專利名稱：何首烏藥材的指紋圖譜、其建立方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于中藥質量控制技術領域，具體而言，本發明涉及何首烏藥材的指紋圖 譜及其建立方法，以及所述指紋圖譜在何首烏藥材質量控制中的應用。
背景技術：
何首烏為蓼科植物Polygonum, multiflorum. Thynb.的干燥塊根，多為野生品，廣 東德慶栽培的何首烏為地道藥材。臨床多制用，主要為補肝腎、益精血、烏須發、強筋骨藥。 由于中藥的復雜性，目前仍是采用傳統的藥材鑒別方式，而這種依靠經驗監控藥材質量的 方法具有很大的局限性。中藥指紋圖譜是指某種中藥材及其制劑中所共有的、具有特征性的某類或數類成 分的色譜或光譜的圖譜。在現階段，中藥的有效成分絕大多數沒有得到明確，指紋圖譜的建 立對于有效控制中藥材及其制劑的質量具有十分重要的意義。對于何首烏藥材，由于其成 分復雜，以各個單一成分為指標的研究較多，但具體某一成分都不能真正反映藥材的質量， 而綜合研究其指紋圖譜以控制質量的還未有統一標準。因此，目前存在對于能夠全面表征何首烏藥材的成分特征的指紋圖譜的需求，何 首烏藥材的質量控制方法和質量控制標準也有待于進一步完善。

發明內容
為了解決上述技術問題，本發明的一個目的是提供一種何首烏藥材的指紋圖譜。本發明的另一個目的是所述指紋圖譜的建立方法。本發明又一個目的是提供所述指紋圖譜在監控何首烏藥材和含有何首烏藥材的 藥物制劑的質量中的應用。本發明的目的是通過以下技術方案來實現的。一方面，本發明提供一種何首烏藥材的指紋圖譜，其中，所述指紋圖譜為將何首烏 藥材通過高效液相色譜分析得到的HPLC指紋圖譜。在上述指紋圖譜中優選包括11個特征峰，以4號峰二苯乙烯苷峰為參照峰，具體 操作見實施例3，各特征峰的相對保留時間和相對標準偏差為1號峰相對保留時間0.3421 士 0.0008，相對標準偏差0.1047%
2號峰相對保留時間0.4183士0.0050，相對標準偏差0.9714%
3號峰相對保留時間0.6848 + 0.0007，相對標準偏差0.0528%
4號峰相對保留時間1.0000 ；
5號峰相對保留時間1.0824 士 0.0009，相對標準偏差0.0512%
6號峰相對保留時間1.9242 士 0.0079，相對標準偏差0.2999%
7號峰相對保留時間2.1200士0.0084，相對標準偏差0.2753%
8號峰相對保留時間2.1909士0.0100，相對標準偏差0.3293%
9號峰相對保留時間2.4416士0.0110，相對標準偏差0.3186%
10號峰相對保留時間2. 8972士0. 0150，相對標準偏差0. 3142% ；11號峰相對保留時間3. 0627士0. 0161，相對標準偏差0. 3161%。優選地，所述何首烏藥材產自廣東德慶。另一方面，本發明提供上述指紋圖譜的建立方法，該方法包括(1)制備何首烏藥材溶液和對照品溶液；(2)將步驟(1)中制備的何首烏藥材溶液和對照品溶液分別進行高效液相色譜分 析，得到何首烏藥材和對照品的HPLC圖譜；(3)通過比較不同何首烏藥材的HPLC圖譜確定何首烏藥材的共有的特征峰。優選地，所述步驟(1)中，制備何首烏藥材溶液包括將何首烏藥材溶于甲醇，水 浴回流，濾過，濾液蒸干，將殘渣溶解于甲醇，過微孔濾膜；制備對照品溶液包括精密稱取二苯乙烯苷適量，溶于甲醇，配制成0. 2mg/ml的 溶液。優選地，所述步驟(2)中，高效液相色譜分析的分析條件包括采用反相填料色譜 柱；檢測波長200 400nm，流速0. 1 5ml/min，柱溫0 60°C，進樣量1 100 μ 1，流 動相為乙腈-磷酸水溶液；進一步優選地，所述高效液相色譜分析的分析條件包括采用 Phenomenx-C18色譜柱；檢測波長280nm，流速1. Oml/min,柱溫25°C，分析時間65min，進樣 量10 μ 1，流動相為乙腈-0. 4% V/V磷酸水溶液。優選地，所述步驟(2)中采用梯度洗脫液進行洗脫，洗脫條件包括O 15min 乙腈體積比為 15% 18%，15 50min 為 18% 40%，50 60min 為 40 % 100 %，60 67min 保持 100 %。優選地，所述步驟(3)中，通過采用藥典委員會規定的指紋圖譜計算軟件A版比較 不同何首烏藥材的HPLC圖譜，從而確定何首烏藥材的共有的特征峰；進一步優選地，所述步驟(3)還包括將步驟(2)得到的對照品的色譜峰在何首烏 藥材的HPLC圖譜中所對應的色譜峰作為參照峰，計算各特征峰的相對保留時間和相對標 準偏差；進一步優選地，所述步驟(3)還包括根據參照峰計算各特征峰的相對峰面積和相 對標準偏差。又一方面，本發明提供上述指紋圖譜在監控何首烏藥材和包含何首烏藥材的相關 藥物制劑的質量中的應用；優選地，所述何首烏藥材為產自廣東德慶的何首烏藥材。再一方面，本發明提供何首烏藥材的質量檢測方法，所述方法包括將待測何首烏 藥材的HPLC圖譜和本發明提供的上述指紋圖譜進行比較。與現有技術相比，本發明具有的有益效果在于本發明通過全面，系統的研究，依據國家藥品監督管理局頒布的《中藥注射劑指紋 圖譜研究的技術要求(暫行)》和國家藥典委員會印發的《中藥注射劑指紋圖譜實驗研究技 術指南(試行)》，對廣東德慶道地的何首烏藥材進行了液相指紋圖譜測定，建立的指紋圖 譜具有穩定，重現性好的特點，該研究有助于德慶何首烏藥材的標準化種植和質量控制，同 時可將何首烏指紋圖譜與二苯乙烯苷、大黃素和大黃素甲醚的含量測定結合起來全面控制 德慶何首烏藥材的質量，從而為科學合理的控制德慶何首烏藥材的質量奠定堅實的基礎。 此外，該指紋圖譜的建立方法可操作性強，重現性好，為更好地控制道地何首烏藥材質量提 供了科學依據。


以下，結合附圖來詳細說明本發明的實施例，其中圖1為二苯乙烯苷對照品圖譜。圖2為大黃素對照品圖譜。圖3為大黃素甲醚對照品圖譜。圖4為10批何首烏藥材HPLC色譜分離疊加圖，其中從下到上依次為第1_第10 批。圖5為何首烏HPLC指紋圖譜，其中4號峰為二苯乙烯苷，10號峰為大黃素，11號 峰為大黃素甲醚。
具體實施例方式下面結合具體的實施例，并參照數據進一步詳細描述本發明。應理解，這些實施例 只是為了舉例說明本發明，而非以任何方式限制發明的范圍。在以下的實施例中，未詳細描述的各種過程和方法是本領域中公知的常規方法。 所用試劑的來源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現時標明，其后所用相 同試劑如無特殊說明，均以首次標明的內容相同。棚列1身鄉·諭夜靜逝_立儀器與試劑AgilentllOO型高效液相色譜儀，含在線真空脫氣機、二元梯度泵、柱溫箱、DAD 檢測器；甲醇、磷酸為分析純，乙腈為色譜純，水為超純水；10批何首烏藥材均產于廣東德 慶，批號分別為 040209、040320、040426、040506、040512、040705、040729、040809、041018、 050204。經江西中醫學院鑒定教研室鑒定為蓼科植物Polygonum, multiflorum. Thynb的 干燥塊根。對照品2，3，5，4_四羥基二苯乙烯-2-o-i3-D-葡萄糖苷(簡稱二苯乙烯苷， 0844-200003)、大黃素(110756-200110)、大黃素甲醚(0758-2002006)，購自中國藥品生物 制品檢定所；色譜柱為Phenomenx-C18 (5 μ m，250 X 4. 6mm)色譜柱；微孔濾膜為津騰0. 45 μ m 的微孔濾膜，購自天津市津騰實驗設備有限公司。分析方法色譜分析條件包括=Phenomenx-C18 (5 μ m, 250 X 4. 6mm)色譜柱；檢測波長280nm ； 流速1. Oml/min ；柱溫25°C。分析時間65min，進樣量10 μ 1。流動相為乙腈-0. 4%磷酸 水溶液，梯度洗脫0 15min乙腈為15% 18%，15 50min為18% 40%，50 60min 為 40 % 100 %，60 67min 保持 100 %。供試品溶液的制備精密稱取10批何首烏藥材粉末(過4號篩)各0.4g，加入甲醇75ml，水浴回流 60min,放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇IOml溶解。取上清液過0. 45 μ m的微孔濾膜。對照品溶液的制備精密稱取二苯乙烯苷20mg，加入甲醇IOml溶解定容，配制成 0. 2mg/ml的溶液。HPLC結果取供試品濾液和對照品溶液各10μ 1，按上述色譜條件分析，得到各樣 品的HPLC指紋圖譜。對照品二苯乙烯苷、大黃素和大黃素甲醚的HPLC結果分別見圖1-3。10種何首烏藥材的HPLC疊加圖見圖4。棚列2 諭夜靜逝糊可IT絲鮮·對實施例1中建立的鑒定何首烏藥材的高效液相色譜法進行了以下幾個方面的考察。重現性試驗取何首烏藥材(批號050204)，按實施例1中供試品的制備方法制備樣品6份，依 次測定，考察色譜峰的相對保留時間、峰面積比值的一致性。計算相對保留時間和相對面積 RSD均小于3. 0%，結果表明該方法具有良好的重現性。精密度試驗取同一份供試品溶液(批號050204)，連續進樣6次，考察色譜峰的相對保留時間、 峰面積比值的一致性。計算相對保留時間和相對面積RSD均小于3. 0%，結果表明儀器精密 度符合要求。穩定性試驗取同一供試品溶液(批號050204)，在0小時、2小時、4小時、8小時、12小時、16 小時、20小時、24小時內連續進樣8次，記錄各共有色譜峰的保留時間和面積，通過計算相 對保留時間和相對面積RSD均小于3. 0%，結果表明常溫下供試品溶液在24小時內保持穩定。_仿丨丨3 10 _躲__儲_白搬寸龍_、麵山條■禾口■胃 數進行了實施例1中10批德慶何首烏藥材的樣品分析，以4號峰(即二苯乙烯苷) 為參照峰，各指紋峰的相對保留時間的RSD值基本都低于1.0% (見表1)。但相對峰面積 RSD值都較大(見表2)。可能是不同批次藥材采收時間的不同，其中成分含量的差異所致。表1 10批何首烏藥材共有峰的相對保留時間
批號特征指紋峰相關 系數1234(s)5678910110402090.34290.42230.68521.00001.08191.92042.11612.18612.43602.89053.05551.00000403200.34230.42150.68461.00001.08151.91892.11472.18432.43462.88893.05401.00000404260.34230.42160.68461.00001.08201.91962.11532.18502.43532.88983.05481.00000405060.34210.42130.68471.00001.08171.91892.11472.18422.43442.88903.05401.00000405120.34200.42130.68441.00001.08231.91732.11282.18282.43262.88733.05241.00000407050.34190.42040.68431.00001.08271.92502.12132.19182.44272.89993.06581.00000407290. 34200. 41390. 68511. 00001. 08291.93032. 12592. 19862. 44982.90653. 07250. 99990408090. 34220. 41380. 68551. 00001. 08311.93212. 12832. 20092. 45262. 91223. 07880. 9999
權利要求
1.一種何首烏藥材的指紋圖譜，其中，所述指紋圖譜為將何首烏藥材通過高效液相色 譜分析得到的HPLC指紋圖譜。
2.如權利要求1所述的指紋圖譜，其中，所述指紋圖譜中包括11個特征峰，以4號峰二 苯乙烯苷峰為參照峰，各特征峰的相對保留時間和相對標準偏差為1號峰相對保留時間0. 3421 士0. 0008，相對標準偏差0. 1047% ； 2號峰相對保留時間0. 4183士0. 0050，相對標準偏差0. 9714% ； 3號峰相對保留時間0. 6848士0. 0007，相對標準偏差0. 0528% ； 4號峰相對保留時間1.0000;5號峰相對保留時間1. 0824士0. 0009，相對標準偏差0. 0512% ； 6號峰相對保留時間1. 9242士0. 0079，相對標準偏差0. 2999% ； 7號峰相對保留時間2. 1200士0. 0084，相對標準偏差0. 2753% ； 8號峰相對保留時間2. 1909士0. 0100，相對標準偏差0. 3293% ； 9號峰相對保留時間2. 4416士0. 0110，相對標準偏差0. 3186% ； 10號峰相對保留時間2. 8972士0. 0150，相對標準偏差0. 3142% ； 11號峰相對保留時間3. 0627士0. 0161，相對標準偏差0. 3161%。
3.如權利要求1-3中任一項所述的指紋圖譜，其中，所述何首烏藥材產自廣東德慶。
4.如權利要求1-4中任一項所述的指紋圖譜的建立方法，其中，所述方法包括(1)制備何首烏藥材溶液和對照品溶液；(2)將步驟(1)中制備的何首烏藥材溶液和對照品溶液分別進行高效液相色譜分析， 得到何首烏藥材和對照品的HPLC圖譜；(3)通過比較不同何首烏藥材的HPLC圖譜確定何首烏藥材的共有的特征峰。
5.如權利要求5所述的建立方法，其中，所述步驟(1)中，制備何首烏藥材溶液包括: 將何首烏藥材溶于甲醇，水浴回流，濾過，濾液蒸干，將殘渣溶解于甲醇，過微孔濾膜；制備對照品溶液包括精密稱取二苯乙烯苷，加入甲醇溶解定容，配制成0. 2mg/ml的 溶液。
6.如權利要求5或6所述的建立方法，其中，所述步驟(2)中，高效液相色譜分析的分 析條件包括采用反相填料色譜柱；檢測波長200 400nm，流速0. 1 5ml/min，柱溫0 60°C，進樣量1 100 μ 1，流動相為乙腈-磷酸水溶液；優選地，所述高效液相色譜分析的分析條件包括采用Phenomenx-C18色譜柱；檢測波 長280nm,流速1. Oml/min,柱溫25°C，分析時間65min,進樣量10 μ 1，流動相為乙腈-O. 4% V/V磷酸水溶液。
7.如權利要求5-7中任一項所述的建立方法，其中，所述步驟(2)中采用梯度洗脫液進 行洗脫，洗脫條件包括O 15min乙腈體積比濃度為15% 18%，15 50min乙腈為18% 40%，50 60min 乙腈為40% 100%，60 67min乙腈保持100%。
8.如權利要求5-8中任一項所述的建立方法，其中，所述步驟(3)中，通過采用藥典委 員會規定的指紋圖譜計算軟件A版比較不同何首烏藥材的HPLC圖譜，從而確定何首烏藥材 的共有的特征峰；優選地，所述步驟(3)還包括，將步驟(2)得到的對照品的色譜峰在何首烏藥材的HPLC圖譜中所對應的色譜峰作為參照峰，計算各特征峰的相對保留時間和相對標準偏差；進一 步優選地，所述步驟(3)還包括根據參照峰計算各特征峰的相對峰面積和相對標準偏差。
9.如權利要求1-4中任一項所述的指紋圖譜在監控何首烏藥材和包含何首烏藥材的 相關藥物制劑的質量中的應用；優選地，所述何首烏藥材為產自廣東德慶的何首烏藥材。
10.一種何首烏藥材的質量檢測方法，所述質量檢測方法包括將待測何首烏藥材的 HPLC圖譜和如權利要求1-4中任一項所述的指紋圖譜進行比較。
全文摘要
本發明公開了一種何首烏藥材的質量控制方法，所述指紋圖譜為將何首烏藥材通過高效液相色譜分析得到的HPLC指紋圖譜。該指紋圖譜可用于全面監控原料何首烏的質量，以確保何首烏和包含何首烏的相關藥物制劑的質量穩定、均一。本發明還公開了所述何首烏藥材的指紋圖譜的建立方法及其應用。
文檔編號A61K36/704GK102114083SQ20111000817
公開日2011年7月6日 申請日期2011年1月4日 優先權日2011年1月4日
發明者程文勝, 薄雯映, 許冬瑾, 陳華師, 馬興田 申請人:康美藥業股份有限公司