專利名稱：：一種新的抗腫瘤化合物及其制備方法
技術領域：
：本發明涉及一種藥物化合物，特別涉及抗腫瘤的天然化合物修飾的衍生物，確切地說是喜樹堿新的衍生物作為新的抗腫瘤化合物及其制備方法。
背景技術：
：喜樹堿是從我國栱桐科植物中提取得到的一種生物堿，具有很強的抗腫瘤活性。其結構如下但喜樹堿本身由于毒副作用較大，其應用受到限制，而它的衍生物中已有多種活性高，而毒性較小的新化合物已被合成，其中數十種已進入各期臨床試驗，少數已被批準用于臨床治療。例如伊立替康(Irrinotican)和拓撲替康(Topotican)等。在喜樹堿的E內酯環開環的衍生物中也發現一些活性與喜樹堿相當或更好，而毒性比喜樹堿小的新化合物(參見J.P.A.H1,131,179；CN1126212A；US006,121,277A)。申請人在分析、比較喜樹堿構效關系的研究中，用N-(3-氨基丙基)嗎啉或4-(3-氨基丙基)咪唑對E內酯環進行氨解開環、并利用嗎啉基和咪唑基的堿性與酸形成藥學上可以接受的鹽，以及進一步將17-位羥基酯化和9，10，11-位上有鹵原子、羥基或烷氧基取代所形成的系列化合物申請了中國專利(CN1803799A、CN1821247A、CN1821245A)。
發明內容本申請旨在提供一種抗腫瘤活性更強的化合物，所要解決的技術問題是基于對喜樹堿構效關系系統研究的認識將7-位上有親脂取代基、9，10，11-位上有鹵原子、羥基或烷氧基等取代基以及E內酯環氨解開環或17-位羥基進一步酯化共同形成新的喜樹堿衍生物。本發明所稱的新的抗腫瘤化合物是一種新的喜樹堿衍生物，其化學結構如下式中R1代表C1-C6的直鏈或支鏈烷基或C3-C8的環烷基；R2代表9、10或11-位上的0-3個相同或不同的取代基，這些取代基選自鹵原子、硝基、氨基、羥基或烷氧基，如F、Cl、Br、NO2、NH2、OH、OMe、OEt；R3代表氫原子或R4CO-；R4代表C1-C4的直鏈或支鏈烷基、甲氧基亞烷基或甲氨基亞烷基和二甲氨基亞烷基，如-CH3、-(CH2)nCH3、-(CH2)nOCH3、-(CH2)nNHCH3、-(CH2)nN(CH3)2，后4個式中n＝1-3。優選的化合物是R1代表-CH3、-CH2CH3或環戊基；R2代表9-NO2、9-NH2、10-OH、10-OCH3、10-F或11-OH；R3代表氫原子或R4CO-；R4代表C1-C4的直鏈或支鏈烷基。最優選的化合物是R1代表-CH2CH3或環戊基；R2代表10-OH；R3代表H或R4CO-；R4代表-CH3或-CH2CH3。優選以下化合物7-乙基-10，17-二羥基-21-N[3-(1-嗎啉基)丙基]酰胺E環開環喜樹堿，7-環戊基-10，17-二羥基-21-N[3-(1-嗎啉基)丙基]酰胺E環開環喜樹堿，7-乙基-10-羥基-17-乙酰氧基-21-N[3-(1-嗎啉基)丙基]酰胺E環開環喜樹堿，7-環戊基-10-羥基-17-乙酰氧基-21-N[3-(1-嗎啉基)丙基]酰胺E環開環喜樹堿，7-乙基-10-羥基-17-丙酰氧基-21-N[3-(1-嗎啉基)丙基]酰胺E環開環喜樹堿，7-環戊基-10-羥基-17-丙酰氧基-21-N[3-(1-嗎啉基)丙基]酰胺E環開環喜樹堿。本發明的另一方面涉及式(I)化合物的制備方法，制備反應可用如下簡圖表示由式2化合物與式3化合物反應得到式4化合物，式4化合物在堿性條件下與適當的酰化試劑反應得式5化合物。該制備方法包括以下步驟(1)、將化合物2溶于強極性的溶劑中，再加入化合物3于70-80℃條件下進行反應，直至體系澄清；所述的強極性溶劑包括甲醇，乙醇；(2)、將(1)中得到的反應混合物倒入弱極性的溶劑中，使產物4以沉淀的方式析出；所述的弱極性溶劑包括乙醚、石油醚以及C5-C8的飽和烷烴或環烷烴；(3)、將(2)中獲得的產物4在吡啶存在下與酰化試劑在15-40℃溫度下反應過夜，主要生成化合物5，同時也有少量10-位羥基酰基化的副產物；(4)、將(3)中所得的反應混合物蒸去低沸點溶劑，剩余物倒入乙醚中，析出淡黃色固體粗產物；(5)、將(4)中所得粗產物用硅膠柱層析純化得純度≥98％的式5化合物。洗脫劑可為石油醚∶乙酸乙酯＝1∶1→4∶1。式(1)化合物的用途是在制備抗腫瘤藥物中的應用。所述的腫瘤是肺癌、肝癌、胃癌、食道癌、乳腺癌、卵巢癌或白血病等。所述的藥物是式(1)原藥與藥劑學上允許的各種輔料加工的制劑。具體實施例方式以下通過實施例進一步說明本發明實施例一7-乙基-10-羥基喜樹堿氨解開環產物4a的制備98mg(0.25mmol)7-乙基-10-羥基喜樹堿2a與5當量的氨解試劑N-(3-氨基丙基)嗎啉3和5ml甲醇混合，于80℃下反應12小時后，體系變澄清，將反應混合物逐滴加入乙醚中，析出黃色沉淀，濾出沉淀，用冷乙醚洗滌。由TLC可看出，產物中含有未反應的原料2a。將產物溶于少量CHCl3，用氧化鋁柱層析分離(洗脫劑∶乙酸乙酯∶石油醚＝1∶1→4∶1)得純的開環產物4a113mg，產率81％。IR(KBr)v1655.24cm-1(-CONH-)。1HNMR(CDCl3，300MHz)δppm1.08(t，J＝7.20Hz，3H，18-CH3)，1.29(t，J＝7.23Hz，3H，7-CH2CH3)，1.79(m，2H，19-CH2)，2.25(m，1H，23-CH2)，2.43(m，1H，23-CH2)，2.44(m，6H，24-CH2，and2×25-CH2)，3.07(q，2H，7-CH2CH3)，3.41(m，2H，22-CH2)，3.75(m，4H，2×26-CH2)，4.88(q，JAB＝12.70Hz，2H，17-CH2)，5.04(s，2H，5-CH2)，7.48(s，1H，14-H)，7.56(s，1H，9-H)，7.67(d，J＝5.32Hz，1H，11-H)，7.97(d，J＝5.83Hz，1H，12-H)，8.20(s，1H，NH)，9.72(br，1H，10-OH)。實施例二7-環戊基-10-羥基喜樹堿的氨解開環產物4b的制備433mg7-環戊基-10-羥基喜樹堿2b(1mmol)與5當量的N-(3-氨基丙基)嗎啉3和5mL甲醇混合，加熱至75℃，攪拌反應14小時，反應液變為澄清，將反應混合物逐滴加入乙醚中，析出黃色沉淀，濾出沉淀，用冷乙醚洗滌。粗產物溶于少量CHCl3，用氧化鋁柱層析分離(洗脫劑∶乙酸乙酯∶石油醚＝1∶1→1∶4)得純的開環產物4b483mg，產率90％。IR(KBr)v1651.08cm-1(-CONH-)。1HNMR.(CDCl3，300MHz)δppm1.06(t，J＝6.44Hz，3H，18-CH3)，2.05(m，2H，19-CH2)，2.06(m，1H，環戊基1’-CH)，2.24(m，4H，環戊基2×2’-CH2)，2.25(m，1H，23-CH2)，2.43(m，1H，23-CH2)，2.44(m，6H，24-CH2，and2×25-CH2)，3.41(m，2H，22-CH2)，3.75(m，4H，2×26-CH2)，3.86(m，4H，環戊基2×3’CH2)，4.92(dd，JAB＝12.64Hz，2H，17-CH2)，5.04(s，2H，5-CH2)，6.94(s，1H，)，7.48(s，1H，14-H)，7.56(s，1H，9-H)，7.67(d，J＝5.20Hz，1H，11-H)，7.97(d，J＝5.47Hz，1H，12-H)，8.20(s，1H，NH)，9.72(br，1H，10-OH)。實施例三4a的17-羥基乙酰化產物5a的制備537mg7-乙基-10-羥基喜樹堿氨解開環產物4a(1mmol)溶于1mL(12.4mmol)吡啶中，加入0.15mL(1.5mmol)乙酸酐，加熱使溫度維持在40℃左右，攪拌過夜，TLC表明除生成預期的產物5a外，有少量10，17-羥基同時乙酰化的副產物生成。減壓蒸去溶劑。殘留物用少量的CHCl3溶解，倒入20mL石油醚乙醚等體積比的混合液中，析出沉淀，過濾，冷乙醚洗滌。再用CHCl3溶解，硅膠柱層析純化(洗脫劑∶乙酸乙酯∶石油醚＝2∶1→純乙酸乙酯)，得黃色的固體粉末5a409mg。產率70.5％。IR(KBr)v1734.73cm-1(-CH3COO-)，1620.38cm-1(-CONH-)。1HNMR(CDCl3，300MHz)δppm1.10(t，J＝7.17Hz，3H，18-CH3)，1.28(t，J＝7.34Hz，3H，7-CH2CH3)，1.77(m，2H，19-CH2)，2.06(s，3H，-CO-CH3)，2.30(m，1H，23-CH2)，2.52～2.54(m，7H，24-CH2，2×25-CH2，1/2×23-CH2)，3.03(q，J＝7.35Hz，2H，7-CH2CH3)，3.31～3.42(m，2H，22-CH2)，3.78(d，J＝4.38Hz，4H，26-CH2)，5.15(q，J＝19.41Hz，2H，5-CH2)，5.47(dd，JAB＝11.58Hz，2H，17-CH2)，7.58(s，1H，14-H)，7.63(s，1H，9-H)，7.69(d，J＝7.23Hz，1H，11-H)，8.04(d，J＝8.34Hz，1H，12-H)，8.17(s，1H，NH)，9.83(br.，1H，10-OH)。實施例四4b的17-羥基乙酰化產物5b的制備7-環戊基-10-羥基喜樹堿氨解開環產物4b577mg(1mmol)溶于1mL(12.4mmol)吡啶中，加入0.15mL(1.5mmol)乙酸酐，加熱使溫度維持在40℃左右，攪拌過夜，減壓蒸去溶劑，殘留物用少量的CHCl3溶解，倒入20mL石油醚乙醚等體積比的混合液中，析出沉淀，過濾，冷乙醚洗滌，再用CHCl3溶解，硅膠柱層析純化(洗脫劑∶乙酸乙酯∶石油醚＝2∶1→純乙酸乙酯)，得5b黃色固體粉末463mg。產率75％。IR(KBr)v1732.63cm-1(-CO-CH3)，1622.17cm-1(-CONH-)。1HNMR(CDCl3，300MHz)δppm1.10(t，J＝7.17Hz，3H，18-CH3)，1.77(m，2H，19-CH2)，2.06(s，3H，CH3COO-)，2.05(m，1H，環戊基1’-CH2)，2.24(m，4H，環戊基2×2’-CH2)，2.30(m，1H，23-CH2)，2.52～2.54(m，7H，24-CH2，2×25-CH2，1/2×23-CH2)，3.31～3.42(m，2H，22-CH2)，3.78(d，J＝4.38Hz，4H，26-CH2)，3.86(m，4H，環戊基2×3’CH2)，5.15(q，J＝19.41Hz，2H，5-CH2)，5.47(dd，JAB＝11.58Hz，2H，17-CH2)，7.58(s，1H，14-H)，7.63(d，J＝8.11Hz，1H，9-H)，7.69(d，J＝7.23Hz，1H，11-H)，8.04(d，J＝8.34Hz，1H，12-H)，8.17(s，1H，NH)，9.83(br.，1H，10-OH)。實施例五4a的17-羥基丙酰化產物5c的制備537mg7-乙基-10-羥基喜樹堿氨解開環產物4a(1mmol)溶于1mL(12.4mmol)吡啶中，加入0.2mL(1.6mmol)丙酸酐，加熱使溫度維持在40℃左右，攪拌過夜，蒸去低沸點溶劑，剩余物倒入50mL乙醚，析出淡黃色固體，經硅膠柱層析進一步純化(洗脫劑∶乙酸乙酯∶石油醚＝1∶1→3∶1)得5c純產品362mg，產率61％。IR(KBr)v1729.83cm-1(-COCH2CH3)，1654.52cm-1(-CONH-)。1HNMR.(CDCl3，300MHz)δppm1.11(t，J＝7.23Hz，3H，18-CH3)，1.21(t，J＝7.05Hz，3H，CH3CH2COO-)，1.27(t，J＝7.28Hz，3H，7-CH2CH3)，1.77(m，2H，19-CH2)，2.31(m，1H，1/2×23-CH2)，2.15～2.40(m，1H，1/2×23-CH2)，2.55～2.56(m，6H，24-CH2and2×25-CH2)，3.05(q，J＝7.31Hz，2H，7-CH2CH3)，3.32(m，1H，1/2×22-CH2)，3.44(m，1H，1/2×22-CH2)，3.48(q，J＝6.99Hz，2H，CH3CH2COO-)，3.79(t，J＝4.50Hz，4H，2×26-CH2)，5.13(q，J＝19.17Hz，2H，5-CH2)，5.47(q，J＝AB＝11.58Hz，2H，17-CH2)，7.57(s，1H，14-H)，7.60(s，1H，9-H)，7.68(d，J＝7.51，1H，11-H)，8.03(d，J＝8.46，1H，12-H)，8.21(s，1H，NH)，9.76(br.，1H，10-OH)。實施例六4b的17-羥基丙酰化產物5d的制備7-環戊基-10-羥基喜樹堿氨解開環產物4b577mg(1mmol)溶于1mL(12.4mmol)吡啶中，加入0.2mL(1.6mmol)丙酸酐，加熱使溫度維持在40℃左右，攪拌過夜蒸去低沸點溶劑，剩余物倒入50mL乙醚，析出淡黃色固體，經硅膠柱層析進一步純化(洗脫劑∶乙酸乙酯∶石油醚＝1∶1→3∶1)得5d純產品421mg，產率66.5％。IR(KBr)v1729.83cm-1(-COCH2CH3)，1654.52cm-1(-CONH-)1HNMR.(CDCl3，300MHz)δppm1.11(t，J＝7.23Hz，3H，18-CH3)，1.21(t，J＝7.05Hz，3H，CH3CH2COO-)，1.77(m，2H，19-CH2)，2.05(m，1H，環戊基1’-CH2)，2.24(m，4H，環戊基2×2’-CH2)，2.31(m，1H，1/2×23-CH2)，2.40～2.15(m，1H，1/2×23-CH2)，2.55～2.56(m，6H，24-CH2and2×25-CH2)，3.32(m，1H，1/2×22-CH2)，3.44(m，1H，1/2×22-CH2)，3.48(q，J＝6.99Hz，2H，CH3CH2COO-)，3.79(t，J＝4.50Hz，4H，2×26-CH2)，3.86(m，4H，環戊基2×3’-CH2)，5.13(q，J＝19.17Hz，2H，5-CH2)，5.47(q，J＝AB＝11.58Hz，2H，17-CH2)，7.57(s，1H，14-H)，7.60(d，J＝8.10，1H，9-H)，7.68(t，J＝7.51，1H，11-H)，8.03(d，J＝8.46，1H，12-H)，8.21(s，1H，NH)，9.76(br.，1H，10-OH)。實施例七5a化合物的鹽酸鹽的制備將0.5g5a化合物溶于20ml甲醇中，逐滴滴加20％鹽酸溶液至PH中性，蒸除溶劑，殘留物用乙醇重結晶得亮黃色5a化合物的鹽酸鹽晶體401mg，mp244-246℃。實施例八5d化合物的對甲苯磺酸鹽的制備將0.53g5d化合物溶于30ml氯仿中，加入等摩爾對甲苯磺酸，加熱攪拌至固體完全溶解，蒸除溶劑，殘留物用乙醇重結晶得淺黃色5d化合物的對甲苯磺酸鹽晶體447mg，mp233-236℃.本發明喜樹堿衍生物的抗腫瘤活性實驗1、實驗方法MTT法1).取處于指數生長期狀態良好的細胞一瓶，加入0.25％胰蛋白酶消化液，消化使貼壁細胞脫落，計數2～4×10-4個/mL，制成細胞懸液。2).取細胞懸液接種于96孔板上，180μl/孔，置恒溫CO2培養箱中培養24小時。3).換液，加入受試藥物，20μl/孔，培養48小時。4).將MTT加入96孔板中，20μl/孔，培養箱中反應4小時。5).吸去上清夜，加入DMSO，150μl/孔，平板搖床上振搖5分鐘。6).用酶聯免疫檢測儀在波長為570nm處測定每孔的吸光值，并計算細胞抑制。體外抗腫瘤作用篩選中，不同類型受試物的陽性作用判斷標準見下表<tablesid="table1"num="001"><tablewidth="763">已知分子量化合物(mol/L)未知化合物μg/ml粗提物μg/ml細胞抑制率％活性1×10-71×10-61×10-5110100220200≥50≥50≥50+++強效1×10-71×10-61×10-5110100220200＜50≥50≥50++中效1×10-71×10-61×10-5110100220200＜50＜50≥50+弱效</table></tables>2、受試細胞株選用人肺癌細胞A549，人低分化胃腺癌細胞BGC-823，人肝癌細胞SMMC-7721，人幼粒細胞白血病細胞HL-60四個細胞株。3、實驗結果表中4a-b，5a-d分別代表本發明各化合物7-乙基-10，17-二羥基-21-N[3-(1-嗎啉基)丙基]酰胺E環開環喜樹堿4a，7-環戊基-10，17-二羥基-21-N[3-(1-嗎啉基)丙基]酰胺E環開環喜樹堿4b，7-乙基-10-羥基-17-乙酰氧基-21-N[3-(1-嗎啉基)丙基]酰胺E環開環喜樹堿5a，7-環戊基-10-羥基-17-乙酰氧基-21-N[3-(1-嗎啉基)丙基]酰胺E環開環喜樹堿5b，7-乙基-10-羥基-17-丙酰氧基-21-N[3-(1-嗎啉基)丙基]酰胺E環開環喜樹堿5c，7-環戊基-10-羥基-17-丙酰氧基-21-N[3-(1-嗎啉基)丙基]酰胺E環開環喜樹堿5d。本發明各化合物靜脈給藥對小鼠的急性毒性試驗急性毒性試驗，本發明各化合物經小鼠靜脈注射(iv)給藥，所得結果按Bliss法計算，各化合物的的LD50值列于下表其95％的置信限為257.7～353.2mg/kg。小鼠的中毒癥狀表現為攝食減少，自發活動明顯下降，腹臥，眼瞼下垂，對外界刺激反應遲鈍，動物安靜而亡。最高劑量組給藥3h后即出現動物死亡，各劑量組動物死亡均發生在48h內，約48小時后，小鼠活動開始增加并恢復正常。死亡小鼠肉眼尸檢，臟器未見明顯病變。總之，式(1)化合物具有高的抗癌活性和低毒性。此外，其中4a和4b有很好的水溶性性，5a-5d轉變成相應的鹽，也有很好的水溶性，從它們中有望發展出更有效的抗腫瘤藥物制劑。權利要求1.一種新的抗腫瘤化合物，其特征在于如下結構式(1)所示的喜樹堿衍生物式中R1代表C1-C6的直鏈或支鏈烷基或C3-C8的環烷基；R2代表9、10或11-位上的0-3個相同或不同的取代基，這些取代基選自鹵原子、硝基、氨基、羥基或烷氧基；R3代表氫原子或R4CO-；R4代表C1-C4的直鏈或支鏈烷基、甲氧基亞烷基或甲氨基亞烷基和二甲氨基亞烷基。2.根據權利要求1所述的喜樹堿衍生物，其特征在于R1代表-CH3、-CH2CH3或環戊基；R2代表9-NO2、9-NH2、10-OH、10-OCH3、10-F或11-OH；R3代表氫原子或R4CO-；R4代表C1-C4的直鏈或支鏈烷基。3.根據權利要求1或2所述的喜樹堿衍生物，其特征在于R1代表-CH2CH3或環戊基；R2代表10-OH；R3代表H或R4CO-；R4代表-CH3或-CH2CH3。4.根據權利要求3所述的喜樹堿衍生物，其特征在于是如下化合物7-乙基-10，17-二羥基-21-N[3-(1-嗎啉基)丙基]酰胺E環開環喜樹堿，7-環戊基-10，17-二羥基-21-N[3-(1-嗎啉基)丙基]酰胺E環開環喜樹堿，7-乙基-10-羥基-17-乙酰氧基-21-N[3-(1-嗎啉基)丙基]酰胺E環開環喜樹堿，7-環戊基-10-羥基-17-乙酰氧基-21-N[3-(1-嗎啉基)丙基]酰胺E環開環喜樹堿，7-乙基-10-羥基-17-丙酰氧基-21-N[3-(1-嗎啉基)丙基]酰胺E環開環喜樹堿，7-環戊基-10-羥基-17-丙酰氧基-21-N[3-(1-嗎啉基)丙基]酰胺E環開環喜樹堿。5.由權利要求1所述的化合物的制備方法，其特征在于，用式2化合物與式3化合物反應得到式4化合物，式4化合物在堿性條件下與酸酐或酰氯反應得式5化合物，6.根據權利要求5所述的制備方法，其特征在于經過以下步驟(1)、將式2的化合物溶于強極性的溶劑中，再加入式3式化合物，于70-80℃條件下進行反應，直至體系澄清；所述的強極性溶劑包括甲醇，乙醇；(2)、將(1)中得到的反應混合物加入弱極性的溶劑中，使產物4以沉淀的方式析出；所述的弱極性溶劑包括乙醚、石油醚以及C5-C8的飽和烷烴或環烷烴；(3)、將(2)中獲得的產物4在吡啶溶劑中與1當量酸酐或酰氯于15～40℃下反應過夜；(4)、將(3)中所得的反應混合物蒸去低沸點溶劑，剩余物倒入乙醚中，析出淡黃色固體產物5；(5)、將(4)中所得粗產物用硅膠柱層析純化可得純度大于98％的目標化合物；洗脫劑為石油醚∶乙酸乙酯＝1∶1→4∶1。7.由權利要求1所述的化合物的用途是在制備抗腫瘤藥物中的應用。8.根據權利要求7所述的抗腫瘤用途，所述腫瘤是肺癌，肝癌，胃癌，食道癌，乳腺癌，卵巢癌或白血病。全文摘要一種抗腫瘤化合物是喜樹堿衍生物。以7－位上有親脂取代基、9，10，11－位上有鹵原子、羥基等取代基的喜樹堿為起始原料，首先用N－(3－氨基丙基)嗎啉打開E內酯環，然后或者將17－位羥基進一步酯化得到的新喜樹堿衍生物。本化合物毒性低、抗癌活性高，有望開發出更有效的抗腫瘤藥物。文檔編號A61K31/5355GK101024644SQ20071002111公開日2007年8月29日申請日期2007年3月28日優先權日2007年3月28日發明者尤田耙,王宗貴,曾福星,耿燕申請人:耿燕