專利名稱：一種早代鑒定轉基因玉米純合體的方法
技術領域：
本發明涉及農業育種技術領域，尤其涉及的是一種早代鑒定轉基因玉米純合體的簡易方法。
背景技術：
玉米已成為全球種植面積最大的糧、經、飼三元谷類作物，隨著分子生物學和生物技術的發展，玉米轉基因技術已經成為研究玉米基因功能和創制高抗、優質、高產玉米新品種的重要手段之一。而鑒定目的基因純合的玉米轉化體是玉米轉基因技術中一個必不可少的環節。由于轉基因沉默現象的存在，人們往往選擇目的基因以單拷貝或低拷貝形式插入 的轉基因TO代進行下一步的純合體篩選。常規的方法是對TO代(轉基因當代)轉化體自交獲得Tl代轉基因植株，然后對每個獨立分離的Tl代轉基因植株產生的T2代個體進行轉基因分離比率的研究。通常采用PCR方法鑒定出T2代不再分離的轉基因株系(即不再出現不含目的基因植株的株系)，被鑒定為純合的轉基因株系，此方法不僅工作量大、而且成本高、周期長，不利于快速獲得純合的轉基因株系和轉基因玉米新品種的育成。2009年劉楠等建立了一種利用4個PCR引物的多重PCR反應來鑒定轉基因玉米純合體的方法，用該方法鑒定玉米轉基因純合體的前提條件是目的基因在玉米基因組DNA中插入位點序列已知。而弄清楚某個外源目的基因在植物基因組中的插入位點則是轉基因檢測中另外一個技術難題，且操作繁瑣，需要較長的周期，尤其是對一些研究體系不夠完善的科研單位。對于很多轉基因玉米而言，在Tl代尚未鑒定出目的基因在玉米基因組DNA的插入位點，因此該方法在早代鑒定出轉基因玉米純合體的應用上還受到很大的限制。2004年，杜春芳等提出了用基于TaqMan探針的雙重定量PCR技術來鑒定Tl代轉基因純合體。該技術在定量PCR反應體系中，加入2對PCR引物和TaqMan探針。第I對為擴增目的基因的引物和探針，另I對為擴增參考基因的引物和探針。而目的基因和參考基因TaqMan探針5’端標記了不同的熒光報告基團，可在同一 PCR反應中同時擴增目的基因和參考基因，根據熒光信號的強弱分別計算出樣品中目的就基因和參考基因的Ct值，繼而得出二者間的比例，并以此鑒定出純合的Tl代轉基因植株。基于TaqMan探針的雙重定量PCR技術的缺點主要表現在以下幾個方面，一是探針設計難度大，既要避免二級結構，又要嚴格控制GC含量，避免重復的核酸序列，避免引物與探針形成互補，否則極大影響擴增效率導致檢測結果不準確。其二，探針的合成和雙熒光標記成本高，且不能通過溶解曲線判斷擴增產物的特異性。其三，該方法主要用于鑒定雙子葉植物煙草和擬南芥轉基因純合體。而在不依賴于已知目的基因插入位點及側翼序列的情況下，如何快速、簡易地鑒定出轉基因玉米純合體，目前還未見相關方法報道。

發明內容
為解決針對傳統技術及現有相關技術的存在的缺點，發明了一種不依賴于目的基因在玉米基因組中插入位點，且低成本、高效率、操作簡易的轉基因玉米純合體的早代檢測方法，即基于SYBR Green I染料熒光定量PCR技術的轉基因玉米純合體早代鑒定方法。本發明技術方案如下
一種早代鑒定轉基因玉米純合體的方法，包括以下步驟A1、提取Tl代轉基因玉米DNA ;A2、選擇參照基因、設計目的基因和參照基因的PCR引物；A3、使用普通PCR方法對陽性Tl代轉基因植株進行預檢測；A4、證明基因特異擴增，獲得基因擴增效率;A5、計算目的基因在各Tl代植株中的相對含量;A6、檢出轉基因玉米純合體，當目的基因相對含量約等于I時，該植株為純合體；當基因相對含量約等于O. 5時，該植株為雜合體。SYBR Green I是一種結合于所有DNA雙螺旋小溝區域的具有綠色激發波長的染料。在游離狀態下，SYBR Green I發出微弱的熒光，但一旦與雙鏈DNA結合后，熒光大大增強。因此，SYBR Green I的熒光信號強度與雙鏈DNA的數量相關，在PCR反應過程中隨著擴增產物的積累熒光信號不斷增強，可以根據熒光信號強弱分辨樣品間僅2倍起始DNA和RNA水平上的差異。目前已廣泛用于檢測細胞mRNA表達量的變化以及比較不同組織或細胞中的mRNA表達差異。鑒于Tl代單拷貝轉基因株系中雜合體和純合體最本質的區別是，在雜合體中目的基因只存在于同源染色體的中的一條染色體，而純合體中目的基因則同時存在于同源染色體中的兩條染色體，即純合體中目的基因含量是雜合體中的2倍。這種差異可以被基于SYBR Green I染料的熒光定量PCR技術靈敏地檢出。本發明利用低成本的SYBR Green I作為熒光染料，建立了基于熒光定量PCR的快速轉基因玉米純合體檢測技術。由于基于SYBG Green I的熒光定量PCR技術不需要設計復雜的特異探針，降低了整個技術的難度，同時也極大的減少了技術成本。另外，無須了解目的基因在植物基因組中的整合位點和側翼序列，以玉米基因組中的單拷貝基因為參照基因，僅通過簡單的普通PCR和熒光定量PCR等操作，同時對Tl代陽性植株中參考基因與目的基因Ct比值進行分析，即能對單拷貝轉基因玉米在Tl代高效、簡易地鑒定出純合體。本發明適用于對單拷貝轉基因玉米進行早代純合體的鑒定。


圖I :參考基因6觀2] 26167856標準曲線，擴增效率94.2%，相關系數0.998 ；圖2 :目的基因bar標準曲線，擴增效率94.5%，相關系數O. 997 ；圖3 :參考基因GRMZM2G167856的溶解曲線，溶解峰單一，產物Tm在80_90°C ；圖4:目的基因bar的溶解曲線，溶解峰單一，產物Tm在80_90°C ；圖5 :含bar基因的表達載體；圖6 =Southern雜交鑒定TO代目的基因拷貝數；圖7 :來自于同一 TO代植株的9個Tl植株PCR擴增出特異條帶，方框處表示擴增出的特異性目的條帶；圖8 =Tl-I植株對應的T2代株系PCR擴增bar基因情況；圖9 Τ1-3植株對應的Τ2代株系PCR擴增bar基因情況；圖10 Τ1-4植株對應的Τ2代株系PCR擴增bar基因情況；圖11 Τ1-8植株對應的Τ2代株系PCR擴增bar基因情況，圖中O表示未擴增出bar基因特異條帶的植株，I表示擴增出bar基因特異條帶的植株；
具體實施例方式以下結合具體實施例，對本發明進行詳細說明。2. 2. ITl代轉基因玉米DNA提取對單個陽性TO轉基因玉米進行人工套袋自交，獲得TO代果穗。從每個TO代植株收獲的一穗種子進行單粒播種，獲得對應的Tl代轉基因植株，并進行編號。對來自同一個TO代的Tl代植株，隨機抽取20株左右，在3-4葉期分別提取葉片總DNA。I)取葉片2g，剪碎后于液氮中迅速研磨成粉(研磨后的葉片占離心管體積的1/4到 1/3)。 2)將上述凍粉迅速轉入預冷的離心管中，迅速加入900 μ I已預熱到65°C的CTAB提取液中，迅速混勻，于65°C水浴40min。期間輕柔混勻3 4次(每隔IOmin混勻一次)。3)取出離心管，冷至室溫，加入等體積(ΙΟΟΟμ I)的氯仿-異戊醇(氯仿異戊醇=24 : I, ν/ν),在搖床上輕輕振蕩搖勻lOmin。4)室溫下離心IOmin (IOOOOrpm)，取上清液轉至新的2ml離心管中，再加入ΙΟΟΟμ I的24 : I的氯仿-異戊醇，在搖床上輕輕振蕩搖勻lOmin。5)室溫下離心IOmin(IOOOOrpm),取上清液至新的2ml離心管中，加入等體積已預冷至_20°C的異丙醇，輕輕搖勻即可見絮狀DNA沉淀，若產量低，于輕輕搖勻后放置于_20°C冰箱中Ih。6)用針頭將絮狀沉淀挑于新的I. 5ml離心管中，加入Iml的70%乙醇脫洗兩次，再用Iml無水乙醇脫洗一次。7)將DNA自然晾干，或者真空干燥，加入100 μ I滅菌ddH20溶解，再加入I μ I RNA酶過夜。8)紫外分光光度儀測定DNA濃度，用滅菌的ddH20保存濃度調至500ng/ μ 1，工作濃度調至50ng/ μ I。取IOOngDNA用于0. 7 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測質量，其余DNA保存于-20°C備用。2. 2. 2參照基因的選擇及目的基因和參照基因PCR引物的設計選擇 maizesequence 數據庫(http://www.maizesequence.org)中公布的玉米內源的單拷貝基因(如 GRMZM2G167856、GRMZM5G861678、GRMZM2G093195、GRMZM2G024993 等)作為參考基因，使用引物設計軟件Primer5. O根據基因序列設計特異普通PCR引物和熒光定量PCR引物。普通PCR引物和熒光定量PCR引物Tm值均控制在58-61 °C，避免引物發夾結構、弓I物二聚體、以及引物與模板DNA的錯配，弓丨物長度均控制在17-24bp，預期擴增產物長度分別控制在300-600bp和120-250bp之間。例轉基因玉米目的基因為bar，以GRMZM2G167856為參考基因，從Tl代轉基因玉米中鑒定bar基因的純合體。(I) bar基因的一對普通PCR引物如下，擴增產物大小約450bp Fb05/ GCACCATCGTCAACCACTACAT3'Rb05/ CTGCCAGAAACCCACGTCAT3'(2)bar基因的一對熒光定量PCR引物如下，擴增產物大小約為200bp Fb 5/ AGGGCTTCAAGAGCGTGGT3'，
Rb :5' ATTTAGGTGACGGGCAGGAC3'；(3)參考基因GRMZM2G167856的一對普通PCR引物如下，擴增產物大小約400bp FC0:5, AAGGACAGGAGCGACAGGC3,RC05/ TTCGGAAACCGGAGGACAT3,(4)參考基因GRMZM2G167856的一對熒光定量PCR引物如下，擴增產物大小約130bp FC 5/ CGTAAGCAGGTATGTATGAGGTT3;，RC 5/ GGCAGTGTTATGTGGGAATGT3'2. 2. 3普通PCR方法對陽性Tl代轉基因植株進行預檢測以上述獲得的各個TI代植株的DNA (工作濃度)作為PCR模板，用引物Fbtl和Rb。進行PCR擴增，反應體系和反應程序如下PCR Buffer 12. 5μ IdNTPs O. 4mMMgCl2 O. 4mMFb0 IOpmRb0 IOpmTemplate 200ngTaq DNA polymerase IU滅菌ddH20 upto25 μ IPCR反應程序如下第一步(預變性)94°C,4min第二步(PCR反應)94°C，40s ;60°C，40s ;72°C，lmin ;共 42 個循環第三步(延伸)72°C,6min第四步(保存)I2°C,forever重復擴增3次，將每一次均能擴增出450bp左右特異條帶的植株用于下一步的鑒定。2. 2. 4證明基因特異擴增，獲得基因擴增效率2. 2. 4. I標準曲線模版的制備對第2. 2. 3步鑒定出的陽性Tl代轉基因植株，任選其一用于分別特異擴增目的基因bar和參考基因GRMZM2G167856。反應條件均同步驟2. 2. 3 ;反應體系為如下PCR Buffer 25 μ IDNA 模板200ngTaq 酶IUPrimer F 15pmPrimer R 15pmdNTP 0. 4mMMgCl2 0. 4mM滅菌ddH20 up to50 μ I(注此處擴增bar的反應體系中，引物F和引物R分別為Fbtl和Rbtl;擴增參考基因的反應體系中引物F和引物R分別為FCtl和RQ。)取2ul擴增產物，用O. 7%的瓊脂糖凝膠檢測二者擴增的特異性，并用PCR產物純化試劑盒純化其余PCR產物，然后均用ddH20定容至100 μ I。再用TE緩沖液將其逐級稀釋成 10' 10_2、10_3、10_4、10_5、10_6、10_7 等 7 個梯度模板。2. 2. 4. 2標準曲線的繪制分別以兩個基因以上所述的7個梯度濃度(10' 10' 10' 10' 10' 10' 10〃)的擴增產物為模板，制備以下反應體系和反應程序進行首次熒光定量PCR(熒光定量儀選用Bio-Rad iQ52. O)，繪制參考基因和目的基因的標準曲線，確保擴增產物相關系數R2 >O. 99，擴增效率(E)在80% -120%之間(圖I、圖2)，且溶解曲線峰單一，產物Tm值在80-900C (圖 3、圖 4)。 熒光定量PCR反應體系如下SYBR Green I (TaKaRa) 10μ IROX O. 4 μ I引物F:8pm引物R:8pm梯度DNA 模板I μ IddH20 up to20 μ I(注此處擴增bar的反應體系中，引物F和引物R分別為Fb和Rb;擴增參考基因的反應體系中引物F和引物R分別為FC和RC。)熒光定量PCR反應程序第一步預變性Reps I95。。， 30s第二步PCR反應Reps 4095 °C, 5s60 °C, 34s第三步Meltcurve95。。， 15s60。。， 60s95 °C, 15s2· 2· 5目的基因的相對定量以步驟2. 2. 3中各陽性Tl代轉基因植株總DNA(工作濃度)為模板，采用熒光定量PCR分別擴增其參考基因和目的基因，反應體系同步驟2. 2. 4.2,反應體系如下(注保證某一個Tl代植株的目的基因和參考基因擴增在同一臺熒光定量PCR儀上同時進行)。熒光定量PCR反應體系SYBR Green I (TaKaRa) 10 μ IROX O. 4μ I引物F:8pm
引物R:8pmDNA 模板IOOngddH20 up to20 μ I(注此處擴增bar的反應體系中，引物F和引物R分別為Fb和Rb;擴增參考基因的反應體系中引物F和引物R分別為FC和RC。)每個樣品設3次技術重復。通過iQ5程序讀出各樣品的3個Ct值，求其平均，代入下列公式，計算目的基因在各Tl代植株中的相對含量(Rel Q) 目的基因 _ (1+￡參考基因..>_
相對含童 _的基因
(1+E目雌因)2. 2. 6檢出轉基因玉米純合體當目的基因相對含量(Rel Q)約等于I時，該植株為純合體；iRel Q約等于O. 5時，該植株為雜合體。實施例2與常規轉基因玉米純合體鑒定方法相比，由于本發明在不需要對T2代個體進行目的基因分離比例分析的情況下，可以針對單拷貝轉基因玉米直接在Tl代鑒定出轉基因純合體，縮短鑒定周期至少120天(一個玉米生育期)，加快了玉米轉基因育種的進程。利用現有技術在Tl代植株中鑒定出純合的轉化體必須了解轉基因插入位點，這本身則是一個轉基因領域的技術難題，需花費大量的時間，特別是對于一些研究技術不夠完善的科研單位實施起來更為困難。而基于SYBR Green I染料的熒光定量技術目前已在大多數分子生物學實驗室得到普及使用，與基于TaqMan探針的基因定量技術相比，它成本低、難度小、操作簡單、周期短。以玉米基因組中的單拷貝基因為參照基因，同時對Tl代陽性植株中參考基因與目的基因Ct比值分析，即能在Tl代轉基因植株中高效、簡易地鑒定出純合的轉基因玉米。該方法的檢出效果已通過T2代株系目的基因分離情況得以驗證，準確率為100%。例將含目的基因bar的表達載體(圖5)經過農桿菌介導法導入玉米自交系18-599，經過Southern雜交檢測已篩選出了 I個單拷貝TO代轉基因植株(圖6)。通過本發明技術對此TO代植株后代進行純合體鑒定。隨機選擇TO代植株自交獲得的16個Tl代個體，經3次重復PCR檢測陽性植株9株(圖7)，再從其中隨機抽取4株編號分別為Tl-1，Tl-3，Tl-4，T1-8，鑒定bar基因純合體。經SYBR Green I定量PCR分析，參考基因GRMZM2G167856和目的基因bar的相關系數分別為O. 998、O. 997，擴增效率分別為O. 942、O. 945 (圖I、圖2)。Ct值及根據上述公式計算的目的基因bar的相對含量Rel Q見表I 表4，其中T1-1、T1-4、T1_8的Rel Q值分別為O. 45、0. 50、0. 48均接近于或等于O. 5，表明三者均為雜合體；而Τ1-3的Rel Q值為1.07，接近于I. 0，表明其為bar基因的純合體。另一方面，經過常規的T2代bar基因分離情況分析，表明Τ1-1、Τ1-4、Τ1-8等三個植株對應的Τ2代株系均存在分離現象(即Τ2代株系中一些植株不能擴增出bar基因特異片段)(圖8、圖10、圖11)，而T1-3對應的T2代株系不存在分離現象(即T2代株系中所有植株均能擴增出bar基因特異片段)(圖9)。本發明獲得的結果與常規純合體鑒定方法的結果完全吻合。表I Tl-I熒光定量結果
權利要求
1.一種早代鑒定轉基因玉米純合體的方法，其特征在于，包括以下步驟:Al、提取Tl代轉基因玉米DNA ;A2、選擇參照基因、設計目的基因和參照基因的PCR引物；A3、使用普通PCR方法對陽性Tl代轉基因植株進行預檢測；A4、證明基因特異擴增，獲得基因擴增效 率；A5、計算目的基因在各Tl代植株中的相對含量;A6、檢出轉基因玉米純合體，當目的基因相對含量約等于I時，該植株為純合體；當基因相對含量約等于0. 5時，該植株為雜合體。
全文摘要
本發明公開了早代鑒定轉基因玉米純合體的方法，包括以下步驟A1、提取T1代轉基因玉米DNA；A2、選擇參照基因、設計目的基因和參照基因的PCR引物；A3、使用普通PCR方法對陽性T1代轉基因植株進行預檢測；A4、證明基因特異擴增，獲得基因擴增效率；A5、計算目的基因在各T1代植株中的相對含量；A6、檢出轉基因玉米純合體，當目的基因相對含量約等于1時，該植株為純合體；當基因相對含量約等于0.5時，該植株為雜合體。僅通過簡單的普通PCR和熒光定量PCR等操作，同時對T1代陽性植株中參考基因與目的基因Ct比值進行分析，即能對單拷貝轉基因玉米在T1代高效、簡易地鑒定出純合體。
文檔編號C12Q1/68GK102952879SQ20121040559
公開日2013年3月6日 申請日期2012年10月23日 優先權日2012年10月23日
發明者沈亞歐, 潘光堂, 彭煥偉, 葛飛, 張志明, 林海建, 江舟, 趙茂俊, 楊珊, 羅旭, 張兵 申請人:四川農業大學