本發明涉及一種蜂蠟藥物的檢測方法，特別涉及一種蜂蠟GC標準指紋圖譜的構建方法，以及由此法得到的蜂蠟GC標準指紋圖譜。

背景技術：

中藥指紋圖譜是指中藥原料藥材、飲片、成品、半成品等經適當處理后，采用一定的分析手段，得到的能夠標示其特征共有峰的圖譜。中藥指紋圖譜能客觀地揭示和反映中藥內在質量的整體性和特征性,用以評價中藥的真實性、有效性、穩定性和一致性。中藥的臨床療效并非由單一活性成分的作用或多種活性成分作用的簡單相加,用已知某一個或幾個活性成分或有效成分為質量指標,通過定性和定量分析來判斷藥品質量的優劣,顯然是不全面的。中藥質量的評價需要綜合的、宏觀的、非線性的質量評價體系,中藥指紋圖譜就是能較好地適應這一特點的一種質量評價與控制模式。天然藥和草藥,都把指紋圖譜作為質量控制標準的內容之一。歐共體對草藥質量的指南中也稱,單靠測定某有效成分考察質量的穩定性是不夠的,因為草藥及其制劑是以整體為活性物質。世界衛生組織(WHO)在1996年草藥評價指導原則中規定:如果草藥的活性成分不明,可以提供特征色譜圖譜,以證明產品質量的一致。因此指紋圖譜是中藥現代化和國際化的關鍵技術之一。

蜂蠟為蜜蜂科昆蟲中華蜂蜜或意大利蜂分泌的蠟質。其主要成分有酯類、游離的烷醇類、烷酸類、維生素、芳香類物質等。蜂蠟具有多種藥理作用，比如降血脂、抑菌、治療胃潰瘍等藥理作用，因此蜂蠟在醫藥行業具有廣泛的應用。

2010版《中國藥典》僅有性狀鑒別的描述，理化鑒別、檢查項、含量測定等項均為空白，上述標準不能有效的監控蜂蠟的質量優劣。

技術實現要素：

為了解決上述問題，本發明建立了一種合理、準確評價蜂蠟整體性質量的標準指紋圖譜，以及該指紋圖譜的構建方法。

本發明的目的在于提供一種原料藥蜂蠟GC標準指紋圖譜的構建方法。

本發明的另一目的在于提供原料藥蜂蠟GC標準指紋圖譜。

本發明所采用的技術方案是：

一種原料藥蜂蠟GC標準指紋圖譜的構建方法，包括以下步驟：

1)從全國各不同地區收集不同批次的蜂蠟10批，進行編號。

2)對蜂蠟進行預處理，清理其中的雜質。方法是水浴加熱至80℃然后冷凝，取上層固體蜂蠟使用。

3)制備蜂蠟供試品溶液：精密稱取蜂蠟50mg置于50ml容量瓶中，加入三氯甲烷，超聲使其完全溶解，定容，使得蜂蠟溶液的濃度為1mg/ml左右。

4)空白溶液的制備：取少量三氯甲烷溶液置于氣相色譜進樣瓶中，作為空白溶液和色譜峰相對保留時間的對照。

5)蜂蠟的GC指紋圖譜的建立：分別取供試品溶液和空白溶液，進樣，用安捷倫氣相色譜儀進行測定，色譜柱HP-5用(5％-苯基)-甲基聚硅氧烷為填充劑，氮氣為載氣流速為5mL/min，檢測器為氫火焰檢測器，檢測器溫度為310℃，進樣口溫度為330℃，分流比為20：1，氫氣流速為40mL/min，空氣流速為30mL/min，進樣量為1μL，柱箱升溫方式為280℃維持15min。記錄供試品的保留時間和峰面積，即得蜂蠟的GC指紋圖譜。

本發明的步驟1)所述的收集蜂蠟的不同產地，從1-10進行編號。

以上本發明的該指紋圖譜中有11個共有特征峰，從左到右編號為1-11，記錄11個共有峰的保留時間，編號為1至11號的特征峰的保留時間依次分別為2.105-2.117min，2.490-2.514min，2.759-2.790min，3.102-3.112min，3.512-3.564min，4.028-4.091min，4.664-4.742min，5.304-5.396min，5.441-5.536min，6.387-6.483min，7.279-7.414min。

氣相色譜儀測定至少10批蜂蠟供試品溶液的指紋圖譜，并進行分析比較，并采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統A版進行相似度分析，相似度評價見下表1，各批次供試品相似度與第一批相比均大于0.8。

表1

本發明的有益效果是：

1)本發明建立了原料藥蜂蠟GC標準指紋圖譜，代表著蜂蠟中的部分化學成分，能有效的表征蜂蠟原料藥的質量，從而實現對蜂蠟中含量較多的化學成分的檢測，有利于其質量的全面監控。

2)本發明建立原料藥蜂蠟GC標準指紋圖譜作為一個整體，注重各個構成指紋特征峰的前后順序，注重整體面貌特征，避免了因只測定一、二個化學成分而判定蜂蠟整體質量的片面性。本發明為更全面、準確評價蜂蠟的質量提供了新的對照標準，能更好保證蜂蠟的質量及其臨床療效。

3)本發明具有方法簡單、穩定性好、精密度高的特點，使用于蜂蠟原料藥的整體質量控制。

4)本發明建立的指紋圖譜中共有峰分離度良好，特征明顯，具有較好的專屬性。

附圖說明

圖1是蜂蠟的GC參照指紋圖譜；

圖2是1-8號產地蜂蠟相似度結果評價示意圖；

圖3是9-10號產地蜂蠟相似度結果評價示意圖。

具體實施方式

下面結果實施例對本發明做進一步的詳述，但并不局限于此。

實施例1：

由1-10批蜂蠟的產地分別為蘭州、鄭州、慶陽、威海、成都、煙臺、哈爾濱、大連、廣元、濟南10個地方。

1.儀器與試劑

儀器：島津GC-2014C氣相色譜儀，日本島津公司；BS224S電子分析天平，感量0.0001g，德國Sartorius公司；中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統A版，國家藥典委員會。

試劑：三氯甲烷，分析純，500mL/瓶，批號：20131201，廣州化學試劑廠。

2.氣相測定的色譜條件：

色譜柱為HP-5，規格為30m*0.25mm*0.1um(安捷倫公司產品)，色譜柱填料為(5％-苯基)-甲基聚硅氧烷，檢測器為氫火焰檢測器，檢測器溫度為310℃，進樣口溫度為330℃，載氣為N₂，載氣流速為5mL/min，氫氣流速為40ml/min，空氣流速為30ml/min，進樣量:1μL(設置進樣前清洗進樣針5次和進樣后清洗進樣針10次)，分流比為20：1，柱箱升溫方式：280℃維持15min。

3.蜂蠟GC指紋圖譜的建立：

1)供試品溶液制備

分別精密稱取蜂蠟50mg置于50ml容量瓶中，加入三氯甲烷，超聲使其完全溶解，定容，使得蜂蠟溶液的濃度為1mg/ml左右。

2)蜂蠟指紋圖譜的建立

分別精密吸取適量供試品溶液置于進樣瓶中，進行氣相測定，得到色譜圖。比較供試品的指紋圖譜，挑選11個特征共有峰，記錄共有峰的保留時間和峰面積，如圖二、三所示。

3)穩定性檢測

為進一步確定該檢測方法有效，取同一批蜂蠟供試品溶液，分別在0h、4h、8h、12h、16h、20h幾個時間點進樣，記錄11個共有峰的保留時間和峰面積，計算其RSD，如圖一所示。

穩定性實驗結果11個共有峰的保留時間和峰面積的RSD均小于1％，供試品穩定性良好。

4)重復性檢測。

取同批次蜂蠟的供試品溶液，連續進樣6次，檢測所得指紋圖譜，考察11個共有色譜峰的相對保留時間和峰面積的一致性，由RSD大小進行判定。

重復性實驗結果表明蜂蠟11個共有峰的相對保留時間及峰面積的RSD均在1％以內，實驗重復性符合要求。

為本領域的專業技術人員容易理解,以上所述僅為本發明專利的較佳實施例,并不用以限制本發明,凡本發明的精神和原則之內所作的任何修改。等同替換和改進等,均落在本發明要求的保護范圍之內。