專利名稱：用于乳腺癌內分泌治療預后判斷的新的分子標志物cuedc2蛋白質的制作方法
技術領域：
本發明涉及CUEDC2蛋白質的新用途，特別是涉及CUEDC2蛋白質在制備用于乳腺癌患者內分泌治療預后判斷的診斷劑的用途；CUEDC2基因或蛋白質在制備腫瘤治療藥物中的用途。本發明還涉及用于乳腺癌患者內分泌治療預后判斷的試劑盒和組合物。
背景技術：
腫瘤的發生嚴重威脅著人類健康，對腫瘤相關基因的研究一直是人類生物學一個重要的課題。乳腺癌是一種常見的腫瘤，是女性發病率最高的幾種惡性腫瘤之一，多發于歐美等國家。在我國尤其是經濟發達地區其發病率也呈逐年上升趨勢，已經嚴重威脅了婦女的健康。雌激素受體α (Estrogen receptor α , ER α )是一種激素依賴核轉錄因子，它在大約70%的乳腺腫瘤中都有表達。雌激素結合雌激素受體導致受體二聚化并被招募到ERa 靶基因啟動子區域的雌激素反應元件上。由于ERa在乳腺癌的發生發展上發揮了主要作用，目前乳腺癌的內分泌治療主要是靶向ERa信號通路，包括降低雌激素水平；拮抗ERa 功能；或下調ERa表達水平。在這些靶向ERa的內分泌治療中，選擇性雌激素受體調節子他莫昔芬(tamoxifen)能通過競爭結合ER α并抑制乳腺癌生長，其已成為近30年來最主要的乳腺癌的內分泌治療藥物。然而，原發性或繼發性他莫昔芬耐藥性卻是治療這一疾病的重要挑戰。ERa本身是對乳腺癌采用內分泌治療是否敏感的最重要決定因素，ERa表達水平降低或丟失往往引起內分泌治療耐藥。已有研究表明，ERa表達水平的下降是由于某些乳腺癌腫瘤中的轉錄后或翻譯后調節所致。例如，Src和AIBl可以激素依賴方式下調 ERa水平。然而乳腺癌中ERa水平的下調機制尚未完全明確。CUEDC2 (Gene ID :79004)是一個功能尚不明確的蛋白質。生物信息學分析表明 CUEDC2含有CUE結構域。已有報道發現CUE結構域是一類相對保守的、大約40個左右氨基酸的泛素結合結構域，它廣泛存在于許多真核蛋白質中。CUE結構域能夠結合單泛素和多泛素。我們實驗室前期研究發現，CUEDC2降解孕激素受體，并參與乳腺癌細胞生長調控 (Zhang, P. J.，Zhao, J.，et al. 2007. CUE domain containing 2 regulates degradation of progesterone receptor by ubiquitin-proteasome. EMBO J 26(7) 1831-1842.)我們近期研究表明，CUEDC2與IKK復合體結合，招募GADD34和PPl，抑制NF- κ B信號通路過度激活，參與炎癥反應調控(Li, H. Y.，Liu, H.，et al. 2008. Deactivation of the kinase IKK by CUEDC2 through recruitment of the phosphatase PPl.Nat Immunol 9(5) 533-541.)。

發明內容
本發明的目的是提供一種CUEDC2蛋白質在制備用于乳腺癌患者內分泌治療預后判斷的診斷劑的用途和CUEDC2基因或蛋白質在制備腫瘤治療藥物中的用途。
本發明的進一步的目的是提供一種用于乳腺癌患者內分泌治療預后判斷的試劑盒和組合物。本發明的CUEDC2 蛋白質是指 CUE domain containing 2 蛋白質，GenBank BAE19942. 1，
公開日期2005年8月19目。本發明的目的是通過以下5個方面的研究結果來實現的1、CUEDC2通過泛素-蛋白酶體通路可下調ERa水平。在乳腺癌MCF-7細胞中CUEDC2的過表達導致內源ERa蛋白質水平以激素非依賴的方式下調(

圖1)。在MCF-7和ZR-75-1細胞種轉染CUEDC2 siRNA導致ERa表達水平上調(圖2)。進一步，MCF-7細胞中過表達CUEDC2能增加ERa的泛素化水平而用特異siRNA 干涉CUEDC2的表達能減少ER α的泛素化水平(圖3)。利用雌激素受體特異報告基因進行的測活實驗(圖4)以及反轉錄PCR實驗(圖5)表明，CUEDC2能降低ERa轉錄活性及其靶基因的轉錄。2、CUEDC2在乳腺癌組織中表達增加為了研究CUEDC2在乳腺癌組織中的表達情況，首先制備了 CUEDC2單克隆抗體， 其制備過程如下首先把CUEDC2全長編碼序列構建到pGEX-KG原核表達載體上。將這一 GST-CUEDC2融合表達載體轉化大腸桿菌DH5 α，加IPTG誘導表達并純化，得到GST-CUEDC2 融合蛋白質。將GST-hCUEDC2融合蛋白質IOOyg與弗氏完全佐劑進行充分乳化，對4-6 周齡BAL B/c雌性小鼠進行首次皮下注射。首次免疫3周后，將GST-hCUEDC2融合蛋白質 IOOyg與弗氏不完全佐劑充分乳化，對BAL B/c小鼠進行第二次皮下注射。第三次免疫后的第15天，經尾靜脈采血，用ELISA法測定血清抗體的效價。加強免疫3天后，取脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞株SP2/0細胞按常規方法融合。用間接ELISA法篩選，有限稀釋法克隆化。 具體來說，就是稀釋細胞懸液，接種96孔板，理論上使每個孔中只接種1個細胞，產生單克隆，從而得到分泌完全同質單克隆抗體的雜交瘤細胞。將得到的雜交瘤細胞經腹腔接種BAL B/c小鼠，12天左右開始采集腹水，即可得到腹水mAb，由京天成生物技術(北京)有限公司制備純化的mAb。利用上述制備的CUEDC2抗體，發明人對449例乳腺癌病例進行了免疫組織化學分析。結果表明，CUEDC2在乳腺癌腫瘤組織中的表達量比正常癌旁組織中明顯上調(圖6，P <0.001)。對16例病例進行的實時定量PCR實驗結果表明，CUEDC2 mRNA表達在乳腺癌腫瘤組織中也大大增加(圖7)。3、乳腺癌中CUEDC2與ERa表達水平呈負相關我們還對449例乳腺癌病人中重要分子標志物如ER，PR，Ki-67，HER-I和HER-2進行了免疫組織化學分析，并對染色結果進行評分。將上述分子標志物與CUEDC2的評分情況進行相關分析，結果表明CUEDC2與ER α和冊表達水平呈負相關，與Ki_67和HER-2表達水平呈正相關，而與HER-I表達水平無統計學關聯，見下表1。表1. CUEDC2與其它常見乳腺癌標志物的相關分析
權利要求
1.CUEDC2蛋白質在制備用于乳腺癌患者內分泌藥物治療預后判斷的診斷劑的用途，其特征在于，所述的診斷劑包含所述CUEDC2蛋白質的抗體。
2.根據權利要求1所述的用途，其特征在于，所述抗體為所述CUEDC2蛋白質的單克隆抗體或多克隆抗體。
3.根據權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的內分泌藥物包括雌激素受體拮抗劑、芳香化酶抑制劑、LH-RH激動劑。
4.根據權利要求3所述的用途，其特征在于，所述的雌激素受體拮抗劑包括他莫昔芬和ICI182780 ；所述的芳香化酶抑制劑包括阿那曲唑和來曲唑；所述的LH-RH激動劑包括諾雷得和戈舍瑞林。
5.一種用于乳腺癌患者內分泌藥物治療預后判斷的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中含有CUEDC2蛋白質的抗體。
6.根據權利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述抗體為所述CUEDC2蛋白質的單克隆抗體或多克隆抗體。
7.根據權利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述內分泌藥物所述的內分泌藥物包括雌激素受體拮抗劑、芳香化酶抑制劑、LH-RH激動劑。
8.根據權利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述的雌激素受體拮抗劑包括他莫昔芬和ICI182780 ；所述的芳香化酶抑制劑包括阿那曲唑和來曲唑；所述的LH-RH激動劑包括諾雷得和戈舍瑞林。
9.根據權利要求5-8中任一項所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包含 10XPBS、構椽酸鹽緩沖液、蘇木素溶液、TBS溶液、3%過氧化氫、分化液、封閉血清、抗體稀釋液、二氨基聯苯胺顯色劑。
10.一種用于乳腺癌患者內分泌藥物治療預后判斷的組合物，其特征在于，所述組合物中含有CUEDC2蛋白質的抗體。
11.根據權利要求10所述的組合物，其特征在于，所述抗體為所述CUEDC2蛋白質的單克隆抗體或多克隆抗體。
12.根據權利要求10所述的組合物，其特征在于，所述內分泌藥物所述的內分泌藥物包括雌激素受體拮抗劑、芳香化酶抑制劑、LH-RH激動劑，所述的雌激素受體拮抗劑包括他莫昔芬和ICI182780，所述的芳香化酶抑制劑包括阿那曲唑和來曲唑，所述的LH-RH激動劑包括諾雷得和戈舍瑞林。
13.CUEDC2基因或蛋白質在制備腫瘤治療藥物中的用途，其特征在于，所述的腫瘤治療藥物包含特異抑制CUEDC2基因\蛋白質表達或活性的小分子物質、特異性抗體。
14.根據權利要求13所述的用途，其特征在于，所述的藥物包含能結合CUEDC2mRNA并干涉其表達的siRNA或shRNA或其它能特異結合CUEDC2基因\蛋白質并抑制其表達或活性的小分子物質、特異性抗體。
15.根據權利要求13所述的用途，其特征在于，所述的siRNA的序列為siCUEDC2#l :5’ -CCAAGATGAGGCAACTGGCGCTGAG-3’ ；siCUEDC2#2 :5’ -CCTATGTGCCTGGCTTCGCCCACAT-3’ ；siCUEDC2#3 :5’ -CCGACCTCAGTGGCTTGGATGAGGT-3’。
16.根據權利要求13所述的用途，其特征在于，所述的腫瘤為CUEDC2蛋白質高表達。
全文摘要
本發明公開了一種CUEDC2蛋白質在制備用于乳腺癌患者內分泌藥物治療預后判斷的診斷劑的用途，該診斷劑包含所述CUEDC2蛋白質的抗體，該抗體為所述CUEDC2蛋白質的單克隆抗體或多克隆抗體。本發明還提供了一種用于乳腺癌患者內分泌藥物治療預后判斷的試劑盒或組合物，該試劑盒或組合物中含有抗CUEDC2蛋白質的抗體。本發明還進一步公開了CUEDC2基因或蛋白質在制備腫瘤治療藥物中的用途，即可將特異抑制CUEDC2基因\蛋白質表達或活性的小分子物質、特異性抗體等作為治療藥，恢復耐藥腫瘤對藥物治療的敏感性。所述CUEDC2蛋白質的新用途為確定乳腺癌病人手術后輔助治療的用藥方案提供了新依據，從而提高所使用抗癌藥物的治療效果并減輕病人的痛苦和經濟負擔。
文檔編號A61K48/00GK102183655SQ20111002486
公開日2011年9月14日 申請日期2011年1月24日 優先權日2011年1月24日
發明者周濤, 張學敏, 李慧艷, 李愛玲, 潘欣 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院生物醫學分析中心