專利名稱：Peg-pcl-peg的新用途及裝載抗原的混合物的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物制品領域，涉及PEG-PCL-PEG共聚物作為免疫佐劑以制備蛋白多 肽疫苗的用途。
背景技術：
免疫佐劑(immunoadjuvant)又稱非特異性免疫增生劑。本身不具抗原性，但同抗 原一起或預先注射到機體內能增強免疫原性(見抗原)或改變免疫反應類型。種類很多， 目前尚無統一的分類方法，常用的佐劑可分為4類無機佐劑，如氫氧化鋁，明礬等；有機佐 劑，微生物及其產物如分枝桿菌(結核桿菌、卡介苗)、短小桿菌、百日咳桿菌、內毒素、細菌 提取物(胞壁酰二肽)等；合成佐劑，如人工合成的雙鏈多聚核苷酸(雙鏈多聚腺苷酸、尿 苷酸)、左旋咪唑、異丙肌苷等；油劑，如弗氏佐劑、花生油乳化佐劑、礦物油、植物油等。弗 氏佐劑目前在實驗動物中最常用，又可分為弗氏不完全佐劑和完全佐劑兩種。免疫佐劑的 生物作用包括(1)抗原物質混合佐劑注入機體后，改變了抗原的物理性狀，可使抗原物質 緩慢地釋放，延長了抗原的作用時間；(2)佐劑吸附了抗原后，增加了抗原的表面積，使抗 原易于被巨噬細胞吞噬；(3)佐劑能刺激吞噬細胞對抗原的處理；(4)佐劑可促進淋巴細胞 之間的接觸，增強輔助T細胞的作用；(5)可刺激致敏淋巴細胞的分裂和漿細胞產生抗體， 故免疫佐劑的作用可使無免疫原性物質變成有效的免疫原；(6)可提高機體初次和再次免 疫應答的抗體滴變；(7)改變抗體的產生類型以及產生遲發型變態反應，并使其增強。近年來，脂質體在免疫佐劑領域中開始得到應用。作為免疫佐劑，脂質體有著安全 性好；毒副作用小；提高抗原穩定性，延長疫苗使用期；能降低被包裹抗原的毒性，增強受 體耐受高劑量病原微生物或其毒素攻擊的能力等優點。但是不同的疫苗是否都能使用脂質 體作為免疫佐劑目前沒有定論，不同疫苗所需要的脂質體免疫佐劑的配方還需要反復地尋 找和篩選；并且脂質體作為佐劑成本高、包封率低、制備復雜、批間差異大，在實際應用中有 較大的困難。本領域目前需要開發新的、優秀的免疫佐劑。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是為免疫佐劑的使用提供新的選擇。本發明解決技術 問題的技術方案是提供PEG-PCL-PEG三嵌段共聚物作為免疫佐劑的新用途。其中，上述用途中的PEG-PCL-PEG共聚物，其分子量為1500 10000，其中PEG鏈 段的分子量與PCL鏈段的分子量的比值為0. 4 2. 6。其中，上述用途中的PEG-PCL-PEG共聚物分子量為2000 8000，其中PEG鏈段的 分子量與PCL鏈段的分子量的比值為0. 5 2。其中，上述用途中的PEG-PCL-PEG 共聚物為 E55(1-C22(1Q-E55(1、E75Q-C3_-E75。、 E750-C2500-E750、E750-C750-E750 或 E2_-C4000-E2000 ；其中 E 表示 PEG，C 表示 PCL，下標分別表示相 應鏈段的分子量。本發明所解決的第二個技術問題是提供了一種PEG-PCL-PEG三嵌段共聚物作為免疫佐劑裝載目標抗原制成的復合物。其中，上述復合物中的PEG-PCL-PEG共聚物，其分子量為1500 10000，其中PEG 鏈段的分子量與PCL鏈段的分子量的比值為0. 4 2. 6。其中，上述復合物中的PEG-PCL-PEG共聚物分子量為2000 8000，其中PEG鏈段 的分子量與PCL鏈段的分子量的比值為0. 5 2. 25。優選的，上述PEG-PCL-PEG共聚物中 PCL的相對分子質量與PEG的相對分子質量的比值優選為1.75 2. 25。更優選的，上述嵌 段共聚物中PCL的相對分子質量與PEG的相對分子質量的比值為2。其中，上述復合物中的PEG-PCL-PEG 共聚物為 E55。-C22。。-E55。、E75。-C3_-E75。、 E750-C2500-E750、E750-C750-E750 或 E2_-C4000-E2000 ；其中 E 表示 PEG，C 表示 PCL，下標分別表示相 應鏈段的分子量。其中，上述復合物為水凝膠，其中的PEG-PCL-PEG共聚物濃度為15wt% 40wt%; 較優為20wt% 30wt% ；更優選濃度為25wt%。其中，上述復合物中的目標抗原為腫瘤生長因子類多肽。其中，上述復合物中的目標抗原為堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)或其具備抗 原性的短肽(tbFGF)。bFGF短肽為缺失部分氨基酸殘基但是仍具有同樣活性的bFGF短肽 (tbFGF)。進一步的，上述復合物還含有多糖成分。其中，上述復合物中的多糖為甘露聚糖。其中，上述復合物中的bFGF蛋白或短肽 與多糖的重量比例為1 0.2 5，優選比例為1 2。其中，上述復合物中PEG-PCL-PEG的用量則根據實際使用的抗原劑量和注射時的 復合物或者疫苗體積確定，以使液態復合物或液態疫苗中的PEG-PCL-PEG濃度為15wt% 40wt%為宜，較優為15wt% 35wt%，最優為25wt%。根據本發明，在實際使用中，本發明復合物(疫苗)可將目標抗原(如bFGF或短 肽).PEG-PCL-PEG共聚物、多糖溶解于水或生理鹽水中后，再冷凍干燥成粉末形成。將此復 合物裝載于瓶中進行保藏，運輸和銷售。在使用前使用時再將水或生理鹽水注射入瓶中，配制成均勻溶液，然后進行皮下 注射。皮下注射后一段時間內形成凝膠，凝膠緩慢降解，釋放其裝載的抗原成分。同時，本發明復合物(或疫苗)可含有兩分離的組分，A組分是PEG-PCL-PEG共 聚物、多糖等溶解于水或生理鹽水中后，再冷凍干燥所得到的粉末；B組分是目標抗原(如 bFGF的凍干粉末)。A組分可裝于A瓶中；B組分可裝于B瓶中。使用時，可將水或生理鹽水分別注射入A瓶和/或B瓶中，形成均勻溶液，水或 生理鹽水的加入量為以使PEG-PCL-PEG濃度為15wt% 40wt%為宜，較優為15wt% 35wt%，最優為25wt%。再將B瓶和A瓶的均勻混合形成混合溶液，然后將該混合溶液進 行皮下注射。皮下注射后一段時間將形成凝膠，凝膠緩慢降解，釋放其裝載的抗原及多糖成 分。當然，PEG-PCL-PEG共聚物與抗原成分的相對用量主要是滿足能夠在形成凝膠后 有較好的包封率，而這是可以在一個較大的范圍內波動的。如使用lOOul復合物溶液進行 疫苗注射，則其中可有15 35mg PEG-PCL-PEG共聚物，優選25mg ；抗原成分(bFGF或其缺 失部分氨基酸殘基但是仍具備與受體結合活性的bFGF短肽)15 25 y g，優選20 u g。如果添加多糖成分，則其與抗原成分的重量比為1 0.2-5，優選比例為1 2。上述技術方 案中使用的其缺失部分氨基酸殘基但是仍具備與其活性的bFGF短肽可為N’-KRLYCKNGGFF LRIHPDGRVDGVREKSDPHIKLQLQAEERGVV SIKGVCANRYLAMKEDGRLLASKCVTDECFFFERLESNNYNTY-C，。本發明所解決的第三個技術問題是提供了由上述的復合物添加藥學上所接受的 輔助性成分制備而成疫苗。本發明還提供了制備上述的復合物的方法，其方法在于包括以下步驟將PECE共 聚物溶解于水或生理鹽水中，冷卻至4°C形成溶液；將所需量的抗原(如堿性成纖維細胞生 長因子)和多糖(如甘露聚糖)加入至PECE溶液中形成均勻溶液。當上述復合物中含有多糖時，制備方法為將PECE共聚物溶解于水或生理鹽水 中，冷卻至4°C形成溶液；將所需量的抗原(如堿性成纖維細胞生長因子)加入至PECE溶 液中形成均勻溶液。本發明上述復合物及其制備方法中使用的堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)可以 是其全長蛋白，也可以是其缺失部分氨基酸殘基但是仍具備與堿性成纖維細胞生長因子同 樣的受體結合活性的bFGF短肽(tbFGF)。根據本發明的再一個方面，本發明裝載有bFGF的PEG-PCL-PEG三嵌段共聚物復合 物或裝載有bFGF和多糖的PEG-PCL-PEG三嵌段共聚物復合物可以作為腫瘤的抗血管生成 治療性疫苗和治療血管生成相關疾病的疫苗，也可再添加藥學上可以接受的輔助性成分制 備成上述疫苗。本發明的有益效果為本發明利用PEG-PCL-PEG三嵌段共聚物溶液作為免疫佐劑 裝載目標抗原形成復合物，同時復合物中還可以加入多糖成分。本發明復合物具有安全性 好、包封率接近100%、批間差異小、成本低、制備簡單、使用方便，能在體內形成凝膠緩慢釋 放等優點。并且實驗證明使用PECE佐劑可以達到作為免疫佐劑研發標準的弗氏佐劑的水 平，具有很好的免疫效果，為免疫佐劑的使用提供了新的選擇。


圖1、裝載有 bFGF (200 u g/ml)的 PECE 水凝膠(25wt % )的 SEM 照片。圖2、bFGF從bFGF-PECE水凝膠中釋放出來的釋放曲線。A :bFGF載藥量對其釋放 行為的影響；B :SDS-PAGE實驗表明bFGF從BFGF-PECE水凝膠中釋放出來后其結構完整，泳 道1 標記物；泳道2 標準的bFGF ；泳道3 24小時；泳道4 72小時；泳道5 168小時；泳 道6 336小時。圖3、皮下免疫NS (生理鹽水)、空白PECE水凝膠、純的bFGF、載有bFGF的PECE水 凝膠復合物的各組在免疫后第四周的抗體滴度比較。老鼠是在第0周免疫一次，并在第四 周收集血清。生理鹽水組的IgG滴度被設為1。圖4、由單獨bFGF以及載有bFGF的PECE水凝膠復合物所產生的IgG抗體滴度隨 著時間的變化曲線。圖5、免疫tbFGF各組小鼠肺重比較。圖6、免疫tbFGF各組小鼠肺轉移灶的比較。圖7、本發明PEG-PCL-PEG共聚物的合成反應示意圖，其中的X、Y均為正整數。
具體實施例方式以下結合附圖通過對具體實施方式
的描述以詳細說明但不限制本發明。實施例一 PEG-PCL-PEG共聚物的合成和驗證1) PEG-PCL-PEG 共聚物的合成本發明PEG-PCL-PEG共聚物的合成反應路線如圖7所示，其中的X、Y均為正整數。 根據該合成路線，在裝有攪拌器的三口燒瓶中加入一定量的聚乙二醇單甲醚(MPEG)和￡ -己 內酯(￡ -CL)，以辛酸亞錫為催化劑，在130°C、氮氣保護的條件下反應6小時，降溫至80°C， 加入交聯劑異氟爾酮二異氰酸酯(IPDI)再繼續反應6小時后得到產物，冷卻至室溫提純，烘 干。此外，適合的二異氰酸酯還包括甲苯二異氰酸酯、六亞甲基二異氰酸酯(HMDI)、L-lysine ethyl ester diisocyanateOJH，賴氨酸乙酯二異氰酸酯)、二苯基甲烷_4，4，- 二異氰酸酯 等。在進行上述反應時可以用上述二異氰酸酯替代IPDI進行偶聯反應。根據上述方法，合成了 E550—C2200_E550、E750_C3000_E75o、E750—C2500—E750、E750—C750—E750、E20oO_C4000_E2000 等系歹ll 共
物(見表1)。表1合成的PEG-PCL-PEG共聚物 a根據投料比計算出來的理論值b根據核磁共振氫譜測試結果計算出來的數值；2、PEG-PCL-PEG 共聚物的驗證(1)、本發明PEG-PCL-PEG共聚物的表征方法用傅里葉紅外光譜儀(FTIR) (200SXV，Nicolet)，采用KBr壓片法對合成的共聚物 進行紅外光譜分析。t-NMR用核磁共振儀(Varian 400,Varian)測量，在400MHZ下，溶劑為 ⑶Cl3，以四甲基硅烷為內標。各種PEG-PCL-PEG三嵌段共聚物的分子量和PEG與PCL的嵌 段比例根據核磁共振氫譜檢測來確定。根據上述試驗結果可以得出結論本實施例已經成
？t) itfe^pTj^C 了 Sifef^^J E550—C2200_E550、￡750"C3000—E750、E750—C2500_E750、E75o—C750—E750、E2000_C4000_E20OO
的PEG-PCL-PEG三嵌段共聚物。實施例二以PEG-PCL-PEG共聚物(PECE)作為佐劑的疫苗的制備將PECE共聚物溶解于生理鹽水中，然后冷卻至4°C形成溶液。將所需量的bFGF 或tbFGF加入至PECE溶液中形成均勻溶液即得疫苗，其中PECE共聚物的濃度控制在 15wt% 40wt%為宜，較優為15wt% 35wt%，25wt%左右最佳。實際使用時將該溶液行皮下注射，稍后會在皮下成為凝膠。本實施例制備的疫苗是在100 u LPEG-PCL-PEG-bFGF復合物中，含有20 y g的bFGF 或tbFGF、25mg的PECE共聚物，溶劑為生理鹽水，生理鹽水的用量為使體系PECE濃度為 25%。其使用后形成的凝膠的微觀結構見圖1。本實例同時進行了在pH為7.4的磷酸鹽緩沖溶液中的釋放實驗。bFGF從 bFGF-PECE水凝膠復合物中釋放出來的釋放曲線見圖2。其中A:bFGF載藥量對其釋放行為 的影響；B :SDS-PAGE實驗表明bFGF從bFGF-PECE (E55(1-C22(1c1-E55(1)水凝膠中釋放出來后其結 構完整，泳道1 標記物泳道2 標準的bFGF ；泳道3 24小時；泳道4 72小時；泳道5 168 小時；泳道6 336小時。結果表明其釋放行為較好，釋放出的bFGF結構完整。實施例三PEG-PCL-PEG抗原復合物動物免疫實驗材料重組人bFGF購自R&D公司，純度大于97 %。tbFGF為自行構建載體表達制 備的，純度大于 99% (該多肽的序列為N，-KRLYCKNGGFFLRIHPDGRVDGVREKSDPHIKLQLQAEE RGVVSIKGVCANRYLAMKEDGRLLASKCVTDECFFFERLESNNYNTY-C，，具體序列及制備過程參見中國 專利申請200810304731. X，“成纖維生長因子受體介導的血管靶向脂質體載體及制備方法 和用途”)。甘露聚糖購自SIGMA公司，產品編號M7504。本實例的試驗組中，使用的動物為6周大小的雌性BALB/c小鼠，每組6只，bFGF的 使用量均為20 u g。載有bFGF的PECE復合物組是在100 u L復合物中，含有20 y g的bFGF、 40 ug的甘露聚糖、25mg的PECE共聚物(E55(1-C22(1(1-E55C1)，溶劑為生理鹽水，生理鹽水的用量 為使體系PECE濃度為25%，其余各組的生理鹽水用量參照確定。處理方法是在第0周進行單獨bFGF組和載有bFGF的PECE復合物組免疫后，每隔 兩周抽血用ELSA法檢查其抗體滴度。皮下免疫NS (生理鹽水)、空白PECE共聚物、單獨的bFGF、載有bFGF的PECE復合 物的各組的抗體滴度比較值見圖3。結果表明載有bFGF的PECE復合物組的抗體滴度遠遠 高于單獨的bFGF。由單獨bFGF以及載有bFGF的PECE水凝膠復合物所產生的IgG抗體滴度隨著時 間的變化曲線見圖4。結果表明載有bFGF的PECE復合物組各時間段的抗體滴度均遠高于 單純的bTOF組。實施例四PEG-PCL-PEG抗原復合物抗腫瘤作用研究以下的試驗組中，使用的動物老鼠6周大小的雌性C57BL/6J小鼠，每組6只， tbFGF的使用量均為20 u g。載有tbFGF的PECE復合物組為在100 u L復合物中，含有20 y g 的tbFGF、40 u g的甘露聚糖、25mg的PECE共聚物(E55(1-C22(1(1-E55C1)，溶劑為生理鹽水，生理鹽 水的用量為使體系PECE濃度為25%，其余各組的生理鹽水用量參照確定。處理方法是在第0、2、4周進行tbFGF復合有弗氏佐劑組(FA_tbFGF)和載有tbFGF 的PECE復合物組(Hy-tbFGF)免疫后，第5周尾靜脈接種3X 105LL/2結腸癌細胞。第18天 后處死小鼠，稱取肺重，計算肺結節數以說明其轉移灶的情況。圖5顯示各組小鼠的肺重，FA-tbFGF組和Hy-tbFGF組的小鼠肺重明顯低于生理 鹽水組，差異具有顯著性(P < 0. 01)。圖6顯示各組小鼠的肺結節數，同樣，FA-tbFGF組和 Hy-tbFGF組的肺結節數遠低于生理鹽水組，具有顯著性差異(P<0.01)。結果表明，使用 PECE佐劑的tbFGF可以達到使用弗氏佐劑(免疫佐劑金標準)的tbFGF的抗腫瘤水平。
權利要求
PEG PCL PEG三嵌段共聚物作為免疫佐劑的用途。
2.PEG-PCL-PEG三嵌段共聚物作為免疫佐劑裝載目標抗原制成的復合物。
3.根據權利要求2所述的復合物，其特征在于所述PEG-PCL-PEG共聚物，其分子量為 1500 10000，其中PEG鏈段的分子量與PCL鏈段的分子量的比值為0. 4 2. 6。
4.根據權利要求3所述的復合物，其特征在于所述PEG-PCL-PEG共聚物分子量為 2000 8000，其中PEG鏈段的分子量與PCL鏈段的分子量的比值為0. 5 2。
5.根據權利要求3所述的復合物，其特征在于所述的PEG-PCL-PEG共聚物為 ^550—C22oo—E550^ E750_C3000_E750、E75O—C25OO—E75Q^ E750—C750—E750^ E20oo_C^qo"E20oo ；其中 E 表不 PEG，C 表示PCL，下標分別表示相應鏈段的分子量。
6.根據權利要求2 5任一項所述的復合物，其特征在于所述PEG-PCL-PEG三嵌段 共聚物的用量為使其在形成的凝膠中的比例為15wt% 40wt%。
7.根據權利要求2 6任一項所述的復合物，其特征在于所述目標抗原為腫瘤生長 因子類多肽。
8.根據權利要求7所述的復合物，其特征在于所述目標抗原為堿性成纖維細胞生長 因子或其具備抗原性的短肽。
9.根據權利要求2 8任一項所述的復合物，其特征在于還含有多糖成分。
10.根據權利要求9所述的復合物，其特征在于所述多糖為甘露聚糖。
11.權利要求9或10所述的復合物，其特征在于bFGF蛋白或短肽與多糖的重量比例為 1 0. 2-5。
12.根據權利要求9 11任一項所述的復合物，其特征在于是將目標抗原、 PEG-PCL-PEG共聚物、多糖溶解于水或生理鹽水中后，再冷凍干燥形成的粉末。
13.疫苗，由權利要求2 12任一項所述的復合物添加藥學上所接受的輔助性成分制 備而成。
14.制備權利要求2 8任一項所述的復合物的方法，其特征在于包括以下步驟將 PECE共聚物溶解于水或生理鹽水中，冷卻至4°C形成溶液；將所需量的bFGF或短肽加入至 PECE溶液中形成均勻溶液。
15.制備權利要求10 11任一項所述的復合物的方法，其特征在于包括以下步驟將 PECE共聚物溶解于水或生理鹽水中，冷卻至4°C形成溶液；將所需量的bFGF或短肽和多糖 加入至PECE溶液中形成均勻溶液。
16.權利要求12所述復合物的使用方法，步驟為將所需量水或生理鹽水注射入復合物 粉末的包裝中，配制成均勻溶液，裝入注射器備用。
17.根據權利要求2 11任一項所述的復合物，其特征在于含有兩分離的組分，A組 分是PEG-PCL-PEG共聚物或PEG-PCL-PEG共聚物與多糖溶解于水或生理鹽水中后，再冷凍 干燥成的粉末，B組分是目標抗原，A組分可裝于A包裝中；B組分裝于B包裝中。全文摘要
本發明屬于生物制劑領域，涉及PEG-PCL-PEG三嵌段共聚物作為免疫佐劑在制備蛋白多肽疫苗中的應用。上述PEG-PCL-PEG共聚物，其分子量為1500～10000，其中PEG鏈段的分子量與PCL鏈段的分子量的比值為0.4～2.6。上述目標抗原為腫瘤生長因子類多肽，且上述復合物還可含有多糖成分。本發明復合物具有安全性好、包封率接近100％、批間差異小、成本低、制備簡單、使用方便等優點，具有好的應用前景。
文檔編號A61K39/39GK101890162SQ20101024162
公開日2010年11月24日 申請日期2010年7月30日 優先權日2009年7月31日
發明者楊莉, 趙霞, 錢志勇, 魏于全 申請人:四川大學