專利名稱：免疫刺激rna和hbv靶基因沉默rna的雙表達載體及其構建與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種免疫刺激RNA和HBV靶基因沉默RNA的雙表達載體，及其構建與 應用，屬于基因工程技術領域。
背景技術：
HBV感染可引起急、慢性肝炎，并且與肝硬化、肝癌的發病密切相關。而且，作為一 種能夠逃逸免疫監視的病毒，在感染的早期不能引起免疫反應，從而不被機體抗病毒系統 所清除。為HBV的治療帶來了挑戰。RNAi技術用于抗HBV治療，有望成為治療乙型肝炎的 革命性新方法。由于HBV復制具有以RNA為模板合成DNA的特點，只要阻斷RNA的合成就 能抑制DNA的復制，因此HBV感染特別適用于RNAi治療。并且某些RNA序列能夠激活免疫 系統，誘導抗病毒反應。因此設計并構建能夠表達靶向沉默HBV基因的RNA和能夠激活免 疫系統的RNA，是實現對HBV的治療的有效手段。

發明內容
針對上述現有技術，針對HBV生命周期的特點，本發明提供了一種免疫刺激RNA和 HBV靶基因沉默RNA的雙表達載體，以及其構建方法，及在制備抗HBV的藥物中的應用。本發明是通過以下技術方案實現的一種免疫刺激RNA和HBV靶基因沉默RNA的雙表達載體，是由轉錄shRNA的DNA 序列、轉錄ssRNA的DNA序列與pTZTO+Ι載體組成的重組載體，其序列如seq. 1所示。本發明的免疫刺激RNA和HBV靶基因沉默RNA的雙表達載體是通過以下方法構建 制得的(1)針對HBV χ基因的序列，人工設計合成shRNA相對應的DNA序列，并在序列的 兩端添加雙酶切位點Sal I和Xbal I，退火形成雙鏈結構，得表1所示的序列；表1人工設計合成shRNA相對應的DNA序列
(2)將PTZU6+1載體進行Sal I和Xbal I的雙酶切，并回收載體骨架；(3)將步驟⑴制得的序列與步驟⑵制得的PTZU6+1載體連接，構建pTZU-shRNA 重組載體；(4)利用陽離子脂質體Lipofectamine2000(購自invitrogen)將構建的
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4pTZU-shRNA轉染到HBV感染的人肝細胞系H印G2. 2. 15細胞，并檢測HBV χ基因的表達水 平，篩選具有較好沉默能力的shRNA序列的DNA序列；然后將篩選得到的pTZU-shRNA重組 載體進行EcoR I和Hind III雙酶切，得到U6+shRNA的表達框，其序列如seq. 2所示；(5)根據能夠激活免疫系統的RNA病毒序列，設計編碼具有潛在免疫刺激作用序 列的RNA的DNA序列，并在序列的兩端添加雙酶切位點序列EcoRI和BamHI，得表2所示的 序列；表2人工設計合成SSRNA相對應的DNA序列
權利要求
一種免疫刺激RNA和HBV靶基因沉默RNA的雙表達載體，其特征在于是由轉錄shRNA的DNA序列、轉錄ssRNA的DNA序列與pTZU6+1載體組成的重組載體，其序列如seq.1所示。
2.權利要求1所述的免疫刺激RNA和HBV靶基因沉默RNA的雙表達載體的構建方法， 其特征在于，步驟如下(1)針對HBVχ基因的序列，人工設計合成shRNA相對應的DNA序列，并在序列的兩端 添加雙酶切位點Sal I和Xbal I，退火形成雙鏈結構，得表1所示的序列；(2)將pTZU6+l載體進行SalI和XbalI的雙酶切，并回收載體骨架；(3)將步驟(1)制得的序列與步驟(2)制得的PTZU6+1載體連接，構建pTZU-shRNA重 組載體；(4)利用陽離子脂質體Lipofectamine2000將構建的pTZU-shRNA轉染到HBV感染的人 肝細胞系H印G2. 2. 15細胞，并檢測HBV χ基因的表達水平，篩選具有轉錄較好沉默能力的 shRNA序列的DNA序列；然后將篩選得到的pTZU-shRNA重組載體進行EcoR I和Hind III 雙酶切，得到TO+shRNA的表達框，其序列如seq. 2所示；(5)根據能夠激活免疫系統的RNA病毒序列，設計編碼具有潛在免疫刺激作用序列的 RNA的DNA序列，并在序列的兩端添加雙酶切位點序列EcoRI和BamH I，得表2所示的序 列；(6)將pSIREN載體進行EcoRI和BamH I雙酶切，并回收載體骨架；(7)將步驟(5)制得的序列與步驟(6)制得的pSIREN載體連接，構建pSIREN-ssRNA重 組載體；(8)利用陽離子脂質體Lipofectamine2000將構建的pSIREN-ssRNA轉染到小鼠巨 噬細胞系RAW264. 7、新鮮分離的小鼠肝淋巴細胞、人肝癌細胞系!fepG2和HBV感染細胞系 HepG2. 2. 15，并檢測細胞因子IFN的RNA水平和蛋白水平，篩選能夠激活免疫系統的表達載 體，得到的具有刺激作用的序列，然后將篩選得到的PSIREN-ssRNA重組載體進行EcoRI單 酶切，得線性片段；(9)將步驟(3)制得的TO+shRNA表達框和步驟(6)制得的線性片段平端化，連接，即得 到表達shRNA和ssRNA的雙表達載體，其序列如seq. 1所示。
3.權利要求1所述的免疫刺激RNA和HBV靶基因沉默RNA的雙表達載體在制備抗HBV 的藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種免疫刺激RNA和HBV靶基因沉默RNA的雙表達載體，是由轉錄shRNA的DNA序列、轉錄ssRNA的DNA序列與pTZU6+1載體組成的重組載體，其序列如seq.1所示。本發明的免疫刺激RNA和HBV靶基因沉默RNA的雙表達載體，轉染HepG2.2.15細胞，經Northern blot鑒定能夠在胞內表達；轉染HepG2.2.15細胞，24h后檢測，發現能夠下調HBV的表達；轉染HepG2.2.15細胞，24h后檢測，發現能夠下調上清中HBV抗原含量和胞內抗原含量；由此可見，本發明的免疫刺激RNA和HBV靶基因沉默RNA的雙表達載體能夠作為抗HBV的藥物應用。
文檔編號A61P1/16GK101979595SQ201010282600
公開日2011年2月23日 申請日期2010年9月16日 優先權日2010年9月16日
發明者蘭培祥, 張建, 張彩, 田志剛 申請人:山東大學