專利名稱：穿心蓮提取物及其化學成份在制備治療病理性血管新生疾病的藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種具有調控血管新生作用的穿心蓮提取物及其化學成份的醫藥新用途。
背景技術：
血管生成是指通過血管內皮細胞遷移、增殖，在原有的血管上以出芽的方式生長出新的血管網，是機體嚴格控制的一個多因素、級聯、整體、動態的過程。在病理因素作用下，促血管生成因子異常表達，打破了機體對血管形成的動態調控平衡，原來靜止的血管內皮細胞將迅速增生，新生血管異常形成，常常出現在慢性炎癥與纖維化、腫瘤生長與轉移、 肥胖、糖尿病視網膜疾病、糖尿病腎病、銀屑病、風濕性關節炎、子宮內膜異位癥等疾病中。穿心蓮為爵床科植物穿心蓮Andrograpis panniculata Nees的全草或葉，主產于中國、印度和部分南亞地區。味苦，性寒，歸肺、胃、肝經。功效清熱解毒，涼血消腫。古代常用于治療感冒發熱，咽喉腫痛，口舌生瘡，頓咳勞嗽，泄瀉痢疾，熱淋澀痛，癰腫瘡瘍，毒蛇咬傷等。穿心蓮的主要成分有內酯、留醇、多種黃酮類化合物、生物堿，還有少量蛋白質和維生素等，其活性成分主要是以穿心蓮內酯為代表的二萜內酯類化合物及其葡萄糖苷衍生物。 國內外研究表明，穿心蓮內酯及其衍生物對中毒性肝損害的抵抗活性，利膽活性，對機體非特異免疫功能的調節作用，抗HIV活性，對心、腦缺血的保護作用，抗生育作用均有良好的活性。近年來，在抗腫瘤方面的研究更突顯出了穿心蓮內酯的作用，對胃癌、肝癌、肺癌、乳癌、惡性葡萄胎及絨毛膜上皮癌等均具有良好的抗腫瘤作用。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提出穿心蓮提取物及其化學成份的醫藥新用途。通過體內體外實驗研究，發明人首次發現穿心蓮提取物及其化學成份能夠顯著性地抑制血管內皮生長因子誘導的血管新生，其中穿心蓮內酯類化合物，尤其是穿心蓮內酯活性最強，并闡明其分子機制。穿心蓮內酯首次被確認為潛在性的血管內皮生長因子抑制劑，可以作為治療病理性血管新生疾病的候選者。本發明的穿心蓮提取物的制備過程并無特別之處。將中藥穿心蓮葉打粉，用水、 20% 95%乙醇、丙酮、乙酸乙酯、汽油或石油醚回流提取，加入常見藥用輔料制成任何一種藥學上所說的劑型，優選浸膏、流浸膏、酒齊 、酊齊 、口服液、丸齊 、散齊 、滴丸、片劑或膠囊劑。本發明的穿心蓮提取物具有防治病理性血管新生疾病的作用很可能與如下物質的作用密切相關穿心蓮中的二萜內酯類物質，尤其是穿心蓮內酯、異穿心蓮內酯、新穿心蓮內酯、14-去氧穿心蓮內酯、脫水穿心蓮內酯、8-甲基穿心蓮內酯苷元、新穿心蓮內酯苷元以及它們的衍生物。隨后的藥效實驗將證明，穿心蓮提取物及穿心蓮中的二萜內酯類化合物可治療糖CN 102335211 A
說明書
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尿病視網膜病、腫瘤、風濕性關節炎、子宮內膜異位癥、糖尿病腎病、銀屑病等多種病理性血管新生疾病。穿心蓮是藥食兼用的純天然的植物提取物，具有高效的調控血管新生作用并治療病理性血管新生疾病。


圖1是穿心蓮內酯對血管內皮生長因子(VEGF)誘導人臍靜脈內皮細胞ERK1/2磷酸化的影響圖。圖2是穿心蓮內酯對血管內皮生長因子(VEGF)誘導人臍靜脈內皮細胞p38磷酸化的影響圖。圖3是穿心蓮內酯對血管內皮生長因子(VEGF)誘導人臍靜脈內皮細胞JNK/SAPK 磷酸化的影響圖。圖4是穿心蓮內酯對血管內皮生長因子(VEGF)誘導人臍靜脈內皮細胞VEGFR2磷酸化的影響圖。
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施例進一步闡述本發明。這些實施例應理解為僅用于說明本發明而不用于限制本發明的保護范圍。在閱讀了本發明記載的內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等效變化和修飾同樣落入本發明權利要求所限定的范圍。實施例1(穿心蓮提取物抑制血管內皮生長因子VEGF誘導人臍靜脈內皮細胞 HUVECs的生長、遷移和管腔形成)本發明首先考察穿心蓮提取物對VEGF誘導HUVECs生長、遷移和管腔形成的影響。1.1實驗材料1.1.1.新生兒臍帶由上海國際和平婦嬰保健院提供。在無菌條件下，于健康產婦分娩后立即取新生胎兒臍帶，長度20cm左右，置于4°C HBSS中，1小時內送細胞培養室。1.1.2.藥物及其制備穿心蓮水提物采用穿心蓮葉粗粉，用10倍量水提取三次，每次池，濾液合并后減壓濃縮至穿心蓮生藥計濃度2g/mL，即得穿心蓮水提物。I型膠原酶、肝素、明膠和溴化-3 (4，5- 二甲基噻唑-2) 2，5- 二甲苯基四氮唑 (MTT)購自美國Sigma公司，胎牛血清(FBS)、Matrigel、M199培養液、0. 25%胰蛋白酶和促內皮細胞生長添加物(ECGS)購自美國^witrogen公司。血管內皮生長因子(VEGF)購自美國PeproTech公司。實驗中所用其它試劑均為國產分析純。1. 2實驗方法1. 2. 1人臍靜脈內皮細胞的分離與原代培養無菌條件下取健康產婦正常娩出的胎盤端游離臍帶置，15-20cm，4°C保存于HBSS 中。臍靜脈一端插入灌胃針頭并固定，注入HBSS液沖洗干凈靜脈腔內血跡和血塊；用止血鉗夾閉臍靜脈另一端，灌膠原酶液使管腔充盈，頂端封閉，37°C水浴15分鐘，消化后取出臍帶，輕柔按摩血管以增加內皮細胞脫落，消化液轉入含血清的培養液中，終止膠原酶，用HBSS灌洗消化后的血管，收集并與消化液一并離心，1000r/min, 5分鐘，棄上清收集沉淀細胞，并用含20%胎牛血清的M199培液重懸，移入培養皿中，用2ml培液重懸，用含20%胎牛血清的 M199 培液基，并添加 10ng/ml EGF，30ng/ml ECGS 和 5U/ml 肝素，于 37°C ,5% CO2 及飽和濕度的培養箱中培養，用0. 25%胰蛋白酶-0. 04% EDTA消化傳代，取對數生長期細胞用于實驗。對分離所得的人臍靜脈內皮細胞進行鑒定，由專職老師在倒置顯微鏡下觀察細胞形態鑒定，并通過免疫熒光檢測細胞VWF表達，鑒定為原代HUVEC細胞。1. 2. 2藥物抑制細胞增殖實驗取對數生長期的細胞，將細胞制成細胞懸液，按一定的濃度鋪入96孔板中，待細胞貼壁生長狀態良好時加入待測藥物與細胞共孵48小時后，加入10μ 1 ΜΤΤ(終濃度 0. 5mg/ml)置培養箱反應4小時，加入50 μ 1三聯劑(10% SDS_5%異丁醇-0. OlM HCL)于培養箱中充分溶解12小時以上，最后在0D570/630nm處測定吸光值。細胞存活率(％ )= 給藥組OD (570nm-630nm) /對照組OD (570nm-630nm) X 100%，對照組加含等量DMSO的細胞培養液而不加任何藥物。1. 2. 3藥物抑制生長因子誘導細胞增殖實驗取對數生長期的細胞，將細胞制成細胞懸液，按一定的濃度鋪入96孔板中，待細胞貼壁生長狀態良好時，棄原培養基，換含1 %胎牛血清的M199培養基，加入待測藥物15分鐘后，加入生長因子(VEGF或bFGF)與細胞共孵48小時后，加入10 μ 1 MTT (終濃度0. 5mg/ ml)置培養箱反應4小時，加入50 μ 1三聯劑(10% SDS_5%異丁醇-0. OlM HCL)于培養箱中充分溶解12小時以上，最后在0D570/630nm處測定吸光值。細胞存活率(％ )=給藥組 OD(570nm-630nm)/對照組OD(570nm-630nm) X100%,對照組加含等量DMSO的細胞培養液而不加任何藥物。1. 2. 4遷移實驗Transwell小室用0. 明膠包被Ih后，取出晾干，將消化好的人臍靜脈內皮細胞用無血清培液洗3次，稀釋為4X 105/ml，于上室加入IOOul (4X 104cells/well)細胞懸液。 下室加入600 μ 1的無血清培液，并加入VEGF(10ng/ml)，穿膜8小時。吸去上下室培液，以 40C 4%多聚甲醛室溫固定30min，用棉簽擦去內室上層未遷移細胞，0. 結晶紫常溫染色 IOmin0以PBS漂洗多余染。顯微鏡下拍照并計數，最后用10%乙酸IOOul/孔抽提lOmin， 用酶標儀600nm下測定OD值。1.2. 5管腔形成實驗96孔板每孔鋪上冷的液體基質膠30 μ 1，在37°C下固化45分鐘。每孔加100 μ 1 細胞懸液(lX104cellS/well)同時加不同濃度的藥物或對照，孵育4小時。用倒置差像顯微鏡記錄圖像，計算完整的管腔形成數。1.2.6統計學處理實驗數據均用平均值士標準誤表示，采用SPSS 11. 5統計軟件進行分析，以 One-WayANOVA方式進行方差分析，兩兩比較采用LSD法，P < 0. 05為具有統計學顯著性差異標準。1. 3實驗結果1.3. 1穿心蓮提取物對HUVEC人臍靜脈內皮細胞靜息期和血管內皮生長因子 (VEGF)誘導的增殖影響
由表1可見，穿心蓮提取物于0-17. 5 μ g/ml，對靜息期人臍靜脈內皮細胞的增殖無影響，說明對人臍靜脈內皮細胞無明顯的細胞毒性。穿心蓮提取物于3. 5 μ g/ml時，能夠顯著性地抑制VEGF誘導人臍靜脈內皮細胞的增殖，并呈劑量依賴性表1穿心蓮提取物對人臍靜脈內皮細胞HUVECS靜息期和血管內皮生長因子 (VEGF)誘導的增殖影響(n = 15)
權利要求
1.穿心蓮提取物或穿心蓮二萜內酯類化合物及其衍生物在制備防治病理性血管新生疾病的藥物中的應用。
2.根據權利要求1所述的用途，其特征是，穿心蓮提取物為中藥穿心蓮的全粉混懸液， 或中藥穿心蓮的水提取物、20% 95%乙醇提取物、丙酮提取物、乙酸乙酯提取物、汽油或石油醚提取物。
3.根據權利要求2所述的用途，其特征是，穿心蓮提取物為任何一種藥學上所說的劑 型。
4.根據權利要求3所述的用途，其特征是，穿心蓮提取物為浸膏、流浸膏、酒劑、酊劑、 口服液、丸劑、散劑、滴丸、片劑或膠囊劑。
5.根據權利要求1所述的用途，其特征是，穿心蓮二萜內酯類化合物為穿心蓮內酯、異穿心蓮內酯、新穿心蓮內酯、14-去氧穿心蓮內酯、脫水穿心蓮內酯、8-甲基穿心蓮內酯苷元或新穿心蓮內酯苷元。
6.根據權利要求1所述的用途，其特征是，病理性血管新生疾病為糖尿病視網膜病、腫瘤、風濕性關節炎、子宮內膜異位癥、糖尿病腎病或銀屑病。
全文摘要
本發明公開了穿心蓮提取物或穿心蓮二萜內酯類化合物及其衍生物在制備防治病理性血管新生疾病的藥物中的應用。本發明發現穿心蓮具有調控血管新生的作用，適用于常常出現在慢性炎癥與纖維化、腫瘤生長與轉移、肥胖、糖尿病視網膜疾病、糖尿病腎病、銀屑病、風濕性關節炎、子宮內膜異位癥等病理性血管新生的治療，可用于制備抗病理性血管新生的藥物，實現了中藥穿心蓮作為制備治療病理性血管新生藥物的應用，開拓了中藥穿心蓮應用范圍和藥物價值，為中醫藥學的發展作出創造性貢獻。
文檔編號A61P35/00GK102335211SQ201010233410
公開日2012年2月1日 申請日期2010年7月22日 優先權日2010年7月22日
發明者季莉莉, 徐沖, 沈凱凱, 王崢濤, 龔陳媛 申請人:上海中醫藥大學