè)三個(gè)III型結(jié)構(gòu)組成。圖中(B)部分，純化rhFNHN^和rhFNHC36多肽經(jīng)SDS-PAGE電泳分離，考馬斯亮
蘭染色。
圖中(C)部分，純化 rhFNHN29 和 rhFNHC36 多肽經(jīng) Western blotting 顯示 FN 抗原性。圖2A為本發(fā)明的人肝癌細(xì)胞系不同整合素或基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)表達(dá)的 RT-PCR分析圖。其中從肝癌細(xì)胞系中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄，PCR擴(kuò)增整合素α 4，α 5，α V， β land β 3，β-actin 為內(nèi)參。細(xì)胞系包括SMMC7721，BEL7404，H印G2，Huh_7，MHCC97L 和 MHCC97H ；圖2B為本發(fā)明的人肝癌細(xì)胞系不同整合素或基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)表達(dá)的 RT-PCR分析圖。其中從肝癌細(xì)胞系中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄，PCR擴(kuò)增MMP1，MMP2 and MMP9, β -actin 為內(nèi)參。細(xì)胞系包括SMMC7721，BEL7404, HepG2, Huh-7, MHCC97L 和 MHCC97H ；圖3A為本發(fā)明的rhFNH^9*rhFNHC36多肽抑制MHCC97H趨向和粘附FN，分別用 25 μ g/ml IgG, α ν 免疫球蛋白(P2W7)，β 3 (BV4)或 β 1 (8Α2)預(yù)處理的含 Mn2+ 的 MHCC97H 細(xì)胞接種于96孔板，孔板以FN(20 μ g/ml).或多聚賴氨酸00/毫升)封閉的條件下，測得的吸收分布圖。圖3B為本發(fā)明的rhFNHN^和rhFNHC36多肽抑制MHCC97H趨向和粘附FN，在顯微鏡下比較在正常下的MHCC97H細(xì)胞形態(tài)和參照實(shí)驗(yàn)下的MHCC97H細(xì)胞形態(tài)、在有FN， rhFNHN29和rhFNHC36 (200 μ g/ml)存在下MHCC97H細(xì)胞中出現(xiàn)成纖維細(xì)胞狀態(tài)圖。圖4為本發(fā)明的rhFNHN^和rhFNHC36多肽對腫瘤轉(zhuǎn)移克隆的影響圖。圖中在正常條件、FN, rhFNHN29和rhFNHC36多肽干預(yù)下6周齡裸鼠肺轉(zhuǎn)移照片圖。圖5A為本發(fā)明的rhFNHN^和rhFNHC36多肽按劑量依賴方式影響整合素α ν, β 3and β 1的表達(dá)圖；圖5Β為本發(fā)明的I hFNHC36和IihFNHN^多肽降低整合素表達(dá)和MMPs活性，在不同濃度rhFNHN^和rhFNHC36多肽中的MHCC97H細(xì)胞上清液的明膠酶譜圖。 圖6A為本發(fā)明的rhFNHN29和rhFNHC36多肽對FAK酪氨酸磷酸化和AP-I活性的影響圖；具體ΡΑ0對rhFNH^9*rhFNHC36多肽抗粘附作用的影響。含和不含Mn2+(0. ImM) 的MHCC97H懸液，含和不含PAO (20 μ Μ)的MHCC97H懸液，分別先用FN，rhFNHN29 and rhFNHC36 (200 μ g/ml)處理，然后接種于有和沒有FN封閉的96孔板中，觀察MHCC97H對FN 的粘附。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明實(shí)驗(yàn)方法試劑、細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物限制性酶 EcoRI，XhoI, BamHI, HindIII, BglII 和 T4 連接(來自 Promega 有限公司)，載體pGEM-T, pPIC9K, pAo815SM和GS115酵母細(xì)胞(來自Invitrogen公司)；純化 S-100柱，SP柱和HiTrap Heparin HP柱(來自GE公司)。BSA、I型膠原蛋白、IV膠原蛋白及FN(來自 Sigma公司)。Anti-FN pAb, anti-integrin α v (P2W7), β 3 (BV4), β l(8A2)mAb and anti-p-FAK mAb were purchased from(來自 Santa Cluz 公司)。肝癌細(xì)胞(MHCC97L和MHCC97H)(來自上海復(fù)旦大學(xué)肝癌研究所)。雄性BALB/c裸鼠年齡在5到6周(來自中國科學(xué)院)。RhFNHN29 和 RhFNHC36 多肽的制備根據(jù)酵母表達(dá)載體特點(diǎn)確定N-端和C-端肝素結(jié)合域的克隆位點(diǎn)，并設(shè)計(jì)PCR引物和限制性內(nèi)切酶5’-ATGCTC I TCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTAGTCAAAGCAAGCCCGGTTGTTA-3’(rhFNHN29 -F)5， -ACGTAG 丨 AATTCTCCGCTCGATGTGGTCTGCA-3’ (rhFNHN29-R)5， -CGG I GATCCGCTATTCCTGCACCAACTGAC-3‘ (rhFNHC36-F)5， -CCCA I AGCTTCTCGTCTGTCTTTTTCCTTCC-3， (rhFNHC36-R)分別含XhoI/EcoRI and BamHI/Hindlll 內(nèi)切酶。rhFNHN29基因克隆至T載體，篩選后轉(zhuǎn)移至酵母表達(dá)pAo815SM載體進(jìn)行選擇，再構(gòu)建重組酵母表達(dá)PPIC9K載體，線性化重組載體并轉(zhuǎn)染GSl 15酵母細(xì)胞，在GSl 15酵母細(xì)胞表達(dá)目的多肽。發(fā)酵液經(jīng)80 %硫酸胺沉淀，沉淀物過S-100柱分離純化，純化物再經(jīng)過 SP柱純化。HPLC監(jiān)測所收集純化樣本的UV280峰值，收集UV280峰值樣本，SDS-PAGE電泳， western blotting檢測FN抗原性，質(zhì)譜儀測量其分子量。rhFNHC36多肽的制備過程同rhFNHN^多肽的的制備。詳細(xì)內(nèi)容請見專利申請?zhí)枮镃N200810071172. 2的公開文獻(xiàn)報(bào)道。半定量RT-PCR分析用Trizol從細(xì)胞系中分離RNA，并反轉(zhuǎn)錄。用PCR方法擴(kuò)增整合素α 4 096bp)， α 5(362bp), α v(236bp), β 1(407bp)禾口 β 3(327bp)， ΜΜΡ-1(428bp)， ΜΜΡ-2(390bp)， MMP-9(215bp)和 β-actin (500bp)等的 cDNA 片段。PCR 擴(kuò)增引物如下整合素α 4 上 5，-CAACACGCTGTTCGGCTAC-3，下5， -TATGCCCACAAGTCACGATG-3，；整合素α 5 上 5，-CCGAATTCTGGAGTATGCAC-3，下5， -TGGTGACATAGCCGTAAGTG-3，；整合素α ν 上 5，-GGAGCAATTCGACGAGCACT-3，下5， -GCAGGCGTGAACTGGTTAAG-3，；整合素β 1 上 5，-TGAAGGGCGTGTTGGTAGAC-3，下5， -GCCCTTGAAACTTCGGATCT-3，整合素β 3 ；上 5，-CACCAGTAACCTGCGGATTG-3，下5， -GTCTTGGCATCAGTGGTAAAC-3，；MMP-1 上 5，-CTGAAGGTGATGAAGCAGCC-3，下5， -AGTCCAAGAGAATGGCCGAG-3，ΜΜΡ-2 上 5， -GCGACAAGAAGTATGGCTTC-3，下5， -TGCCAAGGTCAATGTCAGGA-3，；ΜΜΡ-9 上 5，-AGTTCCCGGAGTGAGTTGAA-3，下5， -CTCCACTCCTCCCTTTCCTC-3，；β -actin 上 5，-ATGTCACGCACGATTTCCCGC-3，
6
下5， -GGCATGGGTCAGAAGGATTCC-3，細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)用BSA, I型膠原蛋白，IV型膠原蛋白或FN(20 μ g/ml) ·封閉96孔板，將MHCC97H 細(xì)胞懸液OX 105/100 μ 1)加于96孔板中，細(xì)胞懸液分為含Mn2+和不含Mn2+。含Mn2+的 MHCC97H又分為含25μ g/ml IgG和不含25 μ g/ml IgG，以及含α v免疫球蛋白(P2W7)， β 3 (BV4)或β 1 (8Α2)。然后接種于96孔板，孔板以FN (20 μ g/ml) ·或多聚賴氨酸(20/毫升).封閉。含F(xiàn)N、rhFNH^9和rhFNHC36或不含的。37°C孵化1小時(shí)，PBS沖洗，細(xì)胞粘附到基底用結(jié)晶紫染色。測定590nm的吸光率。Matrigel 入侵檢測8-mm孔徑的PET膜先以20yg Matrigel預(yù)封膜，在轉(zhuǎn)移小室中培養(yǎng)后轉(zhuǎn)移至另一 M孔板中。底部用FN(0. 5毫克/毫升)封，空氣干澡。包含Mn2+和不包含Mn2+的 MHCC97H 細(xì)胞(5X104/100 μ 1)的懸液，含和不含 FN、rhFNHN29 和 rhFNHC36,對照 IgG，或含抗α V(P2W7)，i3 3(BV4)或β 1 (8A2)免疫球蛋白。37°C孵化1小時(shí)，然后轉(zhuǎn)移到上室中。 4 孵化后，插入膜在固定液中(含95%乙醇和5%的乙酸)固定30分鐘。膜上面未侵入的細(xì)胞用棉花棒擦去。膜下面的細(xì)胞用HE染色，在倒置顯微鏡下X 100計(jì)數(shù)并算平均值。肺轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)IXlO7的MHCC97H細(xì)胞溶于0.2毫升生理鹽水中，接種于裸鼠的右側(cè)。32只接種癌細(xì)胞的裸鼠隨機(jī)分為四組(n = 8)，在接種癌細(xì)胞處分別注射PBS溶液、FN、rhFNHN29和 rhFNHC36，連續(xù)7天。6周后處死全部裸鼠，取肺組織，福爾馬林固定、石蠟包埋，切片，HE染色。計(jì)算肺組織中的轉(zhuǎn)移灶。MMPs 活性MHCC97H細(xì)胞(1. 2 X IO6)懸液接種于6孔板中，DMEM培養(yǎng)基中含10% FBS、Mn2+， 含與不含各種濃度的rhFNH^9和rhFNHC36。M小時(shí)后，細(xì)胞在無血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng) M小時(shí)。離心收集上清液，細(xì)胞用胰蛋白酶消化，評估實(shí)驗(yàn)結(jié)果。MMf3S活性測定實(shí)驗(yàn)，根據(jù) Iwai報(bào)道的明膠酶譜分析法進(jìn)行。20μ 1的上清液加到酶電泳分布圖膠，輔以0. 明膠以檢測ΜΜΡ-2和MMP-9。120V電壓電泳90分鐘。電泳后的膠用復(fù)性液沖洗，在孵化緩沖液中37°C 24小時(shí)，考馬斯亮蘭R-250染色。脫色液脫色。Westernblot整合素蛋白分析按MMI3S活性測定的實(shí)驗(yàn)方法培養(yǎng)MHCC97H細(xì)胞。50 μ g細(xì)胞提取物在10 % SDS-PAGE膠中電泳，電轉(zhuǎn)膜至NC膜上，先結(jié)合抗整合素α ν，β 3和β 1抗體，再與HRP標(biāo)記的抗鼠IgG雜交，用ECL檢測。蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化作用MHCC97H細(xì)胞在無血清DMEM培養(yǎng)基中孵育10小時(shí)，然后在含與不含氧化砷(ΡΑ0， 20 μ Μ)的DMEM培養(yǎng)基中5分鐘，再在DMEM培養(yǎng)基中含Mn2+(0. ImM)，及含有與不含有FN， rhFNHN29 and rhFNHC36 QOO μ g/ml) 37°C 20分鐘。提取細(xì)胞核蛋白和酪氨酸磷酸化蛋白， 10% SDS-PAGE膠電泳，電轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，先結(jié)合抗p-FAK (Tyr 397)抗體，再與HRP標(biāo)記的抗鼠IgG雜交顯色，用ECL檢測。Band-shift 電泳檢測(EMSA)按蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化作用的方法培養(yǎng)MHCC97H細(xì)胞。根據(jù)EMSA說明，7 μ g細(xì)胞核蛋白提取物，與生物素標(biāo)記的 AP-I 探針(5，-CGCTTGATGACTCAGCCGGAA-3，/3，-GCGAACTAC TGAGTCGGCCTT-5，)在結(jié)合緩沖液中結(jié)合，室溫20分鐘?；罨腁P-I在6. 5% SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)至尼龍膜上顯色。
結(jié)果 RhFNHC36和RhFNHN^多肽的肝素親和純化FN-N端肝素結(jié)合域多肽是由五個(gè)相同的I型結(jié)構(gòu)組成(圖1中的A部分)，包含 237 個(gè)氨基酸(Ser46-GlW82)。DNA序列的長度71 Ibp (403bp-1113bp)。PCR擴(kuò)增片段741bp，雙酶切片段 729bp。FN-C端肝素結(jié)合域多肽是由三個(gè)相同的III型結(jié)構(gòu)組成(111-12，111-13， 111-14)(圖1中的A部分)，包含272個(gè)氨基酸(Tyrl720_Tyrl991)，DNA序列的長度 816bp(5428bp-6244bp)。PCR擴(kuò)增片段83^p，雙酶切片段828bp。我們命名兩種多肽分別為 rhFNHN^ 和 rhFNHC36。成功構(gòu)建重組酵母表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-FNH^9和pPIC9K_FNHC36，構(gòu)建高表達(dá)的酵母表達(dá)菌株GS115-FNH^9和KM71-FNHC36，發(fā)酵液經(jīng)高心、過柱分離，獲得95%以上純度的 rhFNHN29和rhFNHC36多肽。Western blotting證明多肽可與FN多克隆抗體結(jié)合(圖1 中的C部分)，具有結(jié)合肝素的活性，分子量測定分別為27. 9kDa和31. OkDa (圖1中的B部分)。人肝癌細(xì)胞系整合素和MMPs的表達(dá)方式整合素和基質(zhì)金屬蛋白酶的不同表達(dá)顯示癌細(xì)胞的不同粘附和侵襲能力，影響細(xì)胞和胞外基質(zhì)的相互作用。先前的研究關(guān)注這種關(guān)系，但肝癌細(xì)胞的表達(dá)方式卻知之較少。 為研究rhFNH擬9和rhFNHC36多肽對肝癌細(xì)胞粘附和侵襲能力的影響，我們首次用RT-PCR 方法比較了 MHCC97H細(xì)胞和其他類型的肝癌細(xì)胞系的整合素和MMPs mRNA的表達(dá)。結(jié)果顯示MHCC97H細(xì)胞中無整合素a4mRNA的表達(dá)，較低的整合素a 5mRNA表達(dá)，高的整合素a v， 整合素β 1，整合素β 3 (見圖2Α)，MPP1, ΜΡΡ2，MPP9mRNA的表達(dá)(圖2B)?？傊?，MHCC97H 細(xì)胞適于作為研究rhFNHN^和rhFNHC36多肽對肝癌細(xì)胞粘附和侵襲能力影響的模型。RhFNHC36和RhFNHN^多肽通過降低整合素α ν β 3抑制MHCC97H的粘附和侵襲根據(jù)以上的結(jié)果，我們進(jìn)一步研究了 rhFNHN^和rhFNHC36多肽對MHCC97H細(xì)胞的抗粘附和侵襲作用的研究。MHCC97H細(xì)胞粘附于FN上依賴于Mn2+，輕微粘附于BSA，I型和IV型膠原。另一方面，(圖3A)MHCC97H細(xì)胞粘附于FN被抗a V(P2W7)和抗β 3 (BV4) 抗體抑制，但不被抗β 1(8Α》抑制。rhFNHC36多肽抑制粘附呈劑量依賴。rhFNH擬9多肽和FN抑制粘附要大的劑量。rhFNHN^和rhFNHC36多肽不能抑制MHCC97H細(xì)胞非特異性粘附至多聚賴氨酸。rhFNH擬9和rhFNHC36多肽抗侵襲中，MHCC97H細(xì)胞穿過膜至底部， 被抗a V(P2W7)和抗β 3 (BV4)抗體抑制，不被抗β 1 (8Α2)抑制。提示α νβ 3導(dǎo)致侵襲。 rhFNHC36多肽抑制侵襲呈小劑量，rhFNHN29和FN要大的劑量。(見圖由此可見，纖維連接蛋白N-端和/或C-端肝素結(jié)合域多肽，能很好地在制備抗肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的藥物中應(yīng)用。RhFNHC36 和 RhFNHN29 多肽降低 MHCC97H 轉(zhuǎn)移我們進(jìn)一步研究rhFNHN^和rhFNHC36多肽對MHCC97H細(xì)胞在裸鼠肺轉(zhuǎn)移的影響。裸鼠在接種MHCC97H細(xì)胞后6周處死，做肺組織病理切片，在顯微鏡下觀察所有樣本的肺組織切片。(圖4) FN，rhFNHN29和rhFNHC36的平均腫瘤轉(zhuǎn)移灶分別是7. 1 士 1. 1， 7. 3 士 1. 3and 5. 9 士 1. 2，對照是 8. 9 士 1. 6。rhFNHN29 和 rhFNHC36 多肽能有效抑制 MHCC97H 細(xì)胞在肺的轉(zhuǎn)移。rhFNHC36多肽的效果較rhFNHN^強(qiáng)(P < 0. 05)。結(jié)果顯示rhFNHN^ 和rhFNHC36多肽在降低MHCC97H細(xì)胞肺的轉(zhuǎn)移起重要的作用。由此可見，纖維連接蛋白N-端和/或C-端肝素結(jié)合域多肽，能很好地在制備抗肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的藥物中應(yīng)用。RhFNHC36和RhFNHN^多肽降低整合素表達(dá)和MMPs活性為了證明整合素和MMPs表達(dá)的改變是否是rhFNHN^和rhFNHC36多肽降低 MHCC97H細(xì)胞粘附和侵襲能力的原因。我們測定了 MHCC97H細(xì)胞相關(guān)整合素表達(dá)、MMP-2和 MMP-9的活性。(圖5A)結(jié)果顯示rhFNHN^和rhFNHC36多肽按劑量依賴方式影響整合素 α ν, β 3and β 1的表達(dá)。用高濃度rhFNHC36多肽洗QOO μ g/ml)細(xì)胞，細(xì)胞幾乎不表達(dá)整合素α ν，β 3，提示rhFNHC36多肽的作用強(qiáng)于rhFNH擬9。另外，rhFNHN^和rhFNHC36多肽對MMP-2的影響不明顯。rhFNHC36多肽對MMP-9活性的影響呈劑量依賴方式(圖5B)。 說明了 MHCC97H細(xì)胞粘附和侵襲被降低的機(jī)理。由此可見，纖維連接蛋白N-端和/或C-端肝素結(jié)合域多肽，能很好地在制備抗肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的藥物中應(yīng)用。RhFNHC36和IihFNHN^多肽活性與粘著斑激酶磷酸化和活性蛋白(AP-I)相關(guān)粘著斑蛋白酪氨酸的磷酸化被認(rèn)為在整合素調(diào)節(jié)中發(fā)輝著重要的作用。為了進(jìn)一步說明rhFNHN^和rhFNHC36多肽作用于整合素調(diào)節(jié)的分子機(jī)制，我們檢測了 PAO在 rhFNHN29和rhFNHC36多肽抗粘附作用中的意義。(圖6A)rhFNHN29和rhFNHC36多肽的抗 MHCC97H細(xì)胞粘附至FN作用在加入PAO后而消失，而PAO本身對粘附作用并無影響。接下來，本發(fā)明的rhFNHN^和rhFNHC36多肽對FAK酪氨酸磷酸化和AP-I活性的影響，具體 pl25FAK的免疫印跡和AP-I活性的EMSA。MHCC97H細(xì)胞在無血清DMEM培養(yǎng)基中孵育10小時(shí)，然后在含與不含氧化砷(ΡΑ0，20μΜ)的DMEM培養(yǎng)基中5分鐘，再在DMEM培養(yǎng)基中含 Mn2+ (0. ImM)，及含有與不含有 FN，rhFNHN29andrhFNHC36 (200 μ g/ml) 37°C 20 分鐘。提取細(xì)胞核蛋白和酪氨酸磷酸化蛋白，SDS-PAGE膠電泳，電轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，p_FAK(Tyr 397)抗體，再與HRP標(biāo)記的抗鼠IgG雜交顯色。AP-I活性在尼龍膜上免疫印跡，HRP標(biāo)記探針雜交。我們觀察在粘附和移動(dòng)信息中的FAK(pl25Fffi)酪氨酸的磷酸化和AP-I活性，MHCC97H 細(xì)胞在Mn2+’rhFNH^9和rhFNHC36多肽存在下，pl25FAK*和AP-I活性處在低水平，加入PAO 后仍處于低水平。由此可見，纖維連接蛋白N-端和/或C-端肝素結(jié)合域多肽，能很好地在制備抗肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的藥物中應(yīng)用。討論肝細(xì)胞癌(HCC)的發(fā)生和轉(zhuǎn)移是臨床上的重大問題。臨床上探討著能有效抑制癌轉(zhuǎn)移的多種治療方法。HCC的整合素的表達(dá)及細(xì)胞外基質(zhì)與癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。從細(xì)胞外基質(zhì)的粘附點(diǎn)合成整合素結(jié)合多肽進(jìn)行抗粘附治療的方法正在研究中。前期的許多研究顯示，多種細(xì)胞外基質(zhì)多肽，含RGD細(xì)胞粘附序列的合成多肽，其中包括FN，具有抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用。然后這些短肽的應(yīng)用卻受限于大的劑量和短的半衰期。為了克服這些困難，進(jìn)行了許多化學(xué)修飾的研究，增加其對整合素的親和力。來源于第14個(gè)III型結(jié)構(gòu)的合成多肽，能以多種方式減弱α 5β1調(diào)節(jié)多種細(xì)胞粘附至FN。有人根據(jù)整合素α and β 亞單位的保守序列，合成抗粘附多肽(DLYYLMDLSYSMK)。有人證明，利用基因轉(zhuǎn)移技術(shù)在體內(nèi)表達(dá)FN的重組CBD-肝素II雙功能區(qū)域，稱CH50，抑制癌的肝轉(zhuǎn)移。然而，這種基因治療對于肝癌本身的治療作用卻未見研究。我們的研究顯示，來源于FN的重組多肽rhFNHN^和rhFNHC36具有抑制MHCC97H 細(xì)胞在裸鼠的肺轉(zhuǎn)移作用。這種高功效的解釋是長的片段較少降解及沒有化學(xué)修飾和基因表達(dá)對器官的不良作用。其抑制的機(jī)制可能是非常復(fù)雜的，本發(fā)明研究得出以下的機(jī)理首先，rhFNHN^和rhFNHC36影響α v and β 3的功能。由于α ν β 3的調(diào)節(jié)作用， rhFNHN29和rhFNHC36隨濃度的改變而抑制MHCC97H細(xì)胞向FN的移動(dòng)及粘附于FN上。前期的研究證實(shí)，人類重組FN多肽CH50能干預(yù)整合素αν and β 3的表達(dá)和活性，進(jìn)而抑制癌細(xì)胞的侵襲和血管的生成。FNIII14也能抑制β 1整合素調(diào)節(jié)粘附，從而抑制淋巴癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。肝內(nèi)皮細(xì)胞下沒有基底膜，肝癌細(xì)胞不能象其他癌細(xì)胞那樣粘附于層粘連蛋白或膠原蛋白。因此，整合素調(diào)節(jié)HCC轉(zhuǎn)移和細(xì)胞粘附于FN在轉(zhuǎn)移的形成中起決定性的作用。 這牽涉到多種FN的受體，如α 4，α 5，α ν和β 1，β 3整合素亞基。其中整合素ανβ3是重要元件，它調(diào)節(jié)肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，是由于正常組織的低表達(dá)而HCC高表達(dá)。腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)理研究常與FAK通道有關(guān)。本發(fā)明在研究rhFNHN^* rhFNHC36影響MHCC97H粘附和侵襲作用中，發(fā)現(xiàn)在整合素-FAK-AP-I通道中AP-I的活性調(diào)節(jié)起重要作用。rhFNHN^和rhFNHC36抑制MHCC97H粘附和侵襲，通過阻斷整合素-FAK-AP-I通道。在MHCC97H粘附和侵襲時(shí)，由整合素受體誘導(dǎo)的酪氨酸磷酸化酶調(diào)節(jié)信號通道是最重要的。FAK主要分布在粘附斑結(jié)構(gòu)上，它與細(xì)胞粘附，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和其它細(xì)胞功能密切相交。整合素α亞其的細(xì)胞外區(qū)域與ECM，膜上的整合素簇結(jié)合后和進(jìn)一步激活粘附激酶(FAK phosphorylation)和其他蛋白激酶。我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)加入特異的FAK抑制劑 (PAO)，p-FAK的表達(dá)恢復(fù)，提示rhFNHN^或rhFNHC36與整合素α ν β 3相互作用導(dǎo)致進(jìn)入核內(nèi)的一系列信號阻斷，包括AP-I活性。由AP-I調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子，包括整合素和Miffs的TRE。 它包含AP-I的結(jié)合位點(diǎn)，TPA反應(yīng)元件。在這個(gè)研究中，rhFNHC36對整合素和MMP9表達(dá)的抑制作用是劑量依賴性的，但rhFNHN 對整合素表達(dá)的抑制作用需要較高的濃度。我們推測rhFNHC36較rhFNHN^更有效的理由1)雖然rhFNHN^和rhFNHC36都含有肝素結(jié)合區(qū)域，rhFNHC36還含有另一個(gè)抗粘附點(diǎn)YTIYVIAL。這個(gè)抗粘附點(diǎn)深埋在III型結(jié)構(gòu)，但在 rhFNHC36卻是外露的。2) AP-I轉(zhuǎn)錄因子是亮氨酸拉鏈蛋白，與一致的DNA序列(5，_TGAG/ CTCA-3’)結(jié)合，作為二聚的復(fù)合物。不同的AP-I 二聚物與不同的親和力結(jié)合DNA，被認(rèn)為是不同AP-I復(fù)合物具不同生物學(xué)作用的部分原因。AP-I 二聚物結(jié)合MMP9啟動(dòng)子的能力大于 MMP2。另外，本發(fā)明研究的較好效果是因?yàn)楦深A(yù)的目標(biāo)確定。不同的腫瘤細(xì)胞有不同的整合素和MMP表達(dá)，它與不同的腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的潛能相關(guān)。整合素和MMPs mRNA的表達(dá)水平在一組人類腫瘤細(xì)胞系中被分析過，腫瘤不同的分化程度，腫瘤形成的潛能，組織侵襲和轉(zhuǎn)移。本發(fā)明研究測定了不同肝癌細(xì)胞系的整合素和MMPs mRNA的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)MHCC97H 細(xì)胞中低的整合素α 5mRNA表達(dá)，高的整合素α v，整合素β ，整合素β 3，ΜΡΡ1，ΜΡΡ2， MPP9mRNA的表達(dá)，部分提示侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)理。提示MHCC97H細(xì)胞適于作為研究抗粘附和侵襲作用的模型。
總之，我們的研究提供了第一手證據(jù)，證明rhFNH擬9和rhFNHC36通過降低整合素的表達(dá)和MPP9的活性，在防治肝癌中的重要作用。是肝癌治療的新策略。結(jié)論本發(fā)明研究顯示rhFNHN^和rhFNHC36有抑制MHCC97H細(xì)胞的粘附和侵襲，解除附著點(diǎn)的酪氨酸的磷酸化，激活活性蛋白(AP-I)的活性，從而降低整合素av，i3 3and β 的表達(dá)，降低ΜΜΡ-9的活性。rhFNHN^和rhFNHC36在抗人肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移中起重要作用，是治療人肝癌的有效新策略。由此可見，纖維連接蛋白N-端和/或C-端肝素結(jié)合域多肽，能很好地在制備抗肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的藥物中應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.一種纖維連接蛋白N-端和/或C-端肝素結(jié)合域多肽，在制備抗肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的藥物中應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的肝癌細(xì)胞為人高轉(zhuǎn)移性肝癌細(xì)胞 (MHCC97H)。
全文摘要
本發(fā)明公開一種纖維連接蛋白N-端和C-端肝素結(jié)合域多肽在制備抗肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的藥物中應(yīng)用，具體地說，本發(fā)明所述的rhFNHN29和rhFNHC36均能抑制MHCC97H細(xì)胞的粘附和侵襲能力，而且抑制MHCC97H細(xì)胞的粘附和侵襲能力所需的rhFNHC36濃度更低。這種抑制效應(yīng)是整合素αvβ3介導(dǎo)的并可被酪氨酸磷酸化酶抑制劑解除。rhFNHN29和rhFNHC36可以促進(jìn)FAK酪氨酸磷酸化和AP-1的活性，從而降低整合素αv，β3和β1的表達(dá)以及MMP-9的活性。由此可見rhFNHN29和rhFNHC36能作為制備抗肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的藥物應(yīng)用，其治療肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移具有潛在的良好的應(yīng)用前景。
文檔編號A61K38/39GK102309748SQ20101021577
公開日2012年1月11日 申請日期2010年7月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月2日
發(fā)明者吳勇, 唐南洪, 李秀金, 王曉茜, 鄒起練, 陳元仲, 陳燕凌 申請人:福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院