專利名稱：以大腸桿菌不耐熱腸毒素b亞單位為載體的表位遞送系統的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，特別涉及以大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位為載體的抗原表位遞送系統的設計與制備方法，涉及該系統在B細胞表位疫苗及T細胞表位疫苗中的應用。
背景技術：
表位(epitope)是抗原分子中決定抗原特異性的特殊化學基團，又稱抗原決定簇(antigenic determinant),它是 T 細胞抗原受體(Tcell receptor, TCR)和 B 細胞抗原受體(B cell receptor, BCR)及抗體特異結合的基本単位。在免疫應答中，TCR和BCR所識別的抗原表位不同，分別稱為T細胞表位和B細胞表位。主要組織相容性復合體(majorhistocompatibiIitycomplex, MHC)是高度多態性的細胞表面分子,它將多肽片段遞呈給T 細胞。與MHC I類分子結合的抗原肽為8 12個氨基酸，是來自內源性抗原經蛋白酶降解后的產物。蛋白酶水解片段通過抗原加工相關轉運體(transporter associated withantigen processing, TAP)轉運至內質網與新合成的MHC I類分子相結合,MHC肽復合體轉移至細胞表面被CD8+細胞毒性T細胞的TCR識別。MHCII類分子結合肽長度變化較大，為9 25個氨基酸，主要由外源蛋白通過溶酶體中的蛋白酶降解而來。在內體-溶酶體中與MHC II類分子結合后，MHC肽復合體也轉運至細胞表面，被CD4+T細胞TCR識別。據此可設計出兩大類T細胞疫苗，即與相應的MHC I及MHCII類分子相關的⑶8+T細胞疫苗和⑶4+T細胞疫苗。⑶4+輔助性T細胞(helperTCell，Th)又分為分泌不同細胞因子卻又交叉調節的兩群，即Thl和Th2。Thl亞群主要分泌白介素_2(IL_2)、Y干擾素(IFN-Y )和腫瘤壞死因素-β (TNF-β )，Th2亞群主要分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-13。據此人們可設計出誘導Thl或Th2應答的疫苗抗原分子。根據機體對病原體或腫瘤的免疫應答特點，可以選擇特異性Th或細胞毒性T淋巴細胞(CTL)表位以定向誘導宿主的Th應答或CTL應答，甚至通過選擇Thl表位或Th2表位，可誘導機體向Thl或Th2型免疫應答定向發展。作為理想的免疫原，抗原分子中可同時包含目的抗原B細胞表位和自身或外源T細胞表位，可誘導出度高特異性的體液或細胞免疫反應，從體液免疫和細胞免疫水平起到預防或治療作用，因此可賦予較廣的保護性。通過設計隱藏于抗原分子內部的表位可增強抗原的免疫原性，泛DR輔助 T 細胞表位(pan-DRhelperTcell epitopes, PADRE)或通用 T 表位(universalTepitope)以高親和力與人群常見人類白細胞抗原-DR(HLA-DR)分子結合，較少受MHC限制。雖然表位疫苗具有許多優點，并且其研究也取得了重大的進展，但由于缺乏天然蛋白的三維結構，表位疫苗的分子小，免疫原性差，半衰期短，使機體無法產生免疫反應，還可能引起免疫耐受。因此提高與抗體的親和力、増加免疫原性與穩定性是近年來表位疫苗的研究熱點。目前用于解決這ー問題的途徑主要有氨基酸修飾、多表位串連展示到某個載體上。選擇包含無關Th表位的蛋白分子作為載體，可以避免慢性感染者普遍存在的HLA-II類限制性耐受，誘導Thl類細胞因子占據優勢地位。BSA，GST，匙孔血藍蛋白(keyhole Imipethemocyanin, KLH)和破傷風類毒素(tetanus toxoid, TT)均可成為載體蛋白。通過化學偶聯或融合表達的方法將表位與蛋白載體連在一起，免疫小鼠可誘導特異針對肽的免疫反應出現。此外，表位肽的有效性不僅取決于自身，還與不同的載體蛋白相關，良好的載體有利于加強表位的免疫源。大腸桿菌不耐熱腸毒素(heat-labile enterotoxin, LT)是ー種能導致人畜腹灣的毒性因子，為產毒性大腸桿菌(Enterotoxigenic Escherichia, ETEC)產生的六聚體蛋白，由含240個氨基酸的A亞單位和5個具103個氨基酸的B亞單位(LTB)形成的五聚體構成。除了很強的毒性以外，LT具有很強的免疫原性并且能夠輔佐其他抗原通過粘膜免疫途徑使機體產生特異抗體，因而LT，尤其是其無毒或低毒突變體、LTB作為粘膜免疫佐劑，在粘膜免疫研究中以及粘膜免疫疫苗開發中具有重要醫學價值和經濟價值。大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位(LTB)為一同源五聚體，它與廣泛存在于真核細胞膜上的神經節苷脂(GMl)受體有特異的結合能力，能誘使機體產生較強的免疫反應，并且LTB無毒，因而被廣泛用于免疫佐劑。當從細菌細胞中釋放出來以后，毒素利用其B亞單位結合于小腸上皮細胞，在那 里它與靶細胞表面上存在的神經節苷脂GMl作用，使毒素定位于細胞膜上。在體外對LTB免疫的小鼠進行分析后掲示LTB顯著改變淋巴結內淋巴細胞亞類的分布，在第四天CD8+細胞幾乎全部缺失而B細胞比例卻升高。LTB與B細胞表面GMl作用后的免疫調節作用有如下特點(I)多克隆的；(2)并不伴隨顯著的増殖出現；(3)這ー過程包含ー些重要分子的上調作用-即主要組織相容性復合物II (MHC II)，B7,⑶40，胞間粘附分子I(ICAM-I)和IL-2Ra。進ー步研究顯示增強的IL_2Ra和MHC II是發生GMl-LTB相互作用后的主要結果，而其他因子則可能是因CD4+T細胞相互作用増加后而增加的。通過化學耦聯的方法將抗原表位結合于LTB后，復合結合于細胞，再通過胞吞的形式進入細胞質，通過在內質網、高爾基體等內的代謝后，可將其攜帯的表位遞呈給MHCI。因而LTB既可以作為B細胞表位載體，也可以作為T細胞表位載體。目前有人利用化學交聯的方法在進行相關研究。通過化學交聯，雖然能形成免疫原性強的復合物。但化學交聯劑價格昂貴、也不能保持復合物質量的均一性。本發明利用LTB作為載體，通過優化連接肽的氨基酸組成，篩選到4種適合于攜帶B細胞及T細胞抗原表位的核心短肽。這些短肽及它們的組合前后分別連接LTB及表位，在重組大腸桿菌里能實現分泌表達，以保持LTB完整生物學活性的五聚體方式存在，即保證每ー個LTB単體的末尾連上一段表位，通過純化得到的融合蛋白能實現良好的質量控制。融合蛋白更好地實現載體-表位復合物的遞呈，促進B淋巴細胞免疫應答及T淋巴細胞免疫應答。

發明內容
本發明目的在于提供能在LTB的C末端攜帶不同抗原表位，在大腸桿菌中分泌表達，能低成本地形成具有生物學活性的五聚體融合蛋白，在免疫動物的過程中，該蛋白具有很強的表位遞送能力。以LTB及連接肽構成的表位遞送系統將為表位疫苗的研發提供新型載體。本發明的另ー目的在于提供該遞送系統的生產方法。
本發明的再一目的在于提供該遞送系統在表位疫苗研制中的應用。技術方案13以重組質粒pMD18T-LT為模板，用PCR的方法擴增出LTB-Linker片段，進而構建 pMD18T-LTB_Linker 重組質粒。Linker 為 Seql，Seq2，Seq3，Seq4 及它們之間的組合。14以pMD18T-LTB-Linker重組質粒為模板，構建攜帶大鼠17肽胃泌素B細胞表位EEEE (Pepl)的重組質粒 pMD18T-LTB-Linker_P印 I。15以pMD18T-LTB-Linker重組質粒為模板，構建攜帶卵清蛋白T細胞表位SIINFEKL (Pep2)的重組質粒 pMD 18T-LTB-Linker_P印2。16 用 NcoI 及 BamHI 雙酶切重組質粒 pMD18T-LTB-Linker_P印I 及pMD18T-LTB-Linker-P印2，將目的片段連接至經同樣雙酶切的表達載體pET22b，構建表達重組質粒 pET22b-LTB-Linker-P印 I 及 pET22b-LTB-Linker_P印2。 17 表達重組質粒 pET22b-LTB-Linker-P印 I 及 pET22b-LTB-Linker_P印2 轉化大腸桿菌E. coliBL21 (DE3)，構建表達重組工程菌pET22b-LTB-Linker_P印 1/E. coli BL21 (DE3)及 pET22b-LTB-Linker-P印2/E.coli BL21 (DE3)。18表達重組工程菌發酵，取其超聲破菌上清進行純化以獲得目的蛋白LTB—Linker—PepI 及 LTB—Linker—Pep2。19LTB-Linker-PepI免疫SD大鼠，Elisa法測定抗體滴度，并檢測免疫后的大鼠對17肽胃泌素的胃酸分泌抑制作用。20LTB-Linker-Pep2 免疫 C57BL/6 小鼠，Y 干擾素(IFN- Y )Elispot 法測定其脾臟淋巴細胞中特異CD8+細胞含量。


附圖lpET22b-LTB-Linker-P印 1/E. coli BL21 (DE3)表達的 SDS-PAGE 圖I =LTB-Seql-Pepl (煮)2 =LTB-Seql-Pepl (不煮)3 LTB-Seq2-Pepl (煮)4 LTB-Seq2-Pepl (不煮)5 LTB-Seq3-Pepl (煮)6 LTB-Seq3-Pepl (不煮)7 LTB-Seq4-G-Pepl (煮)8 LTB-Seq4-G-Pepl (不煮)9 LTB-Seq4-Seq2-Pepl (煮)10 LTB-Seq4-Seq2-Pepl (不煮)11 LTB-Seq4-Pepl (煮)12 LTB-Seq4-Pepl (不煮)從圖中看出，超聲上清在煮后在12kD附近有ー濃的目的條帶(箭頭所示)，而未煮的樣品則無，表明在未煮的情況下目的蛋白主要以多聚體形式存在，煮后變為了単體，與LTB的性質吻合。附圖2pET22b-LTB-Linker-P印2/E. coli BL21 (DE3)表達的 SDS-PAGE 圖
I LTB-Seql-Pep2 (煮)2 LTB-Seql-Pep2 (不煮)3 LTB-Seq2-Pep2 (煮)4 LTB-Seq2-Pep2 (不煮)5 LTB-Seq3-Pep2 (煮)6 LTB-Seq3-Pep2 (不煮)7 LTB-Seq4-Seq2-Pep2 (煮) 8 LTB-Seq4-Seq2-Pep2 (不煮)9 =LTB-Seq4-Seq3-P印2 (煮)10 LTB-Seq4-Seq3-Pep2 (不煮)11 LTB-Seq4-Pep2 (煮)12 LTB-Seq4-Pep2 (不煮)從圖中看出，超聲上清在煮后在12kD附近有ー濃的目的條帶(箭頭所示)，而未煮的樣品則無，表明在未煮的情況下目的蛋白主要以多聚體形式存在，煮后變為了単體，與LTB的性質吻合。附圖3 純化后 LTB-Linker-P印I 的 SDS-PAGEI :LTB-Seql_ (不煮)2 =LTB-Seql-Pepl (煮)M :蛋白質分子量標準3 LTB-Seq2-Pepl (不煮)4 LTB-Seq2-Pepl (煮)5 LTB-Seq3-Pepl (不煮)6 :LTB_Seq3_Pepl (煮)7 LTB-Seq4-G-Pepl (不煮)8 LTB-Seq4-G-Pepl (煮)9 LTB-Seq4-Seq2-Pepl (不煮)10 LTB-Seq4-Seq2-Pepl (煮)11 LTB-Seq4-Pepl (不煮)12 LTB-Seq4-Pepl (煮)從圖看出，純化的工程菌表達的目的蛋白在未煮的情況下以五聚體的形式存在，在煮后以單體形式存在，與LTB的性質一致。附圖4 純化后 LTB-Linker-P印2 的 SDS-PAGEM :蛋白質分子量標準I LTB-Seql-Pep2 (煮)2 LTB-Seql-Pep2 (不煮)3 LTB-Seq2-Pep2 (煮)4 LTB-Seq2-Pep2 (不煮)5 LTB-Seq3-Pep2 (煮)6 LTB-Seq3-Pep2 (不煮)
7 LTB-Seq4-Seq2-Pep2 (煮)8 LTB-Seq4-Seq2-Pep2 (不煮)9 LTB-Seq4-Seq3-Pep2 (煮)10 =LTB-Seq4-Seq3-P印2 (不煮)11 LTB-Seq4-Pep2 (煮)12 LTB-Seq4-Pep2 (不煮)從圖看出，純化的工程菌表達的目的蛋白在未煮的情況下以五聚體的形式存在，在煮后以單體形式存在，與LTB的性質一致。附圖5不同免疫組動物的累積泌酸量由圖看出免疫LTB-Linker-P印I后，大鼠胃酸分泌量顯著減少P < 0.01。說明LTB-Linker-Pepl免疫后，大鼠體內產生了抗胃泌素抗體，中和了胃泌素的泌酸作用。附圖6LTB-Linker-Pepl四次免疫大鼠后(每次100 μ g，間隔3周免疫一次)，血清稀釋至100倍時的抗體滴度。由圖看出免疫了 LTB-Linker-P印I的大鼠產生了特異抗G17抗體。附圖7小鼠免疫LTB-Linker-P印2后，脾淋巴細胞中⑶8+細胞的形成。由圖看出免疫了 LTB-Linker-P印2后，小鼠脾臟淋巴細胞中抗原特異性的CD8+淋巴細胞顯著増加，表明復合物能顯著增強表位遞呈。
具體實施例方式實施例1，pMD18T-LTB-Linker工程菌的構建。以 pMD18T-LT 為模板，用 PCR 法分別構建出 pMD18T-LTB-Seql，pMD18T-LTB_Seq2，pMD18T-LTB-Seq3, pMD18T_LTB_Seq4， pMD18T-LTB-Seq4_G， pMD18T-LTB-Seq4_Seq2，PMD18T-LTB-Seq4-Seq3重組質粒，各質粒分別轉化E. coli T0P10,酶切及測序鑒定后即構建好 pMD18T-LTB-Linker 工程菌。Linker 因此具體為Seql, Seq2, Seq3, Seq4, Seq4_G, Seq4_Seq2 及 Seq4_Seq3。實施例2,表達 LTB-Linker-Pepl 及 LTB-Linker_Pep2 工程菌的構建。以實施例I中的pMD18T-LTB-Linker為模板，用PCR法將測試的P印I及P印2片段連于 pMD18T-LTB-Linker 之后構建 pMD18T-LTB-Linker_P印I 及 pMD18T-LTB-Linker_Pep2重組質粒，用內切酶NcoI及BamHI進行雙酶切，獲取目的片段，與經同樣雙酶切的質粒pET22b 連接，構建表達重組質粒 pET22b-LTB-Linker-P印I 及 pET22b_LTB-Linker_P印2。LTB-Linker-Pepl 包括LTB-Seql-Pepl (LlPl)，LTB_Seq2_Pepl(L2P1)，LTB-Seq3_Pepl (L3P1)，LTB_Seq4_PepI (L4PI)，LTB-Seq4-G_PepI(L4GPI)及LTB-Seq4-Seq2-Pepl(L42P1)。LTB-Linker-Pep2 包括LTB_Seql_Pep2(L1P2)，LTB_Seq2_Pep2 (L2P2)，LTB-Seq3_Pep2 (L3P2)，LTB_Seq4_Pep2(L4P2)，LTB-Seq4-Seq2_Pep2 (L42P2)及LTB-Seq4-Seq3-Pep2(L43P2)。 重組質粒轉化大腸桿菌E. coli BL21 (DE3)即構建出重組工程菌pET22b-LTB-Linker-Pepl/E.coli BL21 (DE3)及 pET22b-LTB-Linker-Pep2/E.coliBL21(DE3)。
實施例3, LTB-Linker-Pep I 及 LTB-Linker_Pep2 的表達。重組工程菌pET22b-LTB-Linker-Pepl/E. coli BL21 (DE3)及pET22b-LTB-Linker-Pep2/E. coliBL21 (DE3)分別進行IL發酵表達，加入IPTG至終濃度為O. lmmol/L，在18°C誘導表達過夜。表達結果分別見附圖I及附圖2。實施例4, LTB-Linker-Pep I 及 LTB-Linker_Pep2 的純化離心收取發酵細菌，用TF,AN(20mmo1 /T, Tris, 2mmol/L EDTA,3mmol Na3N,300mmol/LNaCl, pH 8.0)重懸，超聲破菌，離心收取上清。將上清上經TEAN平衡的固相化半乳糖柱(Immobilised D-glactose),用TEAN復平衡,用含O. 3mmol/L半乳糖的TEAN洗脫目的蛋白，收集洗脫峰。純化的LTB-Linker-P印I 及 LTB-Linker-P印2SDS-PAGE 分別見附圖 3 及附圖 4。實施例6，LTB-Linker-Pepl的免疫原性與生物活性測定(I)動物免疫8-10周齡雌性SD大鼠皮下免疫七組(4只/組)分別用含LTB100 μ g的 200 μ L PBS (pH7. 4)，含 LTB-Linker-P印 1100 μ g 的 200 μ L PBS (ρΗ7. 4)進行皮下多點免疫。間隔三3周免疫一次，總共免疫4次。第四次免疫后10天進行胃泌酸實驗。(2)急性胃瘺泌酸實驗動物實驗前禁食不禁水24小時；戊巴比妥鈉麻醉；分離胃，結扎幽門端；胃上插入導管；用35°C生理鹽水洗去胃內容物。動物保溫半小時后尾靜脈注射50μ!7只(200yg/mL)的大鼠胃泌素(IOOng/只)；注射后結扎賁門端；收集導管流出的胃液，45分鐘后取胃，0. 9% NaCl溶液0. 5mL沖洗胃內分泌物，堿滴定測定計算胃酸總量。結果見附圖5。(3)Elisa法測定特異抗體用大鼠十七肽胃泌素包被96孔板，將進行胃泌酸實驗當天采集的耦聯蛋白免疫組與PBS對照組動物血清均稀釋至100倍作一杭，山羊抗大鼠IgG-HRP作ニ抗，OPD作底物顯示，讀取492nm處光吸收值，用表位疫苗免疫組讀數減去對照組讀數作圖見附圖6。
實施例7，LTB-Linker-P印2的免疫原性與生物活性測定(I)動物免疫6周齡雌性C57BL/6小鼠皮下免疫八組(4只/組)分別用100 μ L PBS (ρΗ7· 4)、含 LTB50 μ g 的 100 μ L PBS (ρΗ7· 4)，含 LTB-Linker-P印250 μ g 的100 μ LPBS (ρΗ7. 4)進行皮下多點免疫。間隔2周免疫一次，總共免疫3次。(2)Elispot :最后一次免疫后10天處死動物，無菌條件下取脾臟，研磨、過濾得到脾細胞，用紅細胞裂解液去除紅細胞后，脾淋巴細胞用淋巴細胞培養液清洗及重懸至濃度為2X107cells/mL。Elispot檢測用BD公司的Y干擾素(IFN-Y )Elispot試劑盒參照廠家指示進行。Elispot板以用PBS稀釋到終濃度為5 μ g/ml抗鼠IFN- Y抗體在4°C包被過夜，R-10洗滌一次，然后用R-10封閉2小吋。每孔加入2. 5X IO5脾淋巴細胞，加入或不加入表位肽在37°C，5% CO2刺激16小時，用去離子水5分鐘裂解2次。用含0. 05% Tween-20的PBS洗孔三次。用含2% FCS PBS稀釋生物素化的抗IFN- Y抗體至終濃度2 μ g/ml，加入孔內孵育2小時，用含0. 005% Tween-20的PBS洗板3次，然后用含2% FCS的PBS溶解的濃度為50mg/ml的親合素耦聯辣根過氧物酶孵育。用含0. 005% Tween-20的PBS洗板4次,PBS洗板2次,用AEC (3-amino-9-ethyl-carbazole (Sigma))底物溶液孵育。底物溶液配制AEC 用ニ甲基甲醒(Dimethyl formaldehyde)溶至 10mg/ml,其后用含 0. 005% H2O2的0. IM醋酸鹽緩沖液(148ml 0. 2M醋酸和352ml 0. 2M醋酸鈉加水至IL pH 5. 0)稀釋至O. 333mg/ml。5-10分鐘后，用自來水洗板，晾干，讀取斑點數(SFU)。有抗原刺激組為無抗原組斑點數4倍以上，背景不多于100SFU/106即為陽性。結果見附圖7。SEQUENCE LISTING〈110〉馮強Feng, Qiang<120>以大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位為載體的表位遞送系統<130>a<140>a<141>2011-03-05<160>4<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>3<212>PRT〈213〉人工合成<400>1Gly Pro GlyI<210>2<211>4<212>PRT〈213〉人工合成<400>2Gly Ser Gly SerI<210>3<211>5<212>PRT〈213〉人工合成<400>3Gly Gly Gly Ser SerI5<210>4<211>6<212>PRT〈213〉人工合成<400>4Tyr Ala Pro Val Asp ValI權利要求
1.抗原表位遞送系統，其特征在于該系統為用DNA重組技術構建的融合蛋白，在重組大腸桿菌表達過程中，該融合蛋白連同其攜帶的抗原表位被分泌表達并形成具高免疫原性的多聚體。
2.權利要求I所述的融合蛋白為一載體與連接肽(Linker)構成。
3.權利要求2所述的載體為大腸桿菌不耐熱腸毒素，大腸桿菌不耐熱腸毒素無毒突變體，大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位,霍亂毒素及霍亂毒素B亞單位之一。
4.權利要求2所述的載體，優選為大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位(LTB)。
5.權利要求2所述的Linker為Seql,Seq2, Seq3, Seq4及它們不同形式的組合。
6.權利要求I所述的融合蛋白在大腸桿菌，酵母及哺乳動物細胞等不同宿主的表達。
7.權利要求6中的表達宿主，優選為大腸桿菌。
8.權利要求I所述的抗原表位遞送系統在制備疫苗中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種抗原表位遞送系統的的設計技術及制備純化技術，涉及該系統在表位疫苗研制中的應用。本發明的特征在于將大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位(LTB)與特定的連接肽通過DNA重組技術連接起來，再將相應的B淋巴細胞表位或T淋巴細胞表位連于其后。實驗表明，本發明的表位遞送系統攜帶B淋巴細胞表位能有效促使動物產生針對該表位的抗體；而攜帶的T淋巴細胞表位則能有效促使動物產生針對該表位的CD8淋巴細胞。這提示所發明的抗原表位遞送系統可在表位疫苗的研制中發揮重要作用。
文檔編號A61P39/00GK102675466SQ20111005653
公開日2012年9月19日 申請日期2011年3月9日 優先權日2011年3月9日
發明者馮強 申請人:馮強