專利名稱：槲皮素在制備nlrp3炎癥小體抑制藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及黃酮類單體化合物槲皮素的新用途，具體地說是涉及槲皮素在制備NLRP3 炎癥小體抑制藥物中的應用，特別是涉及制備治療代謝疾病誘導的腎臟脂肪變性及炎性損害的藥物中的應用。
背景技術：
槲皮素為天然黃酮類成分。NLRP3炎癥小體由NLRP3(N0D-like receptor protein 3)、 ASC (apoptosis-associated speck-like protein)禾口 Caspase-1 組成[Duewell P, Kono H, Rayner KJ et al (2010) NLRP3 inflammasomes are required for atherogenesis and activated by cholesterol crystals. Nature 464: 1357-1361]。研究證實,NLRP3 炎癥小體可被多種內源性因子代謝紊亂異常激活，包括高尿酸血癥[Gasse P, Riteau N, Charron S et al (2009) Uric acid is a danger signal activating NALP3 inflammasome in lung injury inflammation and fibrosis. Am J Respir Crit Care Med 179: 903-913]> 高血糖[Schroder K, R Zhou, et al. (2010) The NLRP 3 inf lammasome: a sensor for metabolic danger ？ Science 327(5963): 296-300·]、血月旨紊舌L [Cholesterol crystals activate the NLRP3 inflammasome in human macrophages: a novel link between cholesterol metabolism and inflammation. PLoS ONE 5: ell765]等等。最新的研究證實，NLRP3炎癥小體的異常激活會誘導腎臟組織產生包括脂肪變性和炎性損害在內的一系列功能性和器質性損害[A Vilaysane, J Chun, ME Seamone et al (2010) The NALP3 inflammasome promotes renal inflammation and contributes to CKD. J Am Soc Nephrol 21: 1732-1744; Navarro-Gonzalez JF, Mora-Fernandez C (2008) The role of inflammatory cytokines in diabetic nephropathy. J Am Soc Nephrol 19: 433—442]。 而目前國內外尚無針對抑制NLRP3炎癥小體治療代謝疾病誘導的腎臟脂肪變性及炎性損害的藥物；本發明涉及槲皮素制備NLRP3炎癥小體抑制藥物，可針對性治療尿酸、血糖、血脂等一系列內源性因子代謝紊亂誘導的腎臟組織脂肪變性及炎性損害。

發明內容
本發明的目的在于提供槲皮素的新用途，具體地說是提供槲皮素在制備NLRP3炎癥小體抑制藥物中的應用；該藥物可有效治療代謝疾病誘導的腎臟脂肪變性及炎性損害。本發明的技術解決方案提供槲皮素在制備NLRP3炎癥小體抑制藥物中的應用。 該應用包括了以槲皮素為主料，配以本領域的技術人員所熟知的藥用輔料(賦形劑、助溶劑、控釋劑等)，用常規的制劑方法制成本領域的技術人員所熟知的劑型(包括口服液、注射劑、膠囊劑、片劑、顆粒劑、微囊劑等)，用于制備NLRP3炎癥小體抑制藥物中的應用；該藥物用于治療代謝疾病誘導的腎臟脂肪變性及炎性損害。本發明的優點是，提供了對NLRP3炎癥小體具有確切抑制調節作用的槲皮素用于制備NLRP3炎癥小體抑制藥物，用于治療代謝疾病誘導的腎臟脂肪變性和炎性損害及其它與NLRP3炎癥小體異常激活相關的疾病。本發明具有3個明顯的進步和優點1、成分明確 (槲皮素)；2、作用靶點明確(NLRP3炎癥小體)；3、調節作用明確(抑制調節)。
本發明利用高尿酸血癥大鼠模型、果糖大鼠模型、STZ糖尿病大鼠模型等代謝紊亂模型在組織細胞水平、基因轉錄水平和蛋白表達水平上科學地評價并確定了槲皮素對 NLRP3炎癥小體的抑制調控作用以及對代謝疾病誘導的腎臟脂肪變性及炎性損害的改善作用。本發明所涉及的槲皮素對代謝紊亂模型動物表達異常升高的NLRP3炎癥小體組分具有確切的抑制作用；而對正常動物正常水平的NLRP3炎癥小體表達無顯著抑制作用， 具有很好的安全性。為了更好的理解本發明的實質，下面將用槲皮素的藥理實驗及結果來說明其在制備NLRP3炎癥小體抑制藥物中的應用。
具體實施例方式以下實施例僅作為講一步闡沭發明之用，不能用來限制本發明。實施例1 槲皮素對NLRP3炎癥小體的抑制調節作用和對代謝疾病模型動物腎臟脂肪變性及炎性損害的改善作用。實驗動物SD大鼠，160-200克，雄性。藥物配制選用槲皮素含量為20mg/片的NLRP3炎癥小體抑制藥物片劑，超聲分散于生理鹽水中，用于灌胃給藥，給藥劑量為25 mg/kg。實驗材料=Trizol，DEPC, M-MLV反轉錄酶，PCR試劑盒，RIPA裂解液等。實驗儀器高速冷凍離心機，高速勻漿機，Bio-rad垂直電泳槽，MBI-PCR儀、電泳槽等。實驗模型①大鼠高尿酸血癥模型；②果糖大鼠模型；③STZ糖尿病大鼠模型。實驗方法
1、模型的建立動物適應環境1周后，造模。①大鼠高尿酸血癥模型灌胃給予氧嗪酸鉀鹽700mg/kg ；對照給予等體積生理鹽水，造模周期60天。②果糖大鼠模型飲用水給予果糖溶液10%;對照給予自來水，造模周期60天。③STZ糖尿病大鼠模型腹腔注射STZ 55mg/kg，對照給予生理鹽水，造模周期60天。2、給藥造模期間同時給藥，灌胃給予25 mg/kg槲皮素(98%)；對照給予生理鹽水。3、動物處死冰臺上分離腎臟組織，組織經液氮冷凍后保存于-80°C。4、冰凍切片后常規油紅0染色和HE染色。5、蛋白質印跡法(Western-blotting)取組織約IOOmg加入Iml的RIPA裂解液勻漿提取，12000g 4°C離心15分鐘，得腎臟組織總蛋白提取液，Bradford法測蛋白濃度，稀釋蛋白樣品至終濃度為5 ug/ul。混合上樣緩沖液變性上樣，SDS-PAGE凝膠電泳后PVDF轉膜，封閉液封閉1小時后加入rNLRP3、rACS和rCaspase-1抗體(根據NCBI數據庫相應蛋白序列制備，使用濃度1:4000) 4°C孵育過夜，二抗(1:4000)室溫搖床孵育1小時，HRP-ECL 發光，暗室曝光顯影。膠片掃描后對圖片進行灰度分析。6、逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)提取大鼠腎臟總RNA，逆轉錄得到cDNA模板， 根據NCBI數據庫的rNLRP3、rACS和rCaspase-Ι基因設計引物，進行rNLRP3、rACS和 rCaspase-Ι目的基因擴增。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳后UV成像，對圖片進行灰度分析。
實驗結果
a.油紅染色和HE染色
油紅染色結果顯示相對于正常對照動物，高尿酸血癥模型大鼠腎臟皮質出現明顯可見的紅色脂滴，果糖模型和STZ模型大鼠腎臟皮質出現數目眾多的紅色脂滴，包括大型脂滴。25mg/kg槲皮素給藥組動物腎臟皮質紅色脂滴均得到有效控制，數目和體積均明顯下降。HE染色結果顯示相對于正常對照動物，高尿酸血癥模型、果糖模型和STZ模型大鼠腎小管明顯擴張，腎間質可觀察到炎性細胞浸潤和纖維結締組織增生(慢性炎)。25mg/kg 槲皮素給藥組動物腎小管的擴張和腎間質的慢性炎癥變化均明顯減輕。上述結果說明25mg/kg槲皮素給藥可有效改善高尿酸血癥模型、果糖模型和STZ 模型大鼠腎臟組織脂肪變性及炎性損害。b.蛋白質印跡法 Western-Blotting
Group 模型+槲皮素 η = 5
空白+生理鹽水空白+槲皮素模型+生理鹽水
高尿酸血癥模型
NLRP3 灰度值 30. 5 士 10. 2 士 11.7*
ACS 灰度值42.7 士 8. 3
55. 6 士 12. 3*
Caspase-I 灰度值 17. 5 士 7. 5
25.1 士 9. 8**
果糖模型 NLRP3灰度值 29. 7 士 15. T ACS灰度值 41. 9 士 13. 3*
Caspase-I ^ciJft
26.0 士 9.8**
STZ模型 NLRP3灰度值 37. 5 士 11. T ACS灰度值 10. 4+++ 55.6 士 7.9*
Caspase-I 灰度值30. 1 士 8. 9
40. 1 士 8. 2*
28. 4 士 13. 9 73. 1 士 17. 9++ 49. 0 48.4 士 11.0 82.9 士 17.4++ 18. 4 士 10. 443. 1 士 14. 3++
27. 5 士 6. 1
36. 7 士 9. 3 22. 5 士 7. 4
26.9 士 10.9
38. 4 士 10. 1 18.4 士 10.4
30.5 士 10.2 28.7 士 11.0 38. 0 士 5. 338. 4 士 8. 8
33. 1 士 9. 7
53. 1 士 16. 6++ 79. 8 士 12.4++ 49. 6 士 11.3++
73. 1 士 14. T+ 82. 9 士 56. 3 士 10. 2++
權利要求
1.槲皮素在制備NLRP3炎癥小體抑制藥物中的應用。
2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于所述的NLRP3炎癥小體抑制藥物用于治療代謝疾病誘導的腎臟脂肪變性和炎性損害。
全文摘要
本發明涉及黃酮類單體化合物槲皮素的新用途，具體是涉及槲皮素在制備NLRP3炎癥小體抑制藥物中的應用。動物試驗結果表明槲皮素對多種代謝紊亂模型動物腎臟表達異常增高的NLRP3炎癥小體組分具有確切的抑制作用。利用槲皮素配以相關輔料，用常規的制劑方法可制成針對性抑制NLRP3炎癥小體的藥物，該藥物可用于治療包括代謝疾病誘導腎臟脂肪變性和炎性損害在內的與NLRP3炎癥小體異常高表達相關的疾病。
文檔編號A61P13/12GK102319237SQ20111023014
公開日2012年1月18日 申請日期2011年8月11日 優先權日2011年8月11日
發明者孔令東, 潘穎, 王闖 申請人:南京大學