專利名稱：一種骨靶向藥物天冬氨酸六肽丹參素的合成方法及其醫療用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種骨靶向藥物天冬氨酸六肽丹參素的合成方法及防治骨質疏松的應用，屬于藥物制造的技術領域。
背景技術：
骨質疏松癥是老年人和絕經婦女的常見病、多發病。其主要的發病機制是機體的骨重建的失衡，骨重建是指去除骨骼局部舊骨代謝形成新骨的過程，是成熟骨組織的ー種重要替換機制，是破骨細胞與成骨細胞ー個成對的、相偶聯的細胞活動過程。骨質疏松癥是ー種以骨量低下、骨顯微結構破壞為特征，導致骨脆性増加、易發生骨折的全身性骨病。骨量低下是指骨組織單位體積內骨質含量減少，骨微結構破壞指骨質中鈣逐漸流失，骨小梁變薄、變細、斷裂和骨組織內的孔隙增多，最終導致骨脆性増加，骨強度下降，容易發生骨折。骨質疏松癥的臨床表現主要有全身性的骨痛、駝背、身高縮短和骨折，最常見的骨折部位是胸、腰椎、股骨上端和橈骨遠端骨折。骨質疏松性骨折在骨質疏松癥患者中的發病 率為20%左右，且呈逐年上升的趨勢，成為威脅老年人身心健康和影響生活質量的僅次于心血管疾病的嚴重疾病。特別是髖部骨折后，使患者失去生活自理能力，長期臥床易并發感染、心血管疾病。骨質疏松癥國際骨質疏松基金會的統計數據顯示，骨質疏松癥目前危害著全球大約三分之一 50歲以上的女性和五分之一 50歲以上的男性。隨著世界人ロ的増加和平均壽命的提高，這種疾病的威脅將越來越大。2008年10月20日在北京發布的《骨質疏松癥防治中國白皮書》指出，我國至少有6944萬人患有骨質疏松，有2. I億人患低骨量存在骨質疏松癥的風險。預計到2020年我國骨質疏松和低骨量患者將增加至2. 8億。如果這么大的人群得不到早期干預治療，其后果將是骨折發生率大大增加，不但給患者帶來痛苦和經濟負擔，也會給醫療資源帶來不小的壓力。骨質疏松癥已成為一個日益突出的社會公共健康問題。目前，治療骨質疏松癥主要有兩大類ー類是抑制骨吸收的藥物；ー類是促進骨形成的藥物。前者有雙膦酸鹽(羥こ膦酸鈉和阿侖膦酸鈉等)、降鈣素(鮭魚降鈣素和鯁魚降鈣素衍生物)、選擇性雌激素受體調節劑、雌激素、活性維生素D和鈣劑；后者有氟化物、甲狀旁腺素、活性維生素D和合成類固醇等。然而骨組織是ー種特殊的組織，其血流量低、硬度大、滲透性差和生理生化過程特殊，按一般的給藥途徑很難使藥物轉運至有效部位，有些藥物常需全身給藥或者多次給藥，才能在骨組織中達到有效的治療濃度。這樣不僅降低了藥物的治療指數，也會對病人的非骨組織或器官造成不必要的毒副作用。如長期應用雌激素治療骨質疏松癥易出現陰道出血、乳房腫痛、子宮內膜增生和靜脈血栓等嚴重不良反應；活性維生素D治療骨質疏松癥呈劑量依賴性，然而增加VD用量時則可能引起高鈣血癥和高尿血癥。為了解決骨質疏松的治療難題，本課題組對中藥進行了長期的研究，已發現丹參素在治療骨質疏松方面具有較好的作用，丹參素是唇形科植物丹參的主要水溶性成分，化學名為D(+) β-(3，4-ニ羥基苯基)乳酸，其化學結構有許多文獻報道，在預防骨質疏松方面已有文獻證明丹參的粗提取物對成骨細胞株MC3T3-E1細胞堿性磷酸酶活性有明顯的促進作用(丁寅相，華西口腔醫學雜，1996)，對人成骨細胞缺血-再灌注損傷有保護作用(王福生，中華現代醫學雜志，2000)，對骨折愈合有促進作用(符詩聰，中國中西醫結合雜志，1999)。本課題組證明丹參水提物能有效預防糖皮質激素導致的大鼠骨質疏松(崔燎，生物醫學工程，2004)，還可阻止去卵巢大鼠牙槽骨的骨丟失(張曉燕，中成藥，2007)，丹參水提物和丹參素促進成骨細胞活性和防治潑尼松所致大鼠骨質疏松(崔燎，中國藥理學通報，2004)等。關于丹參素的藥理學研究，已經證明丹參素能擴張心腦血管，抵抗血小板粘附聚集，清除氧自由基；能抑制細胞內源性膽固醇合成的作用，具有抗脂蛋白氧化的作用，防止 氧化蛋白對細胞的損傷；還能改善微循環，加速血液流速，抵抗血小板凝聚和血栓形成的作用，具有提高機體抗凝和纖溶活性的作用(楊春欣，中國藥理學通報，1997)。而本課題組經體外細胞實驗還發現丹參素對體外大鼠顱蓋骨成骨細胞有直促進增殖、分化和礦化作用，上調成骨細胞骨保護素基因的表達；另外，還可誘導或促進體外培養的骨髄基質細胞成骨分化，抑制其成脂分化。因此我們認為丹參素可預防或治療骨質疏松癥，其可能機制通過直接促進成成骨細胞骨基質的形成及礦化從而對抗骨吸收，和間接通過改善微循環促進成骨源細胞-骨髄基質細胞成骨分化，從而提高骨形成。丹參素屬于酚酸類化合物，經研究認為其活性基團是苯乳酸丹參素，其結構較為不穩定，尤其是在堿性環境中，其化學不穩定性可能與其結構中的α -羥基和酚羥基有夫，在水溶液中鄰ニ酚羥基的電荷密度増大，易解離形成氧負離子，發生自動氧化生成有色醌類物質，而α-羥基由于羧基的存在變得更活潑，還原性強；丹參素其在人體內代謝較快被代謝，消除半衰期約O. 94h (約56min)(劉琦，藥學學報，2003)，在代謝的方式可能是通過α -羥基的こ酰化使其失去活性(裴渭靜，分析化學研究簡報，2005)。丹參素的這些結構特點，影響了其在體內的應用。天冬氨酸寡肽作為骨靶向藥物的載體已應用始于2000年，kasugai等發現幾種能與HA結合的非膠原蛋白，在其與羥基磷灰石吸附實驗(HA)的可能結合位點處有重復的氨基酸序列，因此合成了小肽(Asp)6，將其與熒光素異硫氰酸偶聯，考察它在小鼠體內分布情況及其體外親和力。實驗結果表明在硬組織(牙、骨)中有明顯的熒光標記，而在軟組織中未發現(Kasugai S, J Bone Miner Res,2000)。以上結果表明，(Asp)6是一個有效的骨革巴向藥物載體分子。進ー步研究表明其親骨性只與其氨基酸數目有夫，與其旋光性無關。考慮到D型氨基酸在體內可能不易被水解，研究者建議使用L-型氨基酸。(L-Asp)6通過連接橋丁ニ酸與雌ニ醇連接得到了抗骨質疏松癥化合物E2 ^D6(Sekidc) T, J Drug Target, 2001)和E2 · 17 β D6 (Yokogawa K, Endocrinology, 2001),對HA的親和カ與原藥都增加，體內也顯示了較高的骨靶向性，藥效顯示可防止去卵巢大鼠的骨丟失，而不會引起子宮的不良反應。我們在研究中發現，以天冬六肽與丹參素結合，組成新型的骨靶向藥物，可解決丹參素結構的不穩定性及較短半衰期短的問題，同時由于六肽為骨靶向載體，與丹參素結合后可作為丹參素骨靶向載體，増加其在骨組織的分布及沉積，使其更好地發揮抗骨質疏松的作用。

發明內容
合成一種以天冬六肽為骨靶向載體的天冬六肽丹參素，解決丹參素結構的不穩定性及在體內半衰期短，在骨組織中分布少，抗骨質疏松作用不強問題，為骨質疏松臨床應用提供新的治療藥物。本發明的主要實施方案是骨靶向丹參素的設計及合成丹參素化合物的結構中含有羧基(見說明書附圖
I)，可與氨基形成酰胺鍵，本設計參考布洛芬與六肽的連接方式(見說明書附圖2)，設計將丹參素與天冬氨酸六肽(L-Asp) 6的N端以酰胺鍵結合得化合物天冬氨酸六肽-丹參素(簡稱DD6),結構見說明書附圖3。我們采用固相合成法對天冬氨酸六肽-丹參素進行合成，方法如下天冬氨酸六肽-丹參素(DD6)的合成設計固相多肽合成采用固定羧基端，即由C向N端合成；先將所要合成肽鏈的C端氨基酸的羧基以共價鍵的形式同固相合成樹脂相連，然后以結合在樹脂上的氨基酸的氨基作為反應活性位點，與下一個氨基酸的羧基反應生成肽鍵，延長肽鏈。重復(縮合、洗滌、去保護、中和、洗滌和下ー輪縮合)操作，達到所要合成的肽鏈長度，最后將肽鏈從樹脂上切割下來，經過純化等處理，即得所要的多肽。
固相多肽合成包括固相合成樹脂、氨基酸保護策略以及肽鍵縮合試劑三個關鍵部，目前較為常用的樹脂是wang氏樹脂，屬于ー種酸敏感羥基樹脂，其羥基位點可與氨基酸羧基端形成酯鍵。氨基酸所需保護基團是α-氨基及側鏈基團，如今α-氨基的保護常用9-芴甲氧羰基(Fmoc)，其對酸穩定，其可用20%哌啶/DCM或哌啶/DMF輕易脫除，具有反應條件溫和，副反應少，產率高等特點，采用Fmoc作為保護基的方法也稱為Fmoc合成法。天冬氨酸側鏈上存在活潑的羧基基團，目前常用的保護劑是叔丁氧基(OtBu)，對酸較敏感，可用TFA(三氟こ酸)去除，TFA還可用作樹脂的切割劑，將肽從樹脂上切割下來。本合成選用wang氏樹脂作為固相載體將其與合成原料Fmoc-Asp (OtBu) -OH成酯結合之后,再以苯并三氮唑-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)/I-羥基-苯并-三氮唑(HOBT) /N，N-ニ異丙基こ胺(DIEA)為縮合劑合成連接剩余氨基酸得肽樹脂，最后再用適合縮合劑將丹參素(DSU)與肽樹脂結合，切割得粗產物。本研究采用多肽固相合成法先合成(L-Asp) 6載體，采用Fmoc保護α-氨基，用20%哌啶/DMF脫除，使用含有側鏈保護的Fmoc-Asp (OtBu) -OH為合成原料。氨基酸羧基端先與Wang樹脂的羥基位成酯連接后，肽鏈從C端向N端延伸，得到線型肽樹脂后，再脫除氨基保護基，將丹參素的羧基端與肽鏈的N端縮合后，用含有95% TFA的切割劑割去樹脂和側鏈保護劑，經冰こ醚沉淀后即得到目標化合物粗品。其合成路線見說明書附圖4。天冬氨酸六肽-丹參素(DD6)的合成步驟(一)Fmoc-Asp (OtBu)-O-Wang 樹脂的合成(成酯反應)(I)樹脂的溶脹稱取Wang樹脂于預先經DCM處理的反應器中，用DCM溶脹過夜，使樹脂充分溶脹，便于反應能夠較完全進行，分別用DCM及DMF洗滌樹脂，真空泵抽干。(2)Fmoc保護基團的脫除配置20%哌啶/DMF脫除劑，為了能充分脫除Fmoc基團，采用兩次脫除法。第一次脫除時間15min，試劑用量15mL/g樹脂；第二次，脫除時間15min,試劑用量15mL/g樹脂。(3)洗滌依次用DMFX I，DCMX 5、DMFX I進行洗漆，每次氮氣鼓吹攪拌約Imin左右。(4)縮合反應將準確稱取的Fmoc-Asp (-OtBu) -OH (4倍樹脂擔載量當量)和HOBt (2倍樹脂擔載量當量)放入燒杯中，加入45% DMF/THF磁力攪拌，溶解后，置于冰浴中，緩慢加入DIC (2倍當量)，攪拌反應活化20min。然后將此活化酯溶液倒入盛有Wang樹脂的反應器(加入樹脂前用DCM處理反應器)中；再加DMAP (O. 3倍樹脂擔載量當量)，室溫下通入氮氣反應6h。反應結束后用DMF洗3次，加入ニ氯甲烷、こ酸酐和ニこ胺后，室溫反應30min以封閉未被酯化的羥基。抽干，用DMF、DCM、MeOH分別洗滌三次，真空干燥樹脂。備下步合成用。(ニ)Fmoc-Asp (OtBu) - [Asp (OtBu) ] 4_Asp (OtBu) -O-Wang 樹脂的合成(I)反應前樹脂的溶脹處理準確稱取上所得氨基酸樹脂加入反應器中，加入IOmLDCM浸泡，封閉過夜，使樹脂充分溶脹。真空抽去溶劑，用DMFX2洗滌lmin，抽干。(2)脫除Fmoc氨基保護基:同2. I. I (2)。(3)洗滌同 2. I. 1(3)。(4)肽鍵的形成稱取HBTU(3倍過量，以樹脂上氨基酸物質的量為基準，下同)、HOBT (3倍過量)，磁力攪拌下加入DMF溶解，再加入Fmoc-Asp (-otBu) -OH (3倍過量)溶解，室溫攪拌活化30min加入到脫除Fmoc氨基保護樹脂中。量取DIEA (6倍過量)，通入氮氣室溫下反應直到茚三酮檢測顯示反應完全為止依次用DCM，DMF洗滌。重復步驟(2) (3)，直至六肽皆連接上。用DMF、DCM、MeOH分別洗滌三次，真空干燥樹脂。備下步合成用。若縮合效率不高，有必要用50%醋酸酐/吡啶(V/V)在25°C下反應2h，以封閉未反應氨基。(三)天冬氨酸六肽丹參素的合成(I)反應前樹脂的溶脹處理準確稱取上所得肽樹脂加入到燒瓶中，用IOmL DCM浸泡過夜，使樹脂充分溶脹。真空抽去溶劑，用3mL DMFX2洗滌，抽干。(2)脫除Fmoc氨基保護基:同2. I. I (2)。(3)洗滌同 2. I. 1(3)。(4)肽鍵的形成準確稱取DSU(等量，與樹脂上肽的物質的量為基準，下同)用適當溶劑溶解，再稱取HBTU (等量)和HOBT (等量)，經DMF溶解后，一起加入到脫除Fmoc肽保護樹脂中，量取加入DIEA(2倍過量)，通入氮氣室溫下反應。用DMF、DCM、MeOH分別洗滌三次，除去溶劑后，樹脂直接于反應器中放置真空干燥箱中干燥。(5)脫除側鏈保護及樹脂取出反應器，氮氣鼓吹下，加入冰的切割劑TFA/TIS/H2O (95/2. 5/2. 5，V/V/V)室溫下反應2h。反應結束后，抽濾，收集濾液，用少量TFA洗樹脂三次，合并濾液，加入大量無水冰こ醚，離心、洗滌三次，收集沉淀。沉淀經真空干燥，即得合成的天冬氨酸六肽丹參素產品。( ニ)天冬氨酸六肽-丹參素(DD6)的質量控制對所合成的粗品進行高效液相色譜(RP-HPLC)分析，收集主峰，對其進行質譜鑒定。I)樣品溶液制備稱取所合成的天冬氨酸六肽-丹參素,用O. I % TFA-H2O溶解后用O. 22 μ m濾膜過濾，供RP-HPLC分析備用。2) RP-HPLC 分析條件色譜分析儀器及分析條件如下儀器AngilentHPLC 1200series色譜柱ODSC18 柱(250mmX 4. 6mm, 5 μ m, Hypersil)
流動相A0. I % TFA/H20，B 0. 1% TFA/ こ腈流速lmL/min,檢測波長280nm,進樣量20 μ L洗脫程序如下
權利要求
1.一種六肽丹參素的合成方法及其醫療用途。
2.如權利要求I所述的ー種六肽丹參素的合成方法是指將丹參素結構中含有的羧基與天冬氨酸六肽的N端以酰胺鍵結合得化合物天冬氨酸六肽-丹參素，結構見說明書附圖3。
3.如權利要求I所述的ー種六肽丹參素的合成方法是指以天冬氨酸六肽為載體的合成方法，其特征是采用多肽固相合成法先合成天冬氨酸六肽載體，采用9-芴甲氧羰基保護α -氨基，用20%哌啶/N，N- ニ甲基甲酰胺脫除，使用含有側鏈保護的9-芴甲氧羰基-天冬氨酸(叔丁氧基)-OH為合成原料；氨基酸羧基端先與Wang樹脂的羥基位成酯連接后，肽鏈從C端向N端延伸，得到線型肽樹脂后，再脫除氨基保護基，將丹參素的羧基端與肽鏈的N端縮合后，用含有95%三氟こ酸的切割劑割去樹脂和側鏈保護劑，經冰こ醚沉淀后即得到目標化合物粗品，其合成路線包括下述步驟 (1)9-芴甲氧羰基-天冬氨酸(_叔丁氧基)-O-Wang樹脂的合成(成酯反應) 1)樹脂的溶脹稱取Wang樹脂于預先經ニ氯甲烷處理的反應器中，用ニ氯甲烷溶脹過夜，使樹脂充分溶脹，便于反應能夠較完全進行，分別用ニ氯甲烷及N，N-ニ甲基甲酰胺洗滌樹脂，真空泵抽干； 2)9-芴甲氧羰基保護基團的脫除配置20%哌啶/N，N-ニ甲基甲酰胺脫除劑，為了能充分脫除9-芴甲氧羰基基團，采用兩次脫除法。第一次脫除時間15min，試劑用量15mL/g樹脂；第二次，脫除時間15min,試劑用量15mL/g樹脂； 3)洗滌依次用N，N-ニ甲基甲酰胺XI，ニ氯甲烷X5、N，N-ニ甲基甲酰胺Xl進行洗漆，姆次氮氣鼓吹攪拌約Imin左右； 4)縮合反應將準確稱取的9-芴甲氧羰基-天冬氨酸(_叔丁氧基)-OH(4倍樹脂擔載量當量)和HOBt (2倍樹脂擔載量當量)放入燒杯中，加入45% N，N-ニ甲基甲酰胺/四氫呋喃磁力攪拌，溶解后，置于冰浴中，緩慢加入N，N' -ニ異丙基碳ニ亞胺(2倍當量)，攪拌反應活化20分鐘。然后將此活化酯溶液倒入盛有Wang樹脂的反應器(加入樹脂前用ニ氯甲烷處理反應器)中；再加4-ニ甲氨基吡啶(O. 3倍樹脂擔載量當量)，室溫下通入氮氣反應6小吋。反應結束后用N，N-ニ甲基甲酰胺洗3次，加入ニ氯甲烷、こ酸酐和ニこ胺后，室溫反應30分鐘以封閉未被酯化的羥基。抽干，用N，N-ニ甲基甲酰胺、ニ氯甲烷、MeOH分別洗滌三次，真空干燥樹脂； (2)9-芴甲氧羰基-天冬氨酸(叔丁氧基)-[天冬氨酸(叔丁氧基)]4-天冬氨酸(叔丁氧基)-O-Wang樹脂的合成 1)反應前樹脂的溶脹處理準確稱取上所得氨基酸樹脂加入反應器中，加入IOmLニ氯甲烷浸泡，封閉過夜，使樹脂充分溶脹，真空抽去溶劑，用N，N-ニ甲基甲酰胺X2洗滌I分種，抽干； 2)脫除9-芴甲氧羰基氨基保護基方法同⑴步驟的2)； 3)洗滌方法同(I)步驟的3)； 4)肽鍵的形成稱取苯并三氮唑-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯(3倍過量，以樹脂上氨基酸物質的量為基準，下同)、1_羥基-苯并-三氮唑(3倍過量)，磁力攪拌下加入N, N- ニ甲基甲酰胺溶解，再加入9-芴甲氧羰基-天冬氨酸(叔丁氧基)-OH (3倍過量)溶解，室溫攪拌活化30分鐘，加入到脫除Fmoc氨基保護樹脂中；量取N，N- ニ異丙基こ胺(6倍過量)，通入氮氣室溫下反應，直到茚三酮檢測顯示反應完全為止，依次用ニ氯甲烷，N, N- ニ甲基甲酰胺洗滌。重復步驟2)和3)，直至六肽皆連接上；用N，N- ニ甲基甲酰胺、ニ氯甲烷、MeOH分別洗滌三次，真空干燥六肽樹脂； (3)天冬氨酸六肽丹參素的合成 1)反應前樹脂的溶脹處理準確稱取上所得六肽樹脂加入到燒瓶中，用IOmLニ氯甲烷浸泡過夜，使樹脂充分溶脹，真空抽去溶劑，用3mLN，N- ニ甲基甲酰胺X2洗滌，抽干； 2)脫除9-芴甲氧羰基氨基保護基方法同⑴步驟的2)； 3)洗滌方法同(I)步驟的3)； 4)肽鍵的形成準確稱取丹參素(等量，與樹脂上肽的物質的量為基準，下同)，再稱取苯并三氮唑-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯(等量)和I-羥基-苯井-三氮唑(等量)，經N，N-ニ甲基甲酰胺溶解后，一起加入到脫除9-芴甲氧羰基肽保護樹脂中，量取加入N, N-ニ異丙基こ胺(2倍過量)，通入氮氣室溫下反應，用N，N-ニ甲基甲酰胺、ニ氯甲烷、MeOH分別洗滌三次，除去溶劑后，樹脂直接于反應器中放置真空干燥箱中干燥； 5)脫除側鏈保護及樹脂取出反應器，氮氣鼓吹下，加入冰的切割劑三氟こ酸/三異丙基硅烷/水(95/2. 5/2.5，V/V/V)室溫下反應2小時，反應結束后，抽濾，收集濾液，用少量三氟こ酸洗樹脂三次，合并濾液，加入大量無水冰こ醚，離心、洗滌三次，收集沉淀；沉淀經真空干燥，即得合成的天冬氨酸六肽丹參素產品。
4.如權利要求I所述的ー種六肽丹參素的醫療用途是指該產品可作為骨靶向藥物用于預防和治療骨質疏松癥。
5.如權利要求I所述的ー種六肽丹參素的醫療用途是指該產品可用于預防和治療心肌梗死，冠心病，動脈粥樣硬化，高血脂，肝損傷，抗腦缺血損傷和抗腫瘤。
全文摘要
本發明公開了一種骨靶向藥物天冬氨酸六肽丹參素的合成方法，以及其醫療用途，特別是在防治骨質疏松的應用，屬于藥物制造的技術領域，六肽丹參素的合成方法是將丹參素結構中含有的羧基與天冬氨酸六肽的N端以酰胺鍵結合得化合物天冬氨酸六肽-丹參素；本發明制備的天冬氨酸六肽-丹參素可靶向作用于骨組織，使骨組織微血管擴張，促進骨的微循環，同時，可以使骨髓基質干細胞向成骨分化，促進成骨細胞形成，增加骨的合成，明顯地預防骨質疏松，是臨床預防和治療骨質疏松的良藥。進一步的研究發現，這種六肽丹參素由于其在體內不易被氧化，在血液中維持時間較久，還有許多醫療用途，這些醫療用途包括預防和治療心肌梗死，冠心病，動脈粥樣硬化，高血脂，肝損傷，抗腦缺血損傷和抗腫瘤。
文檔編號A61K47/48GK102643330SQ20111020236
公開日2012年8月22日 申請日期2011年7月9日 優先權日2011年7月9日
發明者仲利萍, 呂應年, 吳怡, 吳鐵, 崔燎 申請人:廣東醫學院, 湛江廣醫醫藥科技開發有限公司