一種連續檢測肝素的方法及其裝置制造方法
【專利摘要】本發明涉及肝素檢測，具體來說涉及一種連續、快速檢測肝素的方法及其裝置。利用外加恒電流的作用促進魚精蛋白在聚離子敏感膜內的擴散，使電極在線再生，對肝素進行連續檢測。將膜相中含有魚精蛋白的聚離子敏感膜電極置于流動注分析系統中，當肝素樣品隨載液流入檢測池，魚精蛋白與肝素的特異性作用使電極產生電位信號；利用魚精蛋白在外加恒電流作用下的快速更新實現電極的在線再生，從而實現對肝素的連續檢測。本發明采用流動注射分析儀控制，使操作簡便，易于實現自動化。
【專利說明】一種連續檢測肝素的方法及其裝置
【技術領域】
[0001 ] 本發明涉及肝素檢測，具體來說涉及一種連續、快速檢測肝素的方法及其裝置。
【背景技術】
[0002]在臨床中，肝素的檢測是通過測定活化凝血時間(ACT)或者活化部分凝血活酶時間(APTT)而間接實現的。血小板的數量和功能會影響ACT的準確性與可靠性；APTT雖然排除了血小板的影響，但不適用于全血測定。聚離子敏感膜電極特異性強、靈敏度高，已被用于全血樣品中肝素的測定。然而，聚離子敏感膜電極產生的類穩態電位響應，是水相中待測聚離子在膜相中的離子交換劑協助作用下被萃取進入膜相、并向膜本體擴散的過程；此過程不可逆，電極無法重復使用，使其應用受到限制。采用脈沖電流調控模式或計時電位模式，雖然能夠使電極重復使用，卻未能用于流動分析之中，不利于連續檢測；另外，氯離子的存在也會對電極產生較大的干擾。

【發明內容】

[0003]本發明的目的在于針對上述不足提供一種連續、快速檢測肝素的方法及其裝置。
[0004]為實現上述目的，本發明采用的技術方案為:
[0005]一種連續檢測肝素的方法，將敏感膜中含有魚精蛋白的聚離子敏感膜電極置于流動注分析系統中，并施加外加恒電流，當待測樣品隨載液流入檢測池中，聚離子敏感膜中的魚精蛋白與肝素的特異性作用使電極產生電位信號，根據電位變化得到樣品溶液中肝素的濃度，同時外加恒電流能夠促進魚精蛋白向聚離子敏感膜內擴散，使電極在線再生，從而實現對肝素的連續檢測。
[0006]具體檢測過程:
[0007](a)將敏感膜中含有魚精蛋白的聚離子敏感膜電極固定于檢測池中，利用電化學工作站測定聚離子敏感膜電極在外加恒電流作用下的電極電位，待電位穩定后得到基線電位；
[0008](b)轉換樣品閥，使肝素標準溶液隨載液流入測量池，肝素與魚精蛋白相互作用使電極敏感膜表面的魚精蛋白含量降低，同時水相中的鈉離子交換進入膜相并占據陽離子交換位點，引起電位信號變化；肝素標準溶液流出檢測池后，電極敏感膜表面的魚精蛋白在外加恒電流的作用下逐漸恢復至初始狀態，電極電位也隨之恢復，并產生峰形電位信號；
[0009](c)電極電位恢復后，重復(b)過程，可對肝素進行連續檢測；
[0010](d)根據加入肝素標準溶液后產生的峰形電位信號的峰高，對肝素濃度繪制標準曲線；
[0011](e)將實際樣品按照(b)所述方法通入檢測池進行檢測，得到樣品的峰形電位信號；通過對照標準工作曲線即得到實際樣品濃度。
[0012]所述外加恒電流的目的在于促進魚精蛋白向聚離子敏感膜內的擴散，其大小受到所選用的膜材料及其比例和內充液中魚精蛋白的濃度的影響。本發明所提供的檢測方法中，外加恒電流的大小為0-100A。
[0013]所述聚離子敏感膜電極由聚氯乙烯管、內充液和插于其中的內參比電極組成；其中，所述聚氯乙烯管底部設有聚離子敏感膜，所述內充液為含有魚精蛋白的Tris緩沖溶液，所述內參比電極為銀絲。
[0014]所述聚離子敏感膜電極使用前在含有魚精蛋白的Tris緩沖溶液中活化l_24h。
[0015]所述聚離子敏感膜是由聚合物基體材料、增塑劑、離子載體和親脂性鹽組成，其重量份數比為 20-40:40-80:0.1-10:0.1-1O0
[0016]所述聚合物基體材料為聚氯乙烯、聚丁基丙烯酸酯、聚丙烯酸丁酯、聚醚酰亞胺、橡膠或溶膠凝膠膜；增塑劑為鄰-硝基苯辛醚(o-NPOE)、二 -2-乙基己基癸酯、癸二酸二丁酯或癸二酸二辛酯；離子載體為二壬基萘磺酸；親脂性鹽為四(十二烷基)-四(4-氯苯基)硼酸銨。
[0017]一種連續檢測肝素的方法的專用裝置，專用裝置流動分析系統由載液池、樣品池、蠕動泵、樣品閥、檢測池、電位測量裝置和廢液池組成；載液池與樣品閥之間設有第一蠕動泵，樣品池與樣品閥之間設有第二蠕動泵；樣品閥通過管路與檢測池相連，電位測量裝置插入檢測池中；檢測池通過管路與第一廢液池相連，樣品閥通過管路與第二廢液池相連。
[0018]所述樣品閥為六通閥，并設有能夠定量載入樣品溶液的定量環。所述檢測池為噴壁式流通池。
[0019]電化學工作站通過導線分別連接外參比電極、聚離子敏感膜電極和輔助電極，外參比電極、聚離子敏感膜電極與輔助電極插入待檢測池中；所述外參比參比電極為Ag/AgCl (3M KCl)電極，輔助電極為鉬絲電極。
[0020]作用原理:聚離子敏感膜表面的魚精蛋白與樣品溶液中的肝素結合，形成的絡合物進入水相，同時水相中的鈉離子交換進入敏感膜的膜相，占據陽離子交換位點，可引起電位的變化；在外加恒電流的作用下，由內充液中滲透進入敏感膜的膜相的魚精蛋白分子可以克服在膜相中遷移速率慢的缺點，快速地向敏感膜表面補充，使電極恢復至初始狀態，從而實現對肝素的連續檢測。
[0021]本方法與現有技術相比，具有如下優點:
[0022]1.本發明中用于識別肝素的魚精蛋白大量存在于電極的內充液之中，可以使敏感膜中消耗的魚精蛋白得到及時地補充；外加恒電流可以促進魚精蛋白在膜相中的擴散，從而促進電極的恢復，使電極能夠用于連續測定。
[0023]2.本發明中將聚離子敏感膜電極放置于流動分析系統中，采用流動注射分析儀控制，使操作簡便，易于實現自動化。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1為本發明實施例提供的檢測裝置示意圖，其中I為載液池，2為樣品池，3-1、3-2為蠕動泵，4為樣品閥，5為檢測池，6為聚離子敏感膜電極，7為外參比電極，8為輔助電極，9為電化學工作站，10-1、10-2為廢液池。
[0025]圖2為為本發明實施例提供的檢測裝置中樣品閥的示意圖(其中4為樣品閥，11為定量環，I為載液池，2為樣品池，5為檢測池，10-2為第二廢液池)。
[0026]圖3為本發明實施例提供的檢測裝置中電極的示意圖(其中6為聚離子敏感膜電極，12為聚離子敏感膜，13為內充液，14為內參比電極)。
[0027]圖4為本發明實施例提供的測定不同濃度肝素標準溶液的電位響應曲線。
[0028]圖5為本發明實施例提供的法測定不同濃度肝素標準溶液的標準工作曲線。工作曲線方程為—ΛΕ=10.80C-0.84，其中△ E單位為mV，C單位為U mL'
[0029]圖6為本發明實施例提供的測定不同濃度硫氰根離子和水楊酸根離子的電位響應。
[0030]圖7為本發明實施例提供的利用本發明檢測方法在一個月內對1.0U mL-1肝素標準溶液的電位響應。
【具體實施方式】
[0031]實施例1
[0032]以本發明提供的檢測方法測定緩沖溶液中的標準肝素樣品為例。
[0033]檢測裝置:
[0034]如圖1所示,流動分析系統包括載液池1、樣品池2、第一螺動泵3-1、第二螺動泵3-2、樣品閥4、檢測池5和第一廢液池10-1、第二廢液池10-2 ;載液池I和檢測池5通過管路連通；檢測池5上設有電位測量裝置，并且檢測池5與第一廢液池10-1相連；載液池I和檢測池5之間設 有樣品閥4 ;樣品池2與樣品閥4之間通過管路連通，并且樣品閥4與第二廢液池10-2相連。
[0035]如圖2所示，所述樣品閥為六通閥，其中兩個接口用于連接定量環11，另外四個接口分別連接載液池1、檢測池5、樣品池2和第二廢液池10-2。初始狀態(如圖2A)下，載液在第一蠕動泵3-1驅動作用下，流經樣品閥4并進入檢測池5，最終進入第一廢液池10-1 ；樣品溶液在第二蠕動泵3-2驅動作用下進入樣品閥4并充滿定量環11，最終進入第二廢液池10-2。進樣狀態(如圖2B)下，轉動樣品閥，則定量環11中的樣品溶液隨載液進入檢測池5;進樣結束后，將樣品閥轉回初始狀態，即完成一次進樣。
[0036]所述電位測量裝置由聚離子敏感膜電極6、外參比電極7、輔助電極8和電化學工作站9構成；其中，聚離子敏感膜電極6、外參比電極7和輔助電極8分別插入檢測池5中，另一端由導線連接至電化學工作站9。
[0037]如圖3所示，聚離子敏感膜電極6由聚離子敏感膜12、內充液13和內參比電極14構成。
[0038]所述外參比電極為Ag/AgCl(3M KCl)電極，輔助電極為鉬絲電極，內參比電極為銀絲電極。
[0039]聚離子敏感膜電極的制備:
[0040]分別稱取12.0mg 二壬基萘磺酸，12.0mg四(十二烷基)-四(4_氯苯基)硼酸銨，60.0mg聚氯乙烯，122.0mg鄰-硝基苯辛醚,溶入3mL四氫呋喃溶液中，攪拌均勻，室溫下在平底小燒杯(直徑3.6cm)中放置12h，待四氫呋喃完全揮發干后即得到有彈性的聚合物敏感膜。
[0041]將所述聚合物敏感膜用打孔器切割成直徑為0.6cm的均勻圓形切片，利用四氫呋喃將切片黏附于聚氯乙烯管底部，得到聚離子敏感膜電極。電極內部注入含有50mMTris-HCl (pH=7.4),50.0mg L—1的魚精蛋白和0.12M NaCl的混合溶液作為內充液；電極初次使用前需在含有50mMTris-HCl (pH=7.4),50.0mg L—1的魚精蛋白和0.12M NaCl的混合溶液中活化12h ;電極不用時需在4°C下保存。
[0042]實施步驟:
[0043](a)將載液池內含有 0.12M NaCl 的 Tris-HCl (50mM, ρΗ=7.4)緩沖溶液以 1.8mLrniiT1的流速通過流動分析系統中的樣品閥和檢測池，流入廢液池；利用電化學工作站在聚離子敏感膜電極上施加大小為20nA的陽極電流，并測定電極電位，待電位穩定后得到基線電位；
[0044](b)將樣品池內含有已知濃度的肝素標準溶液泵入樣品閥并充滿500 μ L定量環，轉換樣品閥，使定量環中的肝素標準溶液隨載液流入測量池，記錄肝素標準溶液流經檢測池前后的電極電位變化，得到樣品的電位信號；
[0045](c)電極電位恢復后，重復(b)過程，對已知濃度的肝素標準溶液進行連續檢測；
[0046](d)根據加入肝素標準溶液后產生的電位信號(如圖4)，對肝素濃度繪制標準曲線(如圖5)。
[0047]如圖4，本發明提供的檢 測方法能夠對肝素樣品進行連續電位檢測，且電極恢復快速。
[0048]實施例2
[0049]以本發明提供的檢測方法對硫氰根離子的抗干擾能力測試為例。
[0050]以含有0.12M NaCl 的 Tris-HCl (50mM, pH=7.4)緩沖溶液配制 10-7-10-3Μ 的硫氰根離子(SCN_)標準溶液。
[0051]內充液為50mM Tris-HCl (pH=7.4),50.0mg L-1 的魚精蛋白和 0.12M NaCl 的混合溶液。
[0052]采用實施例1所述的檢測裝置和聚離子敏感膜電極，按照實施例1所述的實施步驟對KT7-1O-3M的硫氰根離子標準溶液進行電位測定，根據加入硫氰根離子標準溶液后產生的電位信號，對硫氰根離子的對數濃度繪制標準曲線(如圖6 )。
[0053]本發明提供的檢測方法對親脂性的硫氰根離子具有較好的抗干擾能力，有望應用于復雜血樣中的肝素檢測。
[0054]實施例3
[0055]以本發明提供的檢測方法對水楊酸根離子的抗干擾能力測試為例。
[0056]以含有0.12M NaCl 的 Tris-HCl (50mM, pH=7.4)緩沖溶液配制 10-7-10-3Μ 的水楊酸根離子(Sal—)標準溶液。
[0057]內充液為50mM Tris-HCl (ρΗ=7.4),50.0mg L4 的魚精蛋白和 0.12Μ NaCl 的混合溶液。
[0058]采用實施例1所述的檢測裝置和聚離子敏感膜電極，按照實施例1所述的實施步驟對KT7-1O-3M的水楊酸根離子標準溶液進行電位測定，根據加入水楊酸根離子標準溶液后產生的電位信號，對水楊酸根離子的對數濃度繪制標準曲線(如圖6 )。
[0059]本發明提供的檢測方法對親脂性的水楊酸根離子具有較好的抗干擾能力，有望應用于復雜血樣中的肝素檢測。
[0060]實施例4
[0061]以本發明提供的檢測方法在一個月內的穩定性為例。[0062]以含有0.12M NaCl 的 Tris-HCl (50mM, pH=7.4)緩沖溶液配制 1.0U ml/1 的肝素標準溶液。
[0063]采用實施例1所述的檢測裝置和聚離子敏感膜電極進行電位測定。
[0064]將在含有50mM Tris-HCl (pH=7.4),50.0mg l-1 的魚精蛋白和 0.12M NaCl 的混合溶液中活化12h的聚離子敏感膜電極保存于4°C條件下，于0-30天時使用保存的電極對
1.0U ml/1肝素標準溶液進行電位測定。
[0065]實施步驟:
[0066](a)將載液池內含有 0.12M NaCl 的 Tris-HCl (50mM, ρΗ=7.4)緩沖溶液以 1.8mLrniiT1的流速通過流動分析系統中的樣品閥和檢測池，流入廢液池；利用電化學工作站在聚離子敏感膜電極上施加大小為20nA的陽極電流，并測定電極電位，待電位穩定后得到基線電位；
[0067](b)將樣品池內1.0U ml-1的肝素標準溶液泵入樣品閥并充滿500 μ L定量環，轉換樣品閥，使定量環中的肝素標準溶液隨載液流入測量池，記錄肝素標準溶液流經檢測池前后的電極電位變化，得到樣品的電位信號；
[0068](C)電極電位恢復后，重復(b)過程，對1.0U ml-1的肝素標準溶液進行連續多次測定;
[0069](d)根據加入1.0U mL-1肝素標準溶液后產生的電位信號，對電極保存時間繪制標準曲線(如圖7)。
[0070]本發明提供的檢測方法中的聚離子敏感膜電極具有較好的穩定性，在一個月內電位響應不會發生明顯變化。
【權利要求】
1.一種連續檢測肝素的方法，其特征在于:將敏感膜中含有魚精蛋白的聚離子敏感膜電極置于流動注分析系統中，并施加外加恒電流，當待測樣品隨載液流入檢測池中，聚離子敏感膜中的魚精蛋白與肝素的特異性作用使電極產生電位信號，根據電位變化得到樣品溶液中肝素的濃度，同時外加恒電流能夠促進魚精蛋白向聚離子敏感膜內擴散，使電極在線再生，從而實現對肝素的連續檢測。
2.按權利要求1所述的連續檢測肝素的方法，其特征在于: 具體檢測過程: (a)將敏感膜中含有魚精蛋白的聚離子敏感膜電極固定于檢測池中，利用電化學工作站測定聚離子敏感膜電極在外加恒電流作用下的電極電位，待電位穩定后得到基線電位； (b)轉換樣品閥，使肝素標準溶液隨載液流入測量池，肝素與魚精蛋白相互作用使電極敏感膜表面的魚精蛋白含量降低，同時水相中的鈉離子交換進入膜相并占據陽離子交換位點，引起電位信號變化；肝素標準溶液流出檢測池后，電極敏感膜表面的魚精蛋白在外加恒電流的作用下逐漸恢復至初始狀態，電極電位也隨之恢復，并產生峰形電位信號； (C)電極電位恢復后，重復(b)過程，可對肝素進行連續檢測； (d)根據加入肝素標準溶液后產生的峰形電位信號的峰高，對肝素濃度繪制標準曲線.(e)將實際樣品按照(b)所述方法通入檢測池進行檢測，得到樣品的峰形電位信號；通過對照標準工作曲線即得到實際樣品濃度。
3.按權利要求1或2所述的連續檢測肝素的方法，其特征在于:所述聚離子敏感膜電極由聚氯乙烯管、內充液和插于其中的內參比電極組成；其中，所述聚氯乙烯管底部設有聚離子敏感膜，所述內充液為含有魚精蛋白的Tris緩沖溶液，所述內參比電極為銀絲。
4.按權利要求3所述的連續檢測肝素的方法，其特征在于:所述聚離子敏感膜電極使用前在含有魚精蛋白的Tris緩沖溶液中活化I?24h。
5.一種權利要求1所述的連續檢測肝素的方法的專用裝置，其特征在于:專用裝置流動分析系統由載液池、樣品池、蠕動泵、樣品閥、檢測池、電位測量裝置和廢液池組成；載液池與樣品閥之間設有第一蠕動泵，樣品池與樣品閥之間設有第二蠕動泵；樣品閥通過管路與檢測池相連，電位測量裝置插入檢測池中；檢測池通過管路與第一廢液池相連，樣品閥通過管路與第二廢液池相連。
6.按權利要求5所述的連續檢測肝素的方法的專用裝置，其特征在于:所述樣品閥為六通閥，并設有能夠定量載入樣品溶液的定量環；所述檢測池為噴壁式流通池。
7.按權利要求5所述的連續檢測肝素的方法的專用裝置，其特征在于:電化學工作站通過導線分別連接外參比電極、聚離子敏感膜電極和輔助電極，外參比電極、聚離子敏感膜電極與輔助電極插入待檢測池中；所述外參比參比電極為Ag/AgCl (3M KCl)電極，輔助電極為鉬絲電極。
【文檔編號】G01N27/26GK103808775SQ201410092144
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2014年3月13日 優先權日:2014年3月13日
【發明者】秦偉, 雷佳宏, 丁家旺, 陳燕 申請人:中國科學院煙臺海岸帶研究所