專利名稱：一種快速高通量抗病毒藥物篩選模型的制作方法
技術領域：
本發明涉及藥物篩選模型領域，具體涉及一種抗病毒藥物的快速高通量篩選模型 的建立方法，可應用于藥物的篩選。
背景技術：
藥物蹄選模型(drug screening model，drugscreening assay method)是用于證 明某種物質具有藥理活性(生物活性、治療作用)的實驗方法，這些實驗方法是尋找和發現 藥物的重要條件之一。人們在長期尋找藥物的實踐過程中，建立了大量用于新藥篩選的各 類模型，大致分為經典的動物實驗法、分子生物學篩選法、高通量藥物篩選法和高內涵藥物 篩選技術。所謂動物篩選法就是以動物作藥物篩選的觀察對象，以動物對藥物的反應，證明 某些物質的藥理作用，評價其藥用價值。單純從新藥篩選的角度看，動物篩選模型的最大優 點是可以從動物身上直觀地反應出藥物的治療效果、不良反應以及毒副作用。由動物模型 獲得的篩選結果，對預測被篩選樣品的臨床效果、毒副作用和應用前景具有十分重要的價 值。但動物篩選法也存在缺點采用動物模型進行藥物篩選時，由于動物的特殊性，決定了 藥物篩選過程主要依賴于手工操作，而且只能對有限的樣品進行篩選，使整體動物模型篩 選新藥具有明顯的局限性，效率低、成本高、動物實驗需要時間長、勞動強度大、操作技術要 求高、受試樣品需要量大(約5g)。分子生物學篩選方法近20年來，許多藥物作用的受體已被分離、純化，一些基因 的功能及相關調控物質被相繼闡明，為藥物篩選提供了許多新的靶點，這就使得藥物篩選 模型從傳統的整體動物、器官和組織水平發展到細胞和分子水平。分子生物學為藥物篩選 提供了新型靶蛋白，對人工合成的組合化學庫和小分子肽庫進行目的性藥物篩選。通過比 較健康人群與患者間在機體組織細胞分子上的差異以及闡明模型組織中相應蛋白質的功 能，從而正確地選擇、描述并確認某些靶蛋白，這有助于更加理性和有目的性地進行藥物篩 選。生化水平的藥物篩選擬用開發藥物作用的靶點設計實驗，一般而言這種作用靶點是具 有某種特定生理功能的蛋白質，如酶和受體等，此外一些編碼功能明確的DNA也越來越多 地成為藥物作用的新靶點。候選化合物與靶點混合后，可以通過酶聯免疫、熒光顯色、核磁 共振等方法定量測定化合物與靶點的相互作用，從而成為篩選化合物的依據。生化水平的 藥物篩選操作相對簡單，成本較低，但是由于藥物在體內的作用并不僅僅取決于其與靶酶 的作用程度，吸收、分布、代謝、排泄均會對藥物的作用產生極大的影響，僅僅一道薄薄的細 胞膜就能夠阻擋住許多候選化合物，因而生化水平的藥物篩選不確定因素更多，誤篩率較 高。此外，該篩選方法手段單一、費時耗財也成為其無法深入發展的缺陷。高通量藥物篩選(high throughput screening, HTS)是20世紀80年代后期形 成的尋找新藥的高新技術。采用的篩選方法一般是以藥物作用靶點為主要對象的細胞和分 子水平的篩選模型，根據樣品與靶點結合的表現，判斷化合物的生物活性。由于這些篩選方 法在微量條件下進行，同時采用自動化操作系統，可以進行大規模的篩選，因而稱為高通量藥物篩選。高通量篩選依賴數量龐大的樣品庫，實現了藥物篩選的規模化，較大限度地利用 了藥用物質資源，提高了藥物發現的概率，同時提高了發現新藥的質量，充分利用了藥用資 源。高通量篩選采用的是細胞、分子水平的篩選模型，篩選實驗是在微量篩選系統中完成 的，樣品用量一般在微克級(g)，節省了樣品資源，奠定了“一藥多篩”的物質基礎，同時節省 了實驗材料，降低了單藥篩選成本。而且高通量藥物篩選為高度自動化操作，不但減少了操 作誤差的發生，降低了勞動強度，而且提高了藥物篩選的效率和結果的準確性。但是，高通 量篩選所采用的主要是分子、細胞水平的體外實驗模型，任何模型都不可能充分反映藥物 的全面藥理作用；用于高通量篩選的模型總是有限的，要建立反映機體全部生理機能或藥 物對整個機體作用的理想模型，也是不現實的。高內涵篩選是指在保持細胞結構和功能完整性的前提下，同時檢測被篩樣品對細 胞形態、生長、分化、遷移、凋亡、代謝途徑及信號轉導各個環節的影響，在單一實驗中獲取 大量相關信息，確定其生物活性和潛在毒性的一種藥物篩選方法。從技術層面而言，高內涵 篩選是一種應用高分辨率的熒光數碼影像系統，在細胞水平上檢測多個指標的多元化、功 能性篩選技術，旨在獲得被篩樣品對細胞產生的多維立體和實時快速的生物效應信息；從 篩選載體上看，高內涵藥物篩選與高通量藥物篩選并沒有顯著的區別，也是在微孔板上進 行的，目前使用較多的是96孔微板。高內涵藥物篩選的檢測體積并未因檢測指標增加而增 高，操作步驟同樣簡單可行、自動化。雖然高通量藥物篩選的結果較為準確，易于評價，但 其檢測模型均建立在單個藥物作用靶分子的基礎上，無法全面反映被篩樣品的生物活性特 征。以現代分子和細胞生物學為基礎建立的快速、微量、定向的體外篩選模型和測試 方法，以及結合自動化技術發展起來的高通量篩選技術是目前創新藥物的研究重要手段。 藥物的藥理作用是通過肌體細胞或病原體的藥物靶點而發揮，內用藥物無論是經過口服、 注射等任何一種給藥途徑，都需經過吸收、代謝、分布和排泄的過程，這些過程都影響藥物 的效果，如代謝通過氧化、分解、結合等影響藥物的分子結構和作用效果，過程相當復雜，有 的使藥效降低或消失，如氯丙嗪、磺胺藥等；有的使藥效增強，如無活性的抗癌藥物硫唑嘌 呤經過代謝變成具有藥理活性的6-硫基嘌呤。常規體外細胞或病原體培養藥物篩選模型， 因藥物未經過體內吸收、分布、代謝等過程，而是直接作用于細胞或病原體；因此不能真正 的反映藥物的作用，存在不確定性和不對應性，有些在體外實驗有效的藥物或藥物成分，在 臨床實驗上卻無效。通常體外藥物篩選的結果與臨床效果存在很大的偏差；同時常規體外 細胞培養藥物篩選模型需先對每種藥物進行培養細胞的安全用量測定，工作量大，操作復 雜，成本高等缺陷。

發明內容
針對普通體外高通量篩選的不確定性和不對應性等缺陷，本發明提供了一種新型 的高通量篩選模型的建立方法，最大限度的模擬動物體內生理生化環境與過程，提高了藥 物篩選的準確性。本發明的技術方案包括如下步驟(1)給每只試驗動物灌服最大安全劑量藥物，分離制備含藥血清或血漿備用；(2)按常規方法制備正常試驗動物血清或血漿，測試其血清或血漿對細胞的影響，得出動物血清或血漿對細胞系培養的最大安全濃度；(3)以動物血清的最大安全濃度量為標，將含藥血清或血漿加入細胞培養液或細 胞維持液中培養，作CPE測定和MTT法測定，評價藥物效果，篩選出有效藥物。本發明中所說的最大安全劑量是指給某一種動物一次灌服藥物最多，但不致動物 死亡的劑量。最大耐受劑量(maximal tolerance dose，MTD或LD0或LC0)指某實驗總 體的一組受試動物中不引起動物死亡的最大劑量。毒理學中，最大耐受劑量(maximal tolerance dose，MTD或LD0或LC0)指某實 驗總體的一組受試動物中不引起動物死亡的最大劑量。本方法的原理是測定某一試驗動物(小鼠、大鼠、豚鼠、犬、貓、豬、兔、禽等)血 清(血漿)對培養細胞系的安全使用濃度，并建立細胞系微量培養方法；將藥物經試驗動物 服用，進行吸收、分布與代謝，提取動物含藥血清(血漿)，以安全濃度替代正常試驗動物血 清(血漿)，按微量細胞培養法，作細胞培養，測定細胞病變(CPE)程度和MTT法計算細胞活 性，判斷藥效。根據生物藥劑學原理，通過試驗動物對藥物的消化、吸收、分布和代謝，藥物有效 成分進入動物血液中(藥動學中央區)，從而分離獲得含藥血清或血漿，極大地摒棄藥物的 非活性成分；利用其含藥血清或血漿，進行細胞培養，結合細胞病變(CPE)程度測定和細胞 成活率測定法(MTT)，判斷藥物的有效性；最大程度地排除藥物中非特異性成分的干擾，提 高藥物篩選的可靠性。根據本發明的實施例，步驟(1)中對未知藥動力學參數的藥物給每只試驗動物連 續1-5次灌服最大安全劑量藥物，間隔時間為0. 5-2h，最后一次灌服后10-60min采血；對 已知藥動力學參數的藥物在血液的藥峰時間采血。本發明與現有技術相比，具有如下優勢a)提高了藥物的有效篩選率。本發明模型使藥物經過動物體內的吸收、分布、代 謝過程后，取含藥血清(血漿)用體外細胞培養法進行藥效測定；其模型結合了體內生理生 化過程和體外細胞與病原體的直觀效果測定的兩大特點，其藥效結果能真實反映藥物的作 用，使體外篩選的結果與臨床藥效的吻合度大大增加；因此該高通量藥物篩選模型提高了 藥物篩選的可靠性，有效的提高了藥物的篩選率；b)簡化了篩選程序。常規的體外細胞培養法高通量篩選模型，要檢測每一種待篩 藥物對細胞的安全濃度，這對于成千上萬藥物的初篩是一項巨大的工作。該發明將含藥動 物血清或血漿添加到細胞培養液中，雖然各種動物血清對細胞的毒害作用存在差異，但試 驗動物血清和藥物相比，與細胞培養的犢牛血清較接近，能適于細胞培養，加入之前只需測 試動物血清對細胞的安全濃度，無須檢測每一種待篩藥物對細胞的安全濃度，簡化了篩選 程序，可大批量的快速測定，節約了大量的人力物力；c)大大降低或消除藥物理化因素對常規模型的不良作用。常規的體外細胞培養法 篩選模型大都將藥物直接加到細胞培養液中去，一方面藥物可能對病原體產生非藥理性抑 滅作用，造成篩選的假陽性結果；另一方面藥物對細胞產生諸多不利的理化作用，造成假陰 性結果。如細胞培養的最適PH值為7. 2 7. 4之間，大于8或者小于5細胞狀態不良或死 亡，而很多藥物的PH值不在體外細胞培養的最適范圍內；又如藥物，尤其是中草藥含有大 量的非藥效成分，對細胞有毒害作用，因此造成有效藥物漏篩的情況非常普遍。本發明是通
5過動物服用對藥物進行篩選式的吸收，濾過大量非藥理成分；再經肝臟代謝進入血液(藥 代動力學的中央區)，其血液所含藥物大多為功能性成分；因此，大大消除常規模型的非特 異性結果，提高藥物篩選的有效性。d)操作方便，節約成本。所有藥物的篩選最終都需要做動物和人體給藥試驗，但動 物尤其是大型動物如猿、猴等試驗費用昂貴，且試驗規模和效率也受到影響。本發明的血藥 細胞培養法采取試驗小動物的血清進行試驗，即使是大動物亦可反復試驗，來源廣泛，成本 低廉，操作方便，效果真實，大大降低了藥物篩選的成本，提高了工作效率，可用于大規模藥 物初步篩選，尤其適合中草藥有效成分和前體藥物的篩選，因為中草藥成分復雜，有效成分 不易確定，本發明是體內與體外相結合的高通量篩選，易于尋找和發現中草藥的有效部位， 進而借助藥物分離方法，分離確定藥物或動物血清中的有效藥物成分。
具體實施例方式比較試驗發現將粗提的中草藥藥液直接加入到長滿細胞的96孔培養板中，大部 分細胞死亡，可能與中草藥液對細胞的非生理性作用有關。綜合以上因素，試驗通過本發 明模型進行抗豬繁殖與呼吸道綜合征病毒(PRRSV)中草藥的篩選，篩選出有效抗豬繁殖與 呼吸綜合征病毒的中草藥1種，水煎制劑，進行豬的攻毒防治試驗；在此基礎上組方進行臨 床防治試驗和擴大臨時治療試驗(在四川成都市、河南商丘、北京大興和湖南岳陽縣、寧鄉 縣、望城縣的發病豬群進行臨床實驗)，攻毒防治試驗和臨床試驗的效果與通過該發明篩選 的藥效非常吻合。實施例1 中草藥提取物對培養細胞的毒性作用測定為了了解和比較常規方法藥物直接添加對細胞的毒性作用，測定了試驗用的21 種中草藥的水提取液對Marc-145細胞的毒性作用及安全濃度。方法是將21種中草藥分別 用水進行粗提，每種中草藥的水提液滅菌后用細胞維持液稀釋，分別加入到長滿細胞的96 孔培養板中，每濃度8孔，每孔lOOul，37°C 5% C02培養箱中培養72h，每天觀察CPE。結果 顯示各種提取液對細胞產生不同程度的毒性作用，其作用隨濃度的增加而增加，且不同的 中草藥的副作用大小不同，分別在細胞培養液中添加0.625-1. 25% (V/V)以上的中草藥水 提液(含生藥0. 5g/ml)，即每毫升培養液中含生藥1. 95-3. 90mg,細胞開始出現細胞病變 (CPE)。可見中草藥成分直接對細胞其毒性作用比較大，這可能一方面由于中草藥作為非細 胞營養物對細胞產生的毒副作用；另一方面由于中草藥液中的生物堿等成分影響細胞培養 PH值(細胞的最適PH值為7. 2 7. 4之間，大于8或者小于5細胞狀態不良或死亡)所 致。因此，每種中草藥添加的安全濃度應在此濃度以下(0.625-1.25%)。實施例2 小鼠血清對Marcl45細胞的安全濃度測定小鼠血清56°C滅活30min，用維持液稀釋成80%，0. 22 y m微孔濾膜過濾除菌，用 維持液倍比稀釋稀釋成不同的濃度，小鼠血清的稀釋濃度分別為80%、40%、20%、10%、 5%,2.5%U.25%,0. 625%,0. 312%，從高濃度到低濃度分別加入到長成良好的單層細胞 中，每孔100 u 1，每個濃度重復8孔，設細胞對照組，置37°C培養箱中培養72h，每天用倒置 顯微鏡觀察CPE并記錄結果，以最后的記錄結果為最終結果。同時用MTT法測得的0D值計算細胞存活率。具體操作如下經過72h處理后，吸出細胞孔中殘余的小鼠血清，用預熱至 37 °C的PBS溶液漂洗2次，每孔加入10 ill的MTT (5mg/ml溶于PBS)，37°C繼續培養4h，4h 后加入lOOylDMSO，在微量振蕩器上振蕩lOmin，以溶解細胞中的紫色結晶物，然后在酶標 儀上570nm處測定其光吸收值。據細胞病變(CPE)程度和MTT法測得的細胞成活率為依據， 以能長成或維持良好單層細胞的藥物的最高濃度作為藥物的安全濃度。抗病毒實驗采用最 高安全濃度的含藥血清進行。小鼠血清對Marc-145細胞比較小牛血清(常用量5_10% )，有一定的毒副作用， 5%以上開始出現細胞病變，高濃度的小鼠血清導致細胞全部病變，細胞圓縮、堆積、脫落; 隨著血清濃度的降低，這種病變程度下降，測得細胞的0D值增大，血清對細胞增殖的抑制 率越來越小，即小鼠血清毒性與其濃度呈正相關；血清濃度降低到5%，細胞基本不發生病 變，其最大的無毒濃度為2. 5%。其最大安全濃度大于中草藥提取液2-4倍。實施例3:含中草藥小鼠血清對Marc-145細胞感染PRRSV病毒的保護與抗病毒藥物的篩選1試驗材料Marc-145細胞(非洲恒河猴腎細胞)由湖 南農業大學動物醫學院惠贈；美洲型豬繁殖_呼吸道綜合征病毒(PRRSV)由湖南農業大學動物醫學院惠贈；中草藥21種中草藥(貫眾、重樓、檳榔、八角蓮、杜仲、板藍根、黃柏、天南星、半 夏、大青葉、紫花地丁、玄胡、半枝蓮、山茱萸、連翹、香薷、牛至、馬鞭草、喜樹果、蛇床子、馬 錢子等進行編號)購自湖南養天和大藥房，用傳統的煎煮法提取三次，合并濃縮，過濾4°C 保存；2試驗方法通過細胞培養，對豬繁殖-呼吸道綜合征病毒(PRRSV) TCID50進行測定，根據小鼠 血清對Marcl45細胞的安全濃度，制備中草藥藥液，采集含藥小鼠血清20g左右的小鼠用 中藥藥液進行最大安全劑量的灌胃，每種中藥灌兩只，每只小鼠連續灌服4次，每次灌5ml， 灌藥時間間隔為1小時，灌第三次半個小時后，即刻摘眼球取血(旨在使小鼠血中藥物濃度 最高)，離心取血清，56°C滅活30min。在細胞已基本長成單層的96孔中，吸出各孔舊的培 養液，加入稀釋到安全濃度的含藥血清。試驗根據抗病毒藥物的三種作用方式設計藥血清 的添加方式抗病毒吸附(先加藥后加病毒)、抗病毒復制(先接毒后加藥)、直接滅活病 毒作用(藥物與病毒體外作用一段時間后加入)；同時設正常細胞對照組、小鼠血清對照組 和病毒對照組；置37°C 5% C02培養箱中培養4h后加入100個TCID5Q的病毒液100 yl，置 37°C 5% C02培養箱中培養72h，每天用倒置顯微鏡觀察細胞病變(CPE)情況并記錄，以最 后的記錄結果為最終的結果，篩選抗病毒中草藥。3 結果試驗的三種作用方式投藥表明不同藥物(含藥血清)對抗病毒的效果和作用方 式不同，所篩選的藥物中，3、7、8、9具有抗病毒吸附的作用(表1) ；2和8有抗病毒復制的作 用(表2) ；2、8、5能夠直接滅活病毒(表3)。綜合三種作用方式考慮，2、8能夠抑制病毒， 對細胞的保護率較高，將篩選為具抗病毒作用的中草藥進行后面的臨床試驗。表1先加藥后加病毒72h測得細胞CPE情況與MTT法的0D值及藥物對細胞的保 護率
權利要求
一種快速高通量藥物篩選模型，其特征在于包括如下步驟(1)給每只試驗動物灌服最大安全劑量藥物，分離制備含藥血漿或血清備用；(2)按常規方法制備正常試驗動物血清或血漿，測試其血清(血漿)對細胞的影響，得出動物血清(血漿)對細胞系培養的最大安全濃度；(3)以動物血清的最大安全濃度量為標，將含藥血清或血漿加入細胞培養液或細胞維持液中培養，作CPE測定和MTT法測定，評價藥物效果，篩選出有效藥物。
2.根據權利要求1所述的快速高通量藥物篩選模型，其特征在于步驟(1)中對不 知藥動力學參數的藥物給每只試驗動物連續1-5次灌服最大安全劑量藥物，間隔時間為 0. 5-2h，最后一次灌服后10-60min采血；對已知藥動力學參數的藥物以最大安全劑量給藥 后藥物進入血液達到藥峰時采血。
全文摘要
針對普通體外高通量篩選的不確定性和不對應性等缺陷，本發明提供了一種新型的高通量篩選模型的建立方法，最大限度的模擬動物體內生理環境，增加了藥物篩選的準確性，使體外篩選的結果更接近臨床應用效果。本發明的技術方案為通過動物體內循環對藥物吸收分離藥物有效成分的方法提取動物含藥血清，使藥物經過體內代謝過程后再加到細胞培養液或維持液中，結合微量細胞培養法、細胞病變(CPE)測定和MTT法計算細胞活性。
文檔編號A61K49/00GK101983724SQ201010296978
公開日2011年3月9日 申請日期2010年9月29日 優先權日2010年9月29日
發明者肖兵南 申請人:肖兵南