專利名稱：四種致腹瀉性大腸桿菌的多重pcr檢測方法及其引物組的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物檢測技術領域，具體涉及ー種基于多重PCR技術快速檢測四種致腹瀉性大腸桿菌的方法及其專用引物。
背景技術：
食品安全是全球性的重大公共衛生問題，已報道的食源性疾病致病因子有250多種，其中腸道致病菌是食源性疾病中最常見的生物致病因素。據世界衛生組織(WHO)報道，全球毎年因食源性微生物污染引起的腹瀉病例達數億起，死亡的(Γ15歲兒童約170萬人。目前致腹瀉性大腸桿菌仍是引起腹瀉的重要病原之一，特別是嬰幼兒腹瀉，在我國及國外腹瀉患者中致腹瀉性大腸桿菌檢出率、構成比、優勢類型及血清型不同，給臨床診斷帶來不便。
大腸埃希菌{Escherichiacoli, Ε· coif)俗稱大腸桿菌，由 Escherich 于 1885年首次發現，起初一直被認為是腸道菌群的正常組成部分，屬于條件致病菌。20世紀中葉，人們認識到某些特殊血清型大腸桿菌對人和動物有致病性，尤其對嬰兒和幼畜，常引起嚴重腹瀉和敗血癥。與人類疾病有關的大腸桿菌，統稱為致腹瀉性大腸桿菌(diarrheogenicE. cWi)，根據生物學特性主要分為四類產腸毒性大腸桿菌(ETEC)、腸致病性大腸桿菌(EPEC)、腸侵襲性大腸桿菌(EIEC)和腸出血性大腸桿菌(EHEC)。致腹瀉性大腸桿菌作為人畜共患性致病菌，具有重要的公共衛生意義。ETEC主要感染兒童和旅游者，發展中國家尤為嚴重，被污染的水和食物是主要傳染來源，主要致病因素是大腸桿菌腸毒素LT或ST，感染的臨床癥狀輕度時為溫和性腹瀉，嚴重時可發展為霍亂樣腹瀉癥狀；EPEC是嬰兒腹瀉的主要病原菌，具有高度傳染性，嚴重者可致死，病原菌主要感染腸上皮細胞或組織培養細胞表面形成特征性的組織病理學損傷；EIEC主要引起大齡兒童和成年人腹瀉，曾爆發流行，臨床癥狀為水樣腹瀉，有時呈現痢疾癥狀；EHEC主要血清型是0157:H7，引起散發性或暴發性出血性結腸炎，可產生志賀毒素樣細胞毒素。目前我國針對致腹瀉性大腸桿菌的檢測方法主要以傳統檢測方法為主，具體操作流程為待檢樣品一增菌一分離培養一革蘭染色鏡檢/生化及菌落觀察/生化反應試驗/腸毒素檢查等，操作復雜繁瑣，檢測時間長，完成整個檢測程序需要5 10d，且檢測目標單一。在此情況下，采用多重PCR方法一次性檢測出単一病原感染或混合感染，對保障食品安全和人類健康具有現實意義。本發明根據選取的4種致腹瀉性大腸桿菌靶基因序列的保守區設計合成了 4對特異性PCR引物，通過體系及反應條件優化，建立了ー步反應同時檢測4種致腹瀉性大腸桿菌的多重PCR方法。實踐證實，本發明方法比常規的細菌分離鑒定敏感度高且檢測快速，可用于臨床病例的快速診斷和流行病學調查，具有一定的實用性。

發明內容
本發明的目的在于提供ー種具有快速、準確、靈敏、特異的一歩反應同時檢測腸出血性大腸桿菌0157:H7、腸侵襲性大腸桿菌、腸致病性大腸桿菌和腸毒素性大腸桿菌4種致腹瀉性大腸桿菌的多重PCR方法。本發明的目的是這樣實現的分別選擇腸出血性大腸桿菌0157:H7 O-antigen基因、腸毒素性大腸桿菌LT基因、腸致病性大腸桿菌/基因和腸侵襲性大腸桿菌invasionplasmid基 因為靶基因，通過基因序列的比對分析，選取靶基因序列的保守區設計合成引物，建立多重PCR檢測方法，對4種致腹瀉性大腸桿菌進行定性檢測。一種四種致腹瀉性大腸桿菌的多重PCR檢測引物組，核苷酸序列為
腸出血性大腸桿菌O157 = H7引物對為
OF 5/ -ATTGCGCTGAGGCCTTTG-3',
OR 5/ -CGAGTACATTGGCATCGTG-3'；
腸毒素性大腸桿菌引物對為
LF 5/ -GCACACGCAGCTCCTCAGTC-3',
LR 5/ -TCCTTCATCCTTTCAATGGCTTT-3'；
腸致病性大腸桿菌引物對為
BF :5, -GGAAGTCAAATTCATGGGGGTAT-3'，
BR 5/ -GGAATCAGACGCAGACTGGTAGT-3'；
腸侵襲性大腸桿菌引物對為
IF 5/ -CTGGATGGTATGGTGAGG-3'，
IR 5/ -GGAGGCCAACAATTATTTCC-3。本發明還具有如下特征
I、所述的引物對的添加摩爾比為OF/OR: LF/LR: BF/BR: IF/IR為I: I: I: I. 3。2、一種四種致腹瀉性大腸桿菌的多重PCR檢測用陽性對照品的制備PCR擴增引物組，核苷酸序列為
腸出血性大腸桿菌O157 = H7陽性對照品的制備PCR擴增引物
EHEC-F 5/ -CTATAGAAATTGCTGCTGTAG-3',
EHEC-R 5/ -TCTAACCCTTCAGCATTATTA-3'；
腸毒素性大腸桿菌陽性對照品的制備PCR擴增引物
ETEC-F 5/ -AACCCTGGATTCATCATGCAC-3;，
ETEC-R 5/ -TAGTTTTCCATGCTGATTGCC-3'；
腸致病性大腸桿菌陽性對照品的制備PCR擴增引物
EPEC-F 5/ -AAATCATGAATAAGAAATACG-3',
EPEC-R 5/ -CAGTATTTTTACATGCAGTTG-3'；
腸侵襲性大腸桿菌陽性對照品的制備PCR擴增引物
EIEC-F 5/ -CTGGAAAAACTCAGTGCCTCT-3;，
EIEC-R 5/ -AGCTTCCGTACGCTTCAGTAC-3'。3、一種非診斷或治療目的的四種致腹瀉性大腸桿菌的多重PCR檢測方法，包括如下步驟
(I)PCR模板的制備
參照天根TIANamp Bacteria DNA Kit說明書進行細菌基因組DNA的提取和純化；(2)設計PCR引物
選擇腸出血性大腸桿菌O157 = H7的Ο-antigen基因、腸毒素性大腸桿菌的LT基因、腸致病性大腸桿菌的^基因和腸侵襲性大腸桿菌的invasion plasmid基因作為祀基因，設計合成以下引物進行靶基因的擴增
腸出血性大腸桿菌O157 = H7 Ο-antigen基因的PCR擴增引物
EHEC-F 5/ -CTATAGAAATTGCTGCTGTAG-3',
EHEC-R 5/ -TCTAACCCTTCAGCATTATTA-3'；
腸毒素性大腸桿菌LT基因的PCR擴增引物
ETEC-F 5/ -AACCCTGGATTCATCATGCAC-3;，
ETEC-R 5/ -TAGTTTTCCATGCTGATTGCC-3'；
腸致病性大腸桿菌/基因的PCR擴增引物
EPEC-F 5/ -AAATCATGAATAAGAAATACG-3',
EPEC-R 5/ -CAGTATTTTTACATGCAGTTG-3'；
腸侵襲性大腸桿菌invasion plasmid基因的PCR擴增引物
EIEC-F 5/ -CTGGAAAAACTCAGTGCCTCT-3;，
EIEC-R 5/ -AGCTTCCGTACGCTTCAGTAC-3'；
利用設計合成的靶基因PCR引物，分別以腸出血性大腸桿菌O157 = H7 (ATCC 35150)、腸毒素性大腸桿菌(ATCC 35401)、腸致病性大腸桿菌(ATCC 11775)和腸侵襲性大腸桿菌(ATCC 43893)的基因組DNA為模板擴增靶基因，將擴增的靶基因序列進行BLAST比對分析，分別選取每種致腹瀉性大腸桿菌靶基因序列的保守區設計合成了 4對特異性多重PCR鑒定引物
腸出血性大腸桿菌O157 = H7
OF 5/ -ATTGCGCTGAGGCCTTTG-3',
OR 5/ -CGAGTACATTGGCATCGTG-3'；
腸毒素性大腸桿菌
LF 5/ -GCACACGCAGCTCCTCAGTC-3',
LR 5/ -TCCTTCATCCTTTCAATGGCTTT-3'；
腸致病性大腸桿菌
BF :5, -GGAAGTCAAATTCATGGGGGTAT-3'，
BR 5/ -GGAATCAGACGCAGACTGGTAGT-3'；
腸侵襲性大腸桿菌
IF 5/ -CTGGATGGTATGGTGAGG-3'，
IR 5/ -GGAGGCCAACAATTATTTCC-3;；
(3)陽性質控標準品的制備
采用PCR法分別擴增腸出血性大腸桿菌0157:H7 Ο-antigen基因、腸毒素性大腸桿菌LT基因、腸致病性大腸桿菌ΑφΑ基因和腸侵襲性大腸桿菌invasion plasmid基因，分別將PCR產物與克隆載體pMD-19-T vector連接，轉化感受態大腸桿菌JM109，獲得陽性重組菌，參照華舜小量質粒DNA提取試劑盒說明書制備陽性質粒；
(4)PCR反應體系經過對不同組合實驗結果的比較分析，確定了最佳的單重PCR反應體系及反應條件，相應的PCR產物瓊脂糖凝膠電泳檢測結果見圖I。單重PCR反應體系，如下表
權利要求
1.一種四種致腹瀉性大腸桿菌的多重PCR檢測用引物組，其特征在于，核苷酸序列為 腸出血性大腸桿菌O157 = H7引物對為OF :5' -ATTGCGCTGAGGCCTTTG-3', OR :5' -CGAGTACATTGGCATCGTG-3'； 腸毒素性大腸桿菌引物對為LF :5' -GCACACGCAGCTCCTCAGTC-3', LR :5' -TCCTTCATCCTTTCAATGGCTTT-3'； 腸致病性大腸桿菌引物對為BF :5, -GGAAGTCAAATTCATGGGGGTAT-3'， BR :5' -GGAATCAGACGCAGACTGGTAGT-3'； 腸侵襲性大腸桿菌引物對為IF :5' -CTGGATGGTATGGTGAGG-3'，IR :5' -GGAGGCCAACAATTATTTCC-3。
2.根據權利要求I所述的一種四種致腹瀉性大腸桿菌的多重PCR檢測用引物組，其特征在于所述的引物對的添加摩爾比為OF/OR: LF/LR: BF/BR: IF/IR為I: I: I: I. 3。
3.一種四種致腹瀉性大腸桿菌的多重PCR檢測用陽性對照品的制備PCR擴增引物組，其特征在于，核苷酸序列為 腸出血性大腸桿菌O157 = H7陽性對照品的制備PCR擴增引物EHEC-F :5' -CTATAGAAATTGCTGCTGTAG-3', EHEC-R :5' -TCTAACCCTTCAGCATTATTA-3'； 腸毒素性大腸桿菌陽性對照品的制備PCR擴增引物ETEC-F :5' -AACCCTGGATTCATCATGCAC-3'， ETEC-R :5' -TAGTTTTCCATGCTGATTGCC-3'； 腸致病性大腸桿菌陽性對照品的制備PCR擴增引物EPEC-F :5' -AAATCATGAATAAGAAATACG-3', EPEC-R :5' -CAGTATTTTTACATGCAGTTG-3'； 腸侵襲性大腸桿菌陽性對照品的制備PCR擴增引物EIEC-F :5' -CTGGAAAAACTCAGTGCCTCT-3'， EIEC-R :5' -AGCTTCCGTACGCTTCAGTAC-3'。
4.一種非診斷或治療目的的四種致腹瀉性大腸桿菌的多重PCR檢測方法，其特征在于，包括如下步驟 (1)PCR模板的制備 參照天根TIANamp Bacteria DNA Kit說明書進行細菌基因組DNA的提取和純化； (2)設計PCR引物 選擇腸出血性大腸桿菌O157 = H7的0-antigen基因、腸毒素性大腸桿菌的LT基因、腸致病性大腸桿菌的基因和腸侵襲性大腸桿菌的invasion plasmid基因作為祀基因，設計合成以下引物進行靶基因的擴增 腸出血性大腸桿菌O157 = H7 0-antigen基因的PCR擴增引物EHEC-F :5' -CTATAGAAATTGCTGCTGTAG-3',EHEC-R :5' -TCTAACCCTTCAGCATTATTA-3'； 腸毒素性大腸桿菌LT基因的PCR擴增引物ETEC-F :5' -AACCCTGGATTCATCATGCAC-3'，ETEC-R :5' -TAGTTTTCCATGCTGATTGCC-3'； 腸致病性大腸桿菌6//7A基因的PCR擴增引物EPEC-F :5' -AAATCATGAATAAGAAATACG-3',EPEC-R :5' -CAGTATTTTTACATGCAGTTG-3'； 腸侵襲性大腸桿菌invasion plasmid基因的PCR擴增引物EIEC-F :5' -CTGGAAAAACTCAGTGCCTCT-3'，EIEC-R :5' -AGCTTCCGTACGCTTCAGTAC-3'； 利用設計合成的靶基因PCR引物，分別以腸出血性大腸桿菌O157 = H7 (ATCC 35150)、腸毒素性大腸桿菌(ATCC 35401)、腸致病性大腸桿菌(ATCC 11775)和腸侵襲性大腸桿菌(ATCC 43893)的基因組DNA為模板擴增靶基因，將擴增的靶基因序列進行BLAST比對分析，分別選取每種致腹瀉性大腸桿菌靶基因序列的保守區設計合成了 4對特異性多重PCR鑒定引物 腸出血性大腸桿菌O157 = H7 OF :5' -ATTGCGCTGAGGCCTTTG-3',OR :5' -CGAGTACATTGGCATCGTG-3'； 腸毒素性大腸桿菌LF :5' -GCACACGCAGCTCCTCAGTC-3',LR :5' -TCCTTCATCCTTTCAATGGCTTT-3'； 腸致病性大腸桿菌BF :5, -GGAAGTCAAATTCATGGGGGTAT-3'，BR :5' -GGAATCAGACGCAGACTGGTAGT-3'； 腸侵襲性大腸桿菌IF :5' -CTGGATGGTATGGTGAGG-3'，IR :5' -GGAGGCCAACAATTATTTCC-3'； (3)陽性質控標準品的制備 采用PCR法分別擴增腸出血性大腸桿菌0157:H7 0-antigen基因、腸毒素性大腸桿菌LT基因、腸致病性大腸桿菌基因和腸侵襲性大腸桿菌invasion plasmid基因，分別將PCR產物與克隆載體pMD-19-T vector連接，轉化感受態大腸桿菌JM109，獲得陽性重組菌，參照華舜小量質粒DNA提取試劑盒說明書制備陽性質粒； (4)PCR反應體系 單重PCR反應體系，如下表
5.一種四種致腹瀉性大腸桿菌的多重PCR檢測用試劑盒，其特征在于包括權利要求I所述的引物組。
全文摘要
本發明涉及一種基于多重PCR技術快速檢測四種致腹瀉性大腸桿菌的方法及其專用引物。分別選擇腸出血性大腸桿菌O157:H7O-antigen基因、腸毒素性大腸桿菌LT基因、腸致病性大腸桿菌bfpA基因和腸侵襲性大腸桿菌invasionplasmid基因為靶基因，通過基因序列的比對分析，選取靶基因序列的保守區設計合成引物，具體引物如序列表SEQ ID No.1-8所示，建立多重PCR檢測方法，對4種致腹瀉性大腸桿菌進行定性檢測。本發明方法具有較強的檢測特異性。本發明還涉及到檢測用試劑盒，還具有快速簡單，準確性高，靈敏度好的優點。
文檔編號C12Q1/68GK102851384SQ20121035672
公開日2013年1月2日 申請日期2012年9月24日 優先權日2012年9月24日
發明者徐義剛, 李丹丹, 劉忠梅, 吳巖, 劉新亮, 李蘇龍 申請人:黑龍江出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心