專利名稱：一種用于篩選和評價抗腸道病毒71型藥物的融合蛋白及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于篩選和評價藥物的融合蛋白及其應(yīng)用，特別涉及一種基于化學(xué)發(fā)光方法篩選和評價抗EV71藥物的融合蛋白及其應(yīng)用。屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
腸病毒71型(enterovirus 71，EV71)是一種重要的神經(jīng)感染性腸病毒，目前尚沒有有效地治療方法和疫苗。在亞太地區(qū)以及全世界范圍均有關(guān)于EV71病毒感染相關(guān)的傳染病爆發(fā)的報(bào)導(dǎo)(AbuBakar, S. , et al. . Enterovirus71 outbreak, Brunei. Emerg.Infect. Dis. 2009，15:79 - 82. )。EV71感染主要會造成兒童的皮疹，被稱為手足口病(hand-foot-mouth disease, HFMD) 然而，EV71急性感染還會造成嚴(yán)重的神經(jīng)性疾病 以及極高的死亡率。尤其是五歲以下兒童被EV71感染后會伴隨神經(jīng)并發(fā)癥，包括無菌性腦膜炎、腦干和/或小腦腦炎，以及急性無力肢體麻痹、心肌炎和急性致死出血性肺水月中(Brown, B. A. , M. S. Oberste, J. P. Alexander, Jr. , M. L. Kennett, and M. A. Pallansch.Molecular epidemiology and evolution of enterovirus 71 strainsisolated from1970 to 1998. J. Virol. 1999. 73:9969-9975. )DEV71屬于小RNA病毒科，腸道病毒屬，是一種非包膜、單正鏈RNA病毒，基因組RNA包含約7400個核苷酸(nucleotide，nt)。其基因組結(jié)構(gòu)由5’ _UTR、3’ -UTR、開放讀碼框(open reading frame，0RF)三部分構(gòu)成。其中ORF分為P1、P2、P3三個部分，在翻譯的過程中，經(jīng)過EV712A、3C蛋白酶的切割作用，Pl編碼四個結(jié)構(gòu)蛋白，VP1-VP4，P2編碼3個非結(jié)構(gòu)蛋白(2A、2B、2C)，P3編碼4個非結(jié)構(gòu)蛋白(3A、3B、3C、3D)(Lin, J.Y，et al. . Viral and hostproteins involved in picornavirus life cycle. J. Biomed. Sci. 2009，16:103. XEV713C蛋白酶的主要切割位點(diǎn)為病毒自身或者宿主細(xì)胞內(nèi)Gln-Gly (Q/G)氨基酸的連接點(diǎn)((WengKF, Li ML, Hung C T,Shih SR. Enterovirus 71 3C protease cleaves a novel targetCstF-64 and inhibits cellular polyadenylation. PLoS Pathog. 2009，5(9):1-13.)。目前觀察和檢測EV71的方法除了傳統(tǒng)的病毒培養(yǎng)鑒定法外，主要是RT-PCR和免疫學(xué)方法，但這些方法操作上均比較復(fù)雜，且無法直接觀察到細(xì)胞或組織中病毒的變化情況，尤其是EV71在體內(nèi)的感染情況，缺乏理想的評價體系，使得藥物抗EV71的作用效果難以作出評估，極大的延緩了藥物的研發(fā)和篩選，因而建立一種理想的抗EV71藥物的篩選評價體系迫在眉睫。本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供通過化學(xué)發(fā)光觀察并檢測EV71感染情況的方法，可快速、有效、簡便地觀察并檢測到EV71的感染，為篩選抗EV71藥物提供了優(yōu)良的平臺。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于通過EV713C蛋白酶對底物的切割，使重組融合蛋白中的Fluc的N段和C段緊密結(jié)合，使其在特異底物作用下發(fā)光，從而監(jiān)測EV71的復(fù)制水平，進(jìn)而提供了一種用于篩選和評價抗EV71藥物的融合蛋白。Peptide A (pepA)和peptide B (pepB)是兩段會發(fā)生高親和性結(jié)合的多月太(Thormeyer D,Ammerpohl O,Larsson O, et al.Characterization of IacZcomplementation deletions using membrane receptor dimerization. Biotechniques2003,34(2) :346-350, 352-355.)。本發(fā)明中將 Fluc 的 N 段(Nluc)和 C 段(Clue)分別與 p印A和P印B結(jié)合，中間以EV713C蛋白酶在CstF-64蛋白中的切割位點(diǎn)連接，此時Fluc的活性由于 Nluc 與 Cluc 的分離而受到抑制(Weng KF, Li ML, Hung CT, Shih SR. Enterovirus 71 3Cprotease cleaves a novel target CstF-64 and inhibits cellular polyadenylation.PLoS Pathog. 2009，5(9) :el000593.)。當(dāng)切割位點(diǎn)被3C蛋白酶切割，pepA與pepB發(fā)生高親和性結(jié)合，誘使Nluc與Cluc結(jié)合從而恢復(fù)Fluc的活性并發(fā)光。 本發(fā)明的一種用于篩選和評價抗腸道病毒71型藥物的融合蛋白，其特征在于所述的融合蛋白含有以下(a)或(b)所示的氨基酸序列(a) SEQ ID No 1所示的氨基酸序列；或(b)將SEQ ID No. I所示的氨基酸序列經(jīng)過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或者添加仍具有評價EV713C蛋白酶活性作用的氨基酸序列。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No:l所示。本發(fā)明還提供了編碼所述的融合蛋白的核苷酸序列，其特征在于所述的核苷酸序列含有以下(a)、(b)或(C)所示的核苷酸序列(a) SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列；或(b)編碼SEQ ID No 1所示的氨基酸序列的核苷酸序列；或(c)與SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列具有90%以上同源性且其編碼的蛋白質(zhì)具有評價EV713C蛋白酶活性作用的核苷酸序列。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。進(jìn)一步的，本發(fā)明還提供了一種重組表達(dá)載體，其特征在于含有以上任一所述的核苷酸序列。在本發(fā)明中，優(yōu)選的,所述的重組表達(dá)載體為雙突光報(bào)告載體，其由以下方法構(gòu)建得到( I)將編碼熒光素酶的N段與C段的核苷酸序列分別與編碼兩個可緊密結(jié)合的小分子多肽P印A與P印B的核苷酸序列之一連接，得到的兩個片段由編碼EV713C蛋白酶作用底物的核苷酸片段相連，得到融合基因；(2)將此融合基因插入真核表達(dá)載體P⑶NA3. I (+)中，建立了可用于指示EV713C蛋白酶活性的表達(dá)載體；(3)將N端和C端分別帶有巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子和猴空泡病毒40多聚腺苷酸尾(SV40 polyA tail)的綠色熒光蛋白(EGFP)，稱為CMV-EGFP-SV40片段，反向插入步驟
(2)得到的真核表達(dá)載體中，得到所述的雙熒光報(bào)告載體。更優(yōu)選的，所述的雙熒光報(bào)告載體為pANluc ( Δ Q/G)BCluc-EGFP,其核苷酸序列如 SEQ ID No. 4 所示。更進(jìn)一步的，本發(fā)明還提供了一種宿主菌，其特征在于含有以上任一所述的重組表達(dá)載體。再進(jìn)一步，本發(fā)明提供了所述的融合蛋白在制備指示3C蛋白酶活性、指示EV71感染的水平的試劑或在篩選和評價抗腸道病毒71型藥物中的應(yīng)用。所述的核苷酸序列在制備指示3C蛋白酶活性、指示EV71感染的水平的試劑或在篩選和評價抗腸道病毒71型藥物中的應(yīng)用。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)措施(I)構(gòu)建融合蛋白ANluc ( Δ Q/G)BCluc-EGFP基因的真核表達(dá)載體；(2)觀察到融合蛋白ANluc ( Λ Q/G)BCluc-EGFP可有效的在細(xì)胞中表達(dá)；(3)在細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染表達(dá)融合蛋白ANluc ( Λ Q/G)BCluc-EGFP及EGFP-3C蛋白的 真核表達(dá)載體；(4)檢測表達(dá)融合蛋白ANluc( Λ Q/G)BCluc-EGFP及EGFP-3C蛋白的細(xì)胞中熒光素酶的活性；(5)表達(dá)融合蛋白ANluc(AQ/G)BCluc-EGFP的細(xì)胞中感染EV71 ；(6)檢測表達(dá)融合蛋白ANluc ( Δ Q/G)BCluc-EGFP的細(xì)胞中感染EV71后熒光素酶的活性。本發(fā)明成功構(gòu)建了將兩個可緊密結(jié)合的小分子多肽P印A和P印B分別與Fluc N端和C端片段結(jié)合，中間由EV713C蛋白酶作用底物相連的融合基因的真核表達(dá)載體。將此載體轉(zhuǎn)染至EV71易感細(xì)胞(vero細(xì)胞)，進(jìn)一步感染EV71后，在FLuc底物作用下可檢測到熒光素酶的表達(dá)，進(jìn)而提供了一種用于篩選和評價抗EV71藥物的融合蛋白。本發(fā)明尚屬首創(chuàng)，采用分片段螢火蟲熒光素酶策略，將編碼熒光素酶的N段與C段的核苷酸序列分別與兩個可緊密結(jié)合的小分子多肽PepA與pepB的核苷酸序列連接，中間由編碼EV713C蛋白酶作用底物的核苷酸片段相連，得到融合基因，然后將此融合基因插入真核表達(dá)載體P⑶NA3. 1(+)，建立了可用于指示EV713C蛋白酶活性的表達(dá)載體pANluc ( Δ Q/G) BCluc0另外將N端和C端分別帶有巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子和猴空泡病毒40多聚腺苷酸尾(SV40polyAtail)的綠色熒光蛋白(EGFP)，以下稱CMV-EGFP-SV40片段，反向插入上述真核表達(dá)載體中，可以在細(xì)胞中表達(dá)ANluc ( Δ Q/G) BCluc及EGFP，形成雙熒光報(bào)告載體(指示載體)pANluc ( Δ Q/G) BCluc-EGFP。從而可通過觀察綠色熒光的表達(dá)情況來指示融合蛋白ANluc ( Λ Q/G)BCluc的表達(dá)。表達(dá)載體在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)產(chǎn)生融合蛋白，在有EV713C蛋白酶共表達(dá)的情況下，在Λ Q/G處發(fā)生切割作用，通過P印A和p印B的相互作用，帶動N端和C端的熒光素酶互補(bǔ)結(jié)合，形成完整的熒光素酶，通過測定熒光素酶便可反映出EV713C蛋白酶的活性，如圖I所示，從而評價EV71復(fù)制情況。本發(fā)明提供的指示載體，不僅可簡單、快速、靈敏而且可以定量指示EV713C蛋白酶活性，代表EV71的復(fù)制水平。在抗EV71藥物存在的條件下，利用上述指示載體轉(zhuǎn)染含有EV71的細(xì)胞，收集細(xì)胞樣品，檢測細(xì)胞內(nèi)熒光素酶的表達(dá)量，以此測定細(xì)胞內(nèi)EV71復(fù)制及表達(dá)的抑制率，得到對EV71抑制效果的評價，具有較高的實(shí)際應(yīng)用價值，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。所述兩個小分子多肽pepA和pepB為可緊密結(jié)合且不影響細(xì)胞功能的蛋白分子；所述3C蛋白酶作用底物為Q/G的連接點(diǎn)。所述指示載體可在體外細(xì)胞水平表達(dá)，或通過轉(zhuǎn)基因的方式在動物體內(nèi)表達(dá)。具體來講，所述3C蛋白酶作用底物為Q/G的連接點(diǎn)的融合基因可命名為ANluc-Q/G-BCluc，含有下述核苷酸序列之一I)序列表中SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列；2)編碼序列表中的SEQ ID No. I所示的氨基酸序列的核苷酸序列；3)與序列表中SEQ ID No. 2限定的核苷酸序列具有90%以上同源性且其編碼的蛋白仍具有評價EV713C蛋白酶活性作用的核苷酸序列。序列表中的SEQ ID No. 2由1866個堿基組成，其編碼序列為自5’端第I位堿基開始編碼序列表中SEQ ID No. I的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，自5’端第I位堿基編碼p印A，自5’端第64位堿基編碼N端的螢火蟲熒光素酶片段，自5’端第1321位堿基編碼Q/G切割位點(diǎn)，自5’端第1351位堿基編碼pepB，自5’端第1414位堿基編碼C端螢火蟲熒光素酶 片段。上述融合基因ANluc-Q/G-BCluc編碼的融合蛋白，含有下述氨基酸殘基序列之I)序列表中的 SEQ ID No. I ；2)將序列表中SEQ ID No. I的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或者添加并具有評價EV713C蛋白酶活性作用的蛋白質(zhì)。序列表中的SEQ ID No. I由621個氨基酸殘基組成，自氨基端第I位氨基酸殘基為pepA,自氨基端第22位氨基酸殘基為N端的螢火蟲突光素酶片段，自氨基端第440位氨基酸殘基為Q/G切割為點(diǎn)，自氨基端第453位氨基酸殘基為P印B，自氨基端第472位氨基酸殘基為C端的螢火蟲熒光素酶片段。所述指示載體中反向插入的CMV-EGFP-SV40片段，如序列表中的SEQ ID No. 3所示。序列表中的SEQ ID No. 3由1557個堿基組成，起編碼序列為自5’端第I位堿基開始編碼CVM啟動子，自5’端第597位堿基編碼EGFP片段，自5’端第1470位堿基編碼SV40多聚A尾。由上述融合基因插入真核表達(dá)載體構(gòu)建而成的用于評價EV713C蛋白酶活性的指示載體也是本發(fā)明所要保護(hù)的。具體的，所述指示載體是將融合基因ANluc-Q/G-BCluc插入真核表達(dá)載體PCDNA3. l(+)-EGFP形成的，命名為pANluc ( Λ Q/G) BCluc-EGFP，其核苷酸序列如序列表中序列SEQ ID No. 4所示。應(yīng)用本發(fā)明所述的融合蛋白指示系統(tǒng)評價和篩選抗EV71藥物具有以下優(yōu)點(diǎn)I)可在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)綠色熒光蛋白，便于在體外直接觀察、控制指示載體的表達(dá)效率；2)通過觀察熒光素酶活性有效且便捷的顯示EV71在體外或體內(nèi)的感染情況；3)在有抗EV71藥物存在的情況下，通過熒光素酶活性的變化來篩選和評價抗EV71藥物的效果，操作簡單，觀察直觀、方便；4)真核細(xì)胞中不表達(dá)熒光素酶，因此在觀察及檢測指示載體時，無非特異性及自發(fā)突光的影響。


圖I是ANluc-Q/G-BCluc融合蛋白作用機(jī)制圖；圖2是指示載體ANluc (Q/G) BCluc-EGFP構(gòu)建策略；圖3是IVIS系統(tǒng)觀察EV713C蛋白對融合蛋白的切割作用；
圖4是IVIS系統(tǒng)觀察EV71對融合蛋白的切割作用；圖5是IVIS系統(tǒng)觀察IFN- α與GW5074對EV71復(fù)制的抑制作用；圖6是IVIS系統(tǒng)觀察指示載體在體內(nèi)對EV71感染的指示作用。
具體實(shí)施例方式抗EV71藥物的篩選和評價目前沒有一種很理想和直接的方法。本發(fā)明通過設(shè)計(jì)一種融合蛋白作為熒光檢測的指示載體，能通過檢測熒光素酶的表達(dá)量來得到EV71復(fù)制情況，在抗EV71藥物存在的情況下，可應(yīng)用于篩選和評價抗EV71藥物。本發(fā)明融合蛋白的設(shè)計(jì)，主要采用分片端螢火蟲熒光素酶策略，將兩段熒光素酶 分別與兩個可緊密結(jié)合的小分子多肽PepA和pepB結(jié)合，并利用Q/G是3C蛋白酶作用底物的特性，將底物片段Q/G插在兩段螢火蟲熒光素酶中間。再將該融合基因插入真核表達(dá)載體pCDNA3. I (+)，建立可用于指示3C蛋白酶活性的表達(dá)載體ANluc ( Λ Q/G) BCluc0ANluc ( Δ Q/G) BCluc表達(dá)載體在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)產(chǎn)生融合蛋白，在有3C蛋白酶共表達(dá)的情況下，在Q/G處發(fā)生切割作用，通過pepA和pepB的相互作用，帶動突光素酶N端和C端互補(bǔ)結(jié)合，從而形成完整的熒光素酶，通過測定熒光素酶活性便可反映出EV71的復(fù)制情況(如圖1)，在有抗EV71藥物存在的情況下，可用于篩選和評價抗EV71藥物。同時在真核表達(dá)載體中反向插入的EGFP片段可通過觀察綠色熒光的表達(dá)情況來指示其在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率。下面通過實(shí)驗(yàn)并結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，應(yīng)該理解的是，這些實(shí)施例僅用于例證的目的，決不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例I融合蛋白ANluc ( Δ Q/G) BCluc-EGFP真核表達(dá)載體的構(gòu)建I. lpCDNA3. I (+) -EGFP 質(zhì)粒平臺的構(gòu)建首先將質(zhì)粒pEGFP-Nl (購自Clontech公司，美國)中多克隆位點(diǎn)去掉構(gòu)建質(zhì)粒pEGFP-Nl’，然后擴(kuò)增CMV-EGFP-SV40片段，并將該片段反向插入pCDNA3. I (+)(購自Invitrogen公司，美國)的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建載體質(zhì)粒pCDNA3. I (+)-EGFP。根據(jù)EGFP (Genebank號GI1377911)的cDNA序列設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增EGFP基因片段的引物序列如下PI (上游引物)5，-ATATATGCTAGCATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3 ’P2 (下游引物)5’ -ATATAGCGGCCGCTTACTTGTACAGCTCGTCCA-3’擴(kuò)增CMV-EGFP-SV40片段的引物序列如下P3 (上游引物)5， -GCGCGCTCGAGTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTC-3，P4 (下游引物)5’ -GCCGGGAATTCGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTG-3’以pEGFP-Nl為模板，使用引物P1/P2擴(kuò)增EGFP片段。DNA聚合酶為primeSTARDNA Polymerase (購自日本 TaKaRa)。PCR 反應(yīng)如下95°C IOmin,95°C 45s，60°C 50s，72°C 45s 共 30 個循環(huán)，再 72°C充分延伸5min。膠回收純化EGFP片段，經(jīng)限制性內(nèi)切酶Nhe I和Not I雙酶切，與同樣經(jīng)過Nhe I和Not I雙酶切的質(zhì)粒pEGFP-Nl連接，得到載體質(zhì)粒pEGFP-Nl ’。
應(yīng)用引物P3/P4，以pEGFP-Nl’為模板，擴(kuò)增CMV-EGFP-SV40片段，DNA聚合酶為primeSTAR DNA Polymerase (購自日本 TaKaRa)。PCR 反應(yīng)如下95°C IOmin,95°C 45s，60°C 50s，72°C 45s 共 30 個循環(huán)，再 72°C充分延伸5min。膠回收純化后的CMV-EGFP-SV40片段(序列如SEQ ID No. 3)經(jīng)過Xho I和EcoR I雙酶切后，與經(jīng)過Xho I和EcoR I雙酶切的質(zhì)粒pCDNA3. I (+)，利用T4DNALigase連接，得到載體質(zhì)粒 PCDNA3. I (+) -EGFP。I. 2 指示載體 pANluc ( Δ Q/G) BCluc-EGFP 的構(gòu)建I. 2. IpANluc ( Δ Q/G) BCluc 基因片段的制備根據(jù)Fluc (Genebank 號GI76364278)的 cDNA 序列設(shè)計(jì) PCR 擴(kuò)增帶有 pepA 和EV713C蛋白酶裂解底物的N端螢火蟲熒光素酶片段(P印ANluc-Q/G)引物，序列如下 P5 (上游引物)5， -CCCAAGCTTATGAACGAAGCATATGTACATGACGGTCCTGTACGCTCACTGAACAGCGGCCGCAGAGGAGGAGAAGATGCCAAAAACATT-3，P6 (下游引物)5， -GCTTCCTTTCGTGCCTTGCCTCCTCCACCCTGAATACTTGCTCCTTGCATTACTGCGCCTCCTCCGCCGTCCTTGTCGATGAGAGCG-3，擴(kuò)增帶有P印B的C端螢火蟲熒光素酶片段(P印BCluc)引物序列如下P7 (上游引物)5， -GTATTCAGGGTGGAGGAGGCAAGGCACGAAAGGAAGCAGAACTGGCAGCAGCAACTGCAGAACAGAGCGGCCGCAGATACGTTAACAACCCCGA-3，P8 (下游引物)5’ -TATAGGATCCTTACACGGCGATCTTGCCGCCCTTCTTGGCCTT-3’以含有螢火蟲突光素酶基因的質(zhì)粒pGL4. 17 (購自Promega公司，美國)為模板，應(yīng)用上述引物PCR擴(kuò)增P印ANluc-Q/G、pepBCluc基因片段，DNA聚合酶為primeSTAR DNAPolymerase (購自日本 TaKaRa)。PCR 反應(yīng)如下95°C IOmin, 95°C 45s，60°C 50s, 72°C 45s 共 30 個循環(huán)，再 72°C充分延伸5min。膠回收純化P印ANluc-Q/G、pepBCluc基因片段，以純化后的兩個片段為模板，用引物 P5/P8 overlap PCR 擴(kuò)增 ANluc-Q/G-BCluc 基因片段，DNA 聚合酶為 primeSTAR DNAPolymerase (購自日本 TaKaRa)。Overlap PCR 反應(yīng)如下95°C IOmin0 95V 45s,60°C 50s, 72°C 45s，共 10 個循環(huán)，后向 PCR混合液加入上下游引物(P5 和 P8)，95°C 10min,95°C 45s, 60°C 50s, 72°C 45s，共 20個循環(huán)，再72 °C充分延伸5min。膠回收純化ANluc-Q/G-BCluc片段，經(jīng)過Hind III和BamH I雙酶切，回收后與Hind III和BamH I雙酶切的載體pCDNA3. I (+) -EGFP連接，得到指示載體pANluc ( Δ Q/G)BCluc-EGFP。本實(shí)施例得到的指示載體pANluc ( Δ Q/G) BCluc-EGFP序列見序列表中SEQNo. 4,其中ANluc-Q/G-BCluc基因編碼具有序列表中SEQ No. I所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，自5’端第I位堿基編碼pepA，自5’端第22位堿基編碼N端的螢火蟲熒光素酶片段，自5’端第440位堿基編碼3C的切割位點(diǎn)Q/G，自5’端第453位堿基編碼pepB，自5’端第472位堿基編碼C端的螢火蟲熒光素酶片段。具體操作中，所有限制性內(nèi)切酶及連接酶均購自日本TaKaRa公司，雙酶切反應(yīng)條件為37°C 4h，酶切產(chǎn)物的連接使用日本TaKaRa公司的T4DNA連接酶，按目的片段與各自載體5:1的質(zhì)量比建立連接體系，混勻后，4°C過夜連接，連接酶為T4DNA Ligase0 PCR及酶切產(chǎn)物經(jīng)電泳膠回收試劑盒均購自TransGene公司，操作參考試劑說明書。實(shí)施例2利用細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染表達(dá)EV713C蛋白的載體驗(yàn)證融合蛋白的作用I.載體 pEGFP-3C 的構(gòu)建 I. IpEGFP-Cl質(zhì)粒平臺的構(gòu)建以pcDNA3. I ( + )(購自美國Invitrogen)作為基本質(zhì)粒骨架，從pEGFP-Nl質(zhì)粒(購自美國Invitrogen)上擴(kuò)增出3’端帶有柔性連接的EGFP核酸片段，將綠熒光蛋白EGFP基因片段插入pcDNA3. I ( + )質(zhì)粒，構(gòu)建pEGFP-Cl質(zhì)粒平臺。根據(jù)EGFP (Genebank號GI1377911)的cDNA序列設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增3’端帶有柔性連接(5，GGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCG3’)的EGFP基因片段的引物序列如下P9 (上游引物)5 ’ -ATATATAGCTAGCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCT-3 ’PlO (下游引物)5，-GCTTTAAGCTTCGATCCGCCACCGCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCCTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3’以pEGFP-Nl質(zhì)粒為模板，使用引物P9、P10擴(kuò)增3’端帶有柔性連接的EGFP片段。PCR 反應(yīng)條件為95°C 10min,95°C 45s, 60°C 50s, 72°C 45s，共 30 個循環(huán)，再 72°C充分延伸5min。DNA 聚合酶為 primeSTAR DNA Polymerase (購自日本 TaKaRa)。膠回收 EGFP 片段進(jìn)行Nhe I/Hind III雙酶切，并與同樣經(jīng)過Nhe Ι/HindIII雙酶切的載體質(zhì)粒pCDNA3. I (+)連接，得到平臺質(zhì)粒pEGFP-Cl。I. I. 2pEGFP-3C 的構(gòu)建將EV713C蛋白編碼基因插入pEGFP_Cl柔性連接片段的3’端，構(gòu)建成為載體質(zhì)粒PEGFP-3C。根據(jù) EV713C(Genebank 號GI226510739)的 cDNA 序列設(shè)計(jì) PCR 擴(kuò)增 EV713C 的引物序列如下Pll (上游引物)5’ -ACAAGGGAAGCTTGGCCCTAGCCTTGATTTTGCTCT-3’P12 (下游引物)5 ’ -GCGCGCTCTAGATTGTTCACTAGCAAAGTAACTC-3 ’以質(zhì)粒PEV71 (姚昕，等。腸道病毒71型北京分離株全基因組序列分析。中華流行病學(xué)雜志。2009,30 (7):729-732。)為模板，應(yīng)用引物P11/P12擴(kuò)增3C基因片段，PCR反應(yīng)條件為95°C 10min,95°C 45s, 60°C 50s, 72°C 45s 共 30 個循環(huán)，再 72°C充分延伸 5min。將膠回收純化得到的3C基因片段通過Hind ΙΙΙ/Xba I與經(jīng)相同雙酶切處理后的pEGFP-Cl連接，得到EV713C的真核表達(dá)載體pEGFP-3C。I. I. 3pEGFP-m3C 的構(gòu)建將EV713C中第147個氨基酸從半胱氨酸突變?yōu)榻z氨酸，使其失去切割活性(Weng KF,Li ML, Hung C T,Shih S R.Enterovirus713C protease cleavesa novel targetCstF-64 and inhibits cellular polyadenylation.PLoSPathog. 2009, 5(9) :el000593.)，并將突變后的3C蛋白編碼基因(m3C)插入pEGFP-Cl柔性連接片段的3’端，構(gòu)建成為載體質(zhì)粒pEGFP-m3C。其中擴(kuò)增3C編碼基因上半段的引物序列如下Pll (上游引物)5’ -ACAAGGGAAGCTTGGCCCTAGCCTTGATTTTGCTCT-3，P13 (下游引物)5，-TCACCACTCCTCCCGACTGTCCT-3，擴(kuò)增3C編碼基因下半段的引物序列如下P14 (上游引物)5’ -CTAAAGCAGGACAGTCGGGAGGA-3’P12 (下游引物)5 ’ -GCGCGCTCTAGATTGTTCACTAGCAAAGTAACTC-3 ’

以質(zhì)粒pEV71為模板，應(yīng)用引物P11/P13擴(kuò)增3C基因上半段，PCR反應(yīng)條件為95°C IOmin,95°C 45s,60°C 50s, 72°C 45s 共 30 個循環(huán)，再 72°C充分延伸 5min。應(yīng)用引物P14/P12 擴(kuò)增 3C 基因下半段，PCR 反應(yīng)條件為95°C 10min,95°C 45s, 60°C 50s, 72°C 45s 共30個循環(huán)，再72°C充分延伸5min。應(yīng)用引物P11/P12將3C基因的上半段與下半段組合成完整的m3C基因片段，PCR反應(yīng)條件為95°C 10min,95°C 45s, 60°C 50s, 72°C 45s共30個循環(huán)，再72°C充分延伸5min。將膠回收純化得到的m3C基因片段通過Hind ΙΙΙ/Xba I與經(jīng)相同雙酶切處理后的pEGFP-Cl連接，得到EV713C的真核表達(dá)載體pEGFP_m3C。2.利用細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染PEGFP-3C驗(yàn)證指示系統(tǒng)2. I真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)將非洲綠猴腎細(xì)胞Vero細(xì)胞(購自美國ATCC)以5X IO4個/孔的密度鋪于24孔板內(nèi)，置于37°C、5%C02的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。至細(xì)胞生長面積為孔板底面積的85%-90%時，將 O. 8 μ g pEGFP-Cl、pEGFP-3C 與 pEGFP_m3C 分別與 O. 8 μ gpANluc ( Δ Q/G) BCluc-EGFP 共轉(zhuǎn)染至Vero細(xì)胞內(nèi)，所用的轉(zhuǎn)染試劑為Lipofectamine2000 (購自美國Invitrogen),轉(zhuǎn)染操作參考試劑說明書。2. 2培養(yǎng)24h后檢測熒光素酶表達(dá)水平試驗(yàn)結(jié)果見圖3，從試驗(yàn)結(jié)果可見，結(jié)果發(fā)現(xiàn)共轉(zhuǎn)染pEGFP-3C與pANluc ( Λ Q/G)BCluc-EGFP組，F(xiàn)luc活性要明顯高于對照組和m3C。說明該指示系統(tǒng)可以用來指示3C蛋白酶活性。應(yīng)用RT-PCR的方法及引物P11/P12從轉(zhuǎn)染后細(xì)胞RNA中擴(kuò)增3C編碼基因，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了 PEGFP-3C和pEGFP-m3C的細(xì)胞中均可發(fā)現(xiàn)3C的RNA表達(dá)。3.利用細(xì)胞內(nèi)感染EV71驗(yàn)證融合蛋白的作用將非洲綠猴腎細(xì)胞Vero細(xì)胞(購自美國ATCC)以5X IO4個/孔的密度鋪于24孔板內(nèi)，置于37°C、5%C02的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。至細(xì)胞生長面積為孔板底面積的85%-90%時，將O. 8 μ g指示載體pANluc ( Δ Q/G) BCluc-EGFP轉(zhuǎn)染至Vero細(xì)胞后24h，用MOI分別為I、O. 1,0. 01,0. 001和O的EV71國際標(biāo)準(zhǔn)株(腸道病毒71型(EV71)ICR乳鼠動物模型的建立，劉娟等，《軍事醫(yī)學(xué)》2011年第11期，現(xiàn)該EV71毒株保存在哈爾濱醫(yī)科大學(xué)。)攻擊Vero細(xì)胞，5h后應(yīng)用細(xì)胞活體熒光成像系統(tǒng)檢測細(xì)胞中熒光素酶活性。結(jié)果如圖4所示,感染EV71的Vero細(xì)胞中Fluc的活性明顯高于未感染組，同時Fluc的活性隨EV71感染量的遞減而降低，說明該指示系統(tǒng)可以用來指示EV71感染的水平。4.檢測IFN- α與GW5074對EV71復(fù)制的抑制作用
將非洲綠猴腎細(xì)胞Vero細(xì)胞(購自美國ATCC)以5X IO4個/孔的密度鋪于24孔板內(nèi)，置于37°C、5%C02的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。至細(xì)胞生長面積為孔板底面積的85%-90%時，將O. 8 μ g指示載體pANluc ( Δ Q/G) BCluc-EGFP轉(zhuǎn)染至Vero細(xì)胞后24h，用MOI=I的EV71 攻擊 Vero 細(xì)胞，Ih 后分別應(yīng)用濃度為 0、20、100、200、500IU/mL 和 0,2. 5、5、10、20 μ M的IFN-α和GW5074作用。4h后應(yīng)用細(xì)胞活體熒光成像檢測細(xì)胞中熒光素酶活性。結(jié)果如圖5所示，隨著藥物濃度的增高，細(xì)胞中Fluc的活性有所降低，說明IFN- α和GW5074對于EV71的復(fù)制均有抑制作用，而此指示系統(tǒng)可以用于抗EV71藥物的篩選。5.體內(nèi)驗(yàn)證融合蛋白對于EV71復(fù)制的指示作用將出生一天的ICR小鼠分為感染組和對照組，其中感染組小鼠顱內(nèi)注射20 μ LI X 107pfu/mL的EV71，對照組顱內(nèi)注射20 μ L PBS。感染后24h，向感染組和對照組均顱內(nèi)注射20 μ g指示質(zhì)粒。感染后2天和6天，分別應(yīng)用活體熒光成像系統(tǒng)觀察感染組 與對照組感染部位熒光表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)感染組小鼠頭部Fluc活性均比對照組升高，同時觀察到感染組小鼠體重明顯減輕同時出現(xiàn)明顯的EV71感染所致的神經(jīng)癥狀，如后肢麻痹及皮疹等現(xiàn)象(圖6)，說明該指示系統(tǒng)可以用來指示體內(nèi)EV71感染水平。以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，對本發(fā)明而言僅是說明性的，而非限制性的；本領(lǐng)域普通技術(shù)人員理解，在本發(fā)明權(quán)利要求所限定的精神和范圍內(nèi)可對其進(jìn)行許多改變，修改，甚至等效變更，但都將落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種用于篩選和評價抗腸道病毒71型藥物的融合蛋白，其特征在于所述的融合蛋白含有以下(a)或(b)所示的氨基酸序列 (a)SEQ ID No 1所示的氨基酸序列；或 (b)將SEQID No. I所示的氨基酸序列經(jīng)過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或者添加仍具有評價EV713C蛋白酶活性作用的氨基酸序列。
2.如權(quán)利要求I所述的融合蛋白，其特征在于所述的融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo 1所示。
3.編碼權(quán)利要求I或2所述的融合蛋白的核苷酸序列，其特征在于所述的核苷酸序列含有以下(a)、(b)或(C)所示的核苷酸序列 (a)SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列；或 (b)編碼SEQID No :1所示的氨基酸序列的核苷酸序列；或 (c)與SEQID No. 2所示的核苷酸序列具有90%以上同源性且其編碼的蛋白質(zhì)具有評價EV713C蛋白酶活性作用的核苷酸序列。
4.如權(quán)利要求3所述的核苷酸序列，其特征在于所述的核苷酸序列如SEQIDNo. 2所/Jn o
5.一種重組表達(dá)載體，其特征在于含有權(quán)利要求3或4所述的核苷酸序列。
6.如權(quán)利要求5所述的重組表達(dá)載體,其特征在于所述的重組表達(dá)載體為雙突光報(bào)告載體，其由以下方法構(gòu)建得到 (1)將編碼熒光素酶的N段與C段的核苷酸序列分別與編碼兩個可緊密結(jié)合的小分子多肽p印A與p印B的核苷酸序列之一連接，得到的兩個片段由編碼EV713C蛋白酶作用底物的核苷酸片段相連，得到融合基因； (2)將此融合基因插入真核表達(dá)載體p⑶NA3.I (+)中，建立了可用于指示EV713C蛋白酶活性的表達(dá)載體； (3)將N端和C端分別帶有巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子和猴空泡病毒40多聚腺苷酸尾(SV40polyA tail)的綠色熒光蛋白(EGFP)，稱為CMV-EGFP-SV40片段，反向插入步驟(2)得到的真核表達(dá)載體中，得到所述的雙熒光報(bào)告載體。
7.如權(quán)利要求6所述的重組表達(dá)載體，其特征在于所述的雙突光報(bào)告載體為pANluc( A Q/G)BCluc-EGFP，其核苷酸序列如 SEQ ID No. 4 所示。
8.—種宿主菌,其特征在于含有權(quán)利要求5-7任一項(xiàng)所述的重組表達(dá)載體。
9.權(quán)利要求I或2所述的融合蛋白在制備指示3C蛋白酶活性、指示EV71感染的水平的試劑或在篩選和評價抗腸道病毒71型藥物中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求3或4所述的核苷酸序列在制備指示3C蛋白酶活性、指示EV71感染的水平的試劑或在篩選和評價抗腸道病毒71型藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于篩選和評價抗腸道病毒71型(EV71)藥物的融合蛋白及其應(yīng)用，所述融合蛋白是以螢火蟲熒光素酶(Fluc)為報(bào)告基因，將兩個可緊密結(jié)合的小分子多肽pepA和pepB分別與螢火蟲熒光素酶N端和C端片段結(jié)合，中間由EV713C蛋白酶作用底物相連，然后將此融合基因插入真核表達(dá)載體后表達(dá)產(chǎn)生。同時反向插入的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)可在體外轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中通過觀察綠色熒光情況指示其轉(zhuǎn)染效率。利用本發(fā)明提供的指示載體，不僅可簡單、快速、靈敏地定量指示EV71的復(fù)制情況，同時可以應(yīng)用于篩選和評價抗EV71藥物，具有較高的實(shí)際應(yīng)用價值，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N15/66GK102766607SQ20121025549
公開日2012年11月7日 申請日期2012年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月23日
發(fā)明者佟雷, 林樂勛, 趙文然, 郭志偉, 鐘照華 申請人:哈爾濱醫(yī)科大學(xué)