專利名稱：一種用于烏頭類中藥毒性效價檢測的生物檢定方法及裝置的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種烏頭類中藥毒性效價檢測的生物檢定方法及裝置。
背景技術：
附子、川烏、草烏等烏頭類中藥在臨床上應用十分廣泛，特別是附子在危重癥的搶救和久治不愈的疑難病例的治療中發揮了突出的作用，自古為中藥回陽救逆之第一品。烏頭類中藥有一個共同的特點，即均有劇毒，治療量和致死量接近，安全窗較窄，這給臨床安全用藥帶來巨大挑戰，如附子被稱為“最有用亦最難用”的中藥。雙酯型生物堿是烏頭類中藥的主要毒性成分，主要包括烏頭堿、新烏頭堿與次烏頭堿三種，其毒性極強，主要是對神經和心血管系統造成嚴重傷害，人口服烏頭堿0. 2mg即可引起中毒，致死量為2 5mg。由于烏頭類中藥藥性劇烈，作用時間短，且治療劑量與中毒劑量、致死劑量接近，因用藥不慎而中毒甚至死亡的情況在臨床上屢見不鮮。因此，評價藥物的安全性是烏頭類中藥質量控制的重中之重。現在控制烏頭類中藥毒性的方法主要是用高效液相色譜等分析手段測定烏頭堿、 新烏頭堿與次烏頭堿三種雙酯型生物堿的含量。但是，現行的烏頭類藥材安全性控制方法和標準存在諸多局限性，無法滿足生產和臨床的需要。中藥本身是一個具有多成分、多作用靶點特性的復雜體系，不同成分之間在活性上一般存在著協同、拮抗等諸多相互作用，簡單的測定幾個特定成分往往難以表征藥物的整體藥效或毒性。例如，烏頭類藥材中毒性物質種類較多，除了雙酯型生物堿外，其他生物堿也有毒，三種雙酯型生物堿的含量并不能準確的表征藥材的整體毒性。已進行的藥理實驗也表明藥材總提物的毒性遠遠大于三種雙酯型生物堿毒性的總和，不同批次藥材之間甚至出現三種雙酯型生物堿含量較低但總毒性高的現象，這樣會給臨床用藥帶來很大風險。其次，三種雙酯型生物堿含量的測定無法直觀地說明藥材毒性的大小，不利于不同藥材毒性大小的比較和安全性控制。因此，需要一種能夠直觀、客觀地標示出烏頭類藥材的總毒性大小，保障臨床用藥安全性的烏頭類中藥毒性檢測方法。

發明內容
本發明的首要目的是提供一種烏頭類中藥毒性效價檢測的生物檢定方法。本發明的另一個目的是提供一種用于烏頭類中藥毒性效價檢測的生物檢定方法的裝置。本發明的烏頭類中藥毒性效價檢測的生物檢定方法包括下述步驟a.標準品溶液和標準品稀釋液的配制用無水乙醇將標準品配制成lmg/ml的標準品溶液，在4°C下貯存；測定時，用0. 9%的氯化鈉溶液稀釋得標準品稀釋液，標準品稀釋液的注射體積不得大于動物單次靜脈注射最大承受體積；b.供試品溶液和供試品稀釋液的配制稱取過10 100目篩的供試品粉末，置于錐形瓶中，加入其重量(g) 5 15倍體積(ml)的50% 95%的乙醇，浸泡30分鐘，超聲處理15 60分鐘；用孔徑0. 2 μ m的微孔濾膜過濾提取液，濾液減壓濃縮至原來體積的十分之一得供試品溶液。測定時，估計供試品效價，用0. 9%氯化鈉溶液對供試品溶液進行稀釋得供試品稀釋液。調節供試品稀釋液濃度使其注射體積與標準品稀釋液注射體積相近；C.測定取健康合格的動物，試驗前M小時移去飼料，但仍給予飲水，臨試驗前準確稱重，每次試驗所用動物的體重相差不得超過體重均值的20% ；將動物平均分為兩組，每組至少6只，一組注入所述標準品稀釋液，另一組注入所述供試品稀釋液；將動物用固定器固定，于靜脈中插入注射針頭，用勻速注射儀以每分鐘0. 2 1. Oml的速度勻速連續注入藥液，至動物中毒死亡立即停止注入；以動物瞳孔迅速放大、呼吸停止為注入終點；分別記錄所注入的以ml計的標準品稀釋液和供試品稀釋液的總量；d.按中國藥典2010版二部附錄XI V生物檢定統計法中的直接測定法計算毒性效價及實驗誤差，可信限率FL%不得超過15% ；直接測定法的計算公式如下xs和&為標準品⑶和供試品⑴組各只動物的對數最小致死量，它們的均值& 和4為S和T的對數等反應劑量；M是S和T對數等反應劑量之差，即Λ/= & — (1);R是 S 和 T 等反應劑量的比值，即i = antilg(&—JT) = antilgA/ (2);ns和ητ為S和T組的動物數； Pt是T的測得效價，At為T的估計效價，Pt = AT · R (3)；
方差2 _ S
ns+nT-2
⑷; M 的標準誤& =(5);
]j ns-nT自由度f = ns+nT_2，用此自由度查t值表得t值(P = 0. 95)；Pt 的可信限 FL = At · antilg(M士 t · Sm) (6)；
^001 D 的f ■卞譏 O/ — Aantilg (M + tSu)-ATmtHg (Μ-^m)Pt 的可f目限率hL·/。— -—- (7)。優選地，所使用的動物可以是大鼠、小鼠、豚鼠、鴿子、青蛙中的一種。所采用的標準品可為烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿中的一種。當選用同一標準品， 所使用動物不同時，藥材毒性效價(即標準品當量)不變。本發明的用于烏頭類中藥毒性效價檢測的生物檢定方法的裝置包括固定器、帶導管的針頭和勻速注射儀，其特征在于所述帶導管的針頭的針頭端插入固定在固定器中的動物靜脈中，另一端固定在勻速注射儀的注射器上。本發明裝置中的固定器可以為本領域中任何合適的容器，只要動物置于其中不能移動即可，如可以采用圓柱形的筒。本發明裝置中的勻速注射儀可以為本領域中任何合適的勻速注射儀，如可以采用包括注射器、機箱、推進機構、微電腦芯片和控制電路五部分的勻速注射儀。推進機構在微電腦芯片和控制電路的控制下可帶動注射器活塞左右平行勻速移動。通過微電腦芯片可以設置注射速度和注射體積。本發明的烏頭類中藥毒性效價檢測的生物檢定方法與現有的烏頭類中藥安全性評價方法相比，具有如下優點1)本發明的毒性效價生物檢定方法可以評價藥物的整體毒性；2)以最小致死量作為評價指標使藥物毒性大小更加直觀明了，同時該評價指標由藥理實驗得到，與臨床相關性更強；3)將藥材總毒性以標準品當量表示，可以對藥材毒性大小進行統一標示，便于不同藥材間毒性大小的比較及毒性限量的設定；4)本發明的毒性效價生物檢定方法結果準確，精密度高，同時操作簡便，用時較短，經濟成本低；5)本發明的裝置采用動物固定器和勻速注射儀的合理組合，成本較低，其中動物固定器簡單實用，可使注射過程方便快捷；勻速注射儀可以方便地控制生物檢定方法中的關鍵影響因素——注射速度，因而極大地提高了該生物檢定方法的效率和結果的準確性。本發明提供的毒性效價生物檢定法可以準確、快捷地檢測烏頭類中藥的整體毒性，對藥材進行統一的毒性效價標示。在烏頭類藥材生產、加工、銷售等環節，毒性效價檢測可以作為藥材質量控制的手段之一；在臨床上，醫生可以根據藥材的標示毒性效價調整用藥劑量，從而保證用藥安全。


圖1為本發明的用于烏頭類中藥毒性效價檢測的生物檢定方法的裝置的示意圖。
具體實施例方式以下實施例中采用的物質，除了注明的之外，其余均為市售。實施例供試品由生附子炮制得到的兩個批次的白附片1和2標準品烏頭堿，賦值Img = IOOOu, u為單位數動物=SD大鼠，雄性，0. 2士0. 02kg步驟如下a.精密稱取烏頭堿IOmg置于IOml容量瓶中，加無水乙醇至刻度，密塞，振搖使完全溶解，在4°C下貯存。測定時，精密量取烏頭堿溶液0.5ml置于IOOml的容量瓶中，用 0. 9%氯化鈉溶液稀釋至刻度得烏頭堿稀釋液。b.精密稱取白附片1和白附片2的粉末(過100目篩)各10g，置于兩個磨口錐形瓶中，分別加入IOOml的70%乙醇，浸泡30分鐘，超聲處理30分鐘。提取液用0. 2 μ m微孔濾膜過濾，濾液濃縮至IOml得到兩份供試品溶液。測定時，精密量取白附片1或白附片 2的溶液5ml置于50ml容量瓶中，用0. 9%氯化鈉溶液稀釋至刻度得供試品稀釋液。c.取18只健康合格的SD大鼠。試驗前M小時移去飼料，但仍給予飲水，臨試驗前準確稱重。將動物平均分為三組，分別用于烏頭堿、白附片1和白附片2最小致死量的測定。測定時，將動物置于固定器1內，于尾靜脈中插入帶導管的針頭2的針頭，用勻速注射儀3以每分鐘0. 5ml的速度勻速連續注入烏頭堿稀釋液或白附片稀釋液，至動物中毒死亡立即停止注入。以瞳孔迅速放大、呼吸停止為注入終點。記錄所注入的烏頭堿稀釋液的總量(ml)或白附片稀釋液的總量(ml)，計算最小致死量，結果見表1。d.按中國藥典2010版二部附錄XI V生物檢定統計法中的直接測定法計算毒性效價及實驗誤差。計算結果如下表1烏頭堿、白附片1和白附片2最小致死量測定結果
權利要求
1.一種用于烏頭類中藥毒性效價檢測的生物檢定方法，其特征在于所述生物檢定方法包括下述步驟a.標準品溶液和標準品稀釋液的配制用無水乙醇將所述標準品配制成lmg/ml的標準品溶液，在4°C下貯存；測定時，用 0. 9%的氯化鈉溶液稀釋得所述標準品稀釋液；b.供試品溶液和供試品稀釋液的配制稱取過10 100目篩的供試品粉末，置于錐形瓶中，加入其重量(g) 5 15倍體積(ml) 的50% 95%的乙醇，浸泡30分鐘，超聲處理15 60分鐘；用孔徑0. 2 μ m的微孔濾膜過濾提取液，濾液減壓濃縮至原來體積的十分之一得供試品溶液。測定時，估計供試品效價， 用0.9%氯化鈉溶液對供試品溶液進行稀釋得供試品稀釋液。調節供試品稀釋液濃度使其注射體積與標準品稀釋液注射體積相近；c.測定取健康合格的動物，試驗前M小時移去飼料，但仍給予飲水，臨試驗前準確稱重，每次試驗所用動物的體重相差不得超過體重均值的20% ；將動物平均分為兩組，每組至少6只， 一組注入所述標準品稀釋液，另一組注入所述供試品稀釋液；將動物用固定器固定，于靜脈中插入注射針頭，用勻速注射儀以每分鐘0. 2 1. Oml的速度勻速連續注入藥液，至動物中毒死亡立即停止注入；以動物瞳孔迅速放大、呼吸停止為注入終點；分別記錄所注入的以 ml計的標準品稀釋液和供試品稀釋液的總量；d.按中國藥典2010版二部附錄XIV生物檢定統計法中的直接測定法計算毒性效價及實驗誤差，可信限率FL %不得超過15%。
2.如權利要求1所述的生物檢定方法，其特征在于所述標準品為烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿中的一種。
3.如權利要求1所述的生物檢定方法，其特征在于所述動物為大鼠、小鼠、豚鼠、鴿子、青蛙中的一種。
4.一種用于權利要求1所述的生物檢定方法的裝置，其特征在于所述裝置包括固定器、帶導管的針頭和勻速注射儀，所述帶導管的針頭的針頭端插入固定在所述固定器中的動物靜脈中，另一端固定在所述勻速注射儀的注射器上。
全文摘要
本發明涉及一種烏頭類中藥毒性效價檢測的生物檢定方法。本發明提供的毒性效價檢測的生物檢定法可以準確、快捷地檢測烏頭類中藥的整體毒性，對藥材進行統一的毒性效價標示。本發明還涉及一種用于烏頭類中藥毒性效價檢測的生物檢定方法的裝置。
文檔編號A61K49/00GK102172409SQ20111000819
公開日2011年9月7日 申請日期2011年1月14日 優先權日2011年1月14日
發明者山麗梅, 王伽伯, 秦誼, 肖小河, 金城 申請人:中國人民解放軍第三〇二醫院