專利名稱：一種具抗β-乳球蛋白過敏效果的乳桿菌完整肽聚糖的制備方法、產品及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種肽聚糖的制備方法和應用，特別涉及一種乳桿菌的完整肽聚糖的制備方法，還涉及由該完整肽聚糖制備成的微乳制劑，其制備方法及其在制備抗β-乳球蛋白過敏的免疫增強劑中的應用。屬于生物制藥領域。
背景技術：
牛乳營養豐富，是嬰幼兒重要的食物蛋白來源。但據國外流行病學調查表明， 2% 6%的兒童對牛乳產生過敏反應，嚴重影響其對優質乳蛋白的吸收利用。β-乳球蛋白(β-lactglobulin)被視為最主要的牛乳過敏原蛋白之一，β-乳球蛋白對小牛具有類似免疫球蛋白的功能，但對于嬰兒來說卻是主要的過敏原，容易造成嬰兒的過敏反應， β-乳球蛋白主要誘發特異性IgE抗體介導的I型超敏反應，可引起嘔吐、腹痛和腹瀉等胃腸不適。且過敏引起的胃腸道疾病(如嬰幼兒結腸炎)常致兒童生長遲緩。如何減少乳球蛋白所致牛乳過敏癥已成為現代乳制品生產中急待解決的問題。申請者三年來在益生菌調節Thl/Th2失衡緩解β -乳球蛋白過敏方面取得了一定的研究成果，篩選到一株對IgE介導的乳球蛋白過敏具有較好療效的約氏乳桿菌 KLDS1. 7032，并新發現該約氏乳桿菌抗過敏的作用與細胞壁結構的完整性有關，其細胞壁肽聚糖是抑制過敏的主要成分。目前，對完整肽聚糖的生理功能及功能機制研究的較多，而對其產品制備方法的研究較少。現有細胞壁肽聚糖基本采用注射方式給藥，存在口服生物利用度低及過高劑量會引起不良反應的問題。而微乳是一新型理想的藥物釋放載體。具有透明，穩定吸收完善， 靶向釋藥等特點，并提高了藥物療效，降低毒副作用。臨床應用價值日益提高，具有很大的發展前景。因此，本發明將提取的乳桿菌完整肽聚糖制備成微乳制劑，其經口服到達體內后，可自發形成粒徑小于IOOnm的0/W微乳，由于藥物以分子形式分散于微乳中，可明顯提高藥物的釋放度，穩定性增加，口服生物利用度是普通制劑的3 4倍，為新型免疫增強劑的工業化生產奠定了一定的理論基礎。

發明內容
本發明所要解決的技術問題之一是公開了乳桿菌完整肽聚糖微乳在制備抗 β-乳球蛋白過敏的免疫增強劑中的應用；特別是應用于制備抗IgE介導的乳球蛋白過敏的免疫增強劑中。所述的免疫增強劑可進一步用于抗β -乳球蛋白過敏的藥物或食品制備中。優選的，所述的乳桿菌完整肽聚糖是從約式乳桿菌KLDS1. 7032中提取的。所述的約氏乳桿菌KLDS1. 7032，為乳桿菌(LactcAacillus johnsonii)，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址在北京市朝陽區北辰西路1號院3 號，中國科學院微生物研究所，其菌種保藏編號為CGMCCN0. 5050，保藏日期為2011年7月
48曰。本發明所要解決的技術問題之二是提供了一種制備乳桿菌完整肽聚糖的方法，具體的包括以下步驟(1)菌體的清洗與收集將約氏乳桿菌菌種活化傳代后，接種于MRS液體培養基中，37°C靜止培養18h ；培養完畢后迅速降溫至4°C。在5000g、4°C離心20min，收集菌體沉淀；4°C蒸餾水反復洗滌至菌體白色，收集菌體，置于100°C沸水水浴箱中滅活30min，得到熱致死菌泥；(2)去磷壁酸將步驟(1)所述的熱致死菌泥懸浮于預熱的質量分數為10%三氯乙酸溶液中，沸水浴20min以裂解菌體；冷卻后，5000g、4°C離心15min，收集沉淀；(3)脫脂濃度為0. 02mol/L，pH值為4. 6的乙酸鈉溶液，與氯仿、甲醇，三者按體積比4 5 10混合；用混合液溶解步驟( 得到的沉淀，所述混合液的體積比與沉淀體積比為15 1 ；室溫攪拌18h，8000g、4°C離心20min，收集沉淀；(4)去蛋白上述步驟(3)得到的沉淀中加入15倍沉淀體積的含有;3mg/mL胰蛋白酶和;3mg/mL堿性蛋白酶的pH 8. 0的0. lmol/L磷酸緩沖液，37°C水浴振蕩12h，以5000g、 4°C離心5min，沉淀用去離子水洗2次；(5)提純步驟(4)得到的沉淀經0. Olmol化―1硫酸溶液85 95°C處理5min。冰水浴中立即冷卻，12000g、4°C離心30min后棄上清，沉淀用去離子水在4°C條件下連續透析 7天，冷凍干燥后置4°C保存備用。本發明所要解決的技術問題之三是提供了一種按照以上所述的制備方法制備得到的完整肽聚糖。本發明所要解決的技術問題之四是提供了一種抗乳球蛋白過敏的微乳制劑， 其特征在于包括有效劑量的以上所述的完整肽聚糖微乳作為活性成分、還包括油相、表面活性劑、助表面活性劑和水。優選的，所述的表面活性劑為吐溫-80，所述的助表面活性劑為無水乙醇，所述的油相為正丁酸乙酯和維生素E的混合物。更優選的，所述的微乳制劑包括以下重量分數的各物質以上任一所述的完整肽聚糖3. 00%，質量比為7 3的正丁酸乙酯和維生素E組成的混合物1.07% 13.59%， 質量比為2 8的吐溫-80和無水乙醇組成的混合物2. 10% 25. 42%，及水58. 00% 89. 00%。本發明所要解決的技術問題之五是提供了制備所述的抗乳球蛋白過敏的微乳制劑的方法，其特征在于是由以下方法制備得到的將質量比為2 8的吐溫-80和無水乙醇組成的混合物2. 10% 25. 42%分散于58. 00% 89. 00%水中成水相，質量比為7 3的正丁酸乙酯和維生素E的混合物1.07% 13. 59%為油相，所述的完整肽聚糖3. 00%加入油相中，兩相分別預熱至70°C，將油相和水相混合后經高速剪切乳化機在 BOOOrpm下剪切5min制得粗乳，加入5倍體積的生理鹽水稀釋6倍，再采用高壓均質機在 70MPa的壓力下均質6次，調節pH至6. 5 6. 8，流通蒸汽滅菌15min，即得微乳制劑。本發明所要解決的技術問題之六是提供了所述的微乳制劑在制備抗乳球蛋白過敏免疫增強劑中的應用。本研究基于乳酸菌與抑制食物過敏的發生、發展之間的緊密聯系，通過建立BLG致敏動物模型，研究給予肽聚糖微乳對致敏模型動物過敏反應的干預作用，說明了由完整肽聚糖制成的肽聚糖微乳制劑經口服到達體內后，能有效刺激淋巴細胞分泌IL-12和 IFN- γ，降低IL-4水平，逆轉Th2細胞過度亢進，在抑制IgE介導的β -乳球蛋白過敏炎癥中發揮了重要作用。在開發具有抗過敏性能的免疫增強劑等方面具有潛在應用價值，同時也為為乳酸菌及其菌體成分防治食物過敏提供實驗依據。與現有技術相比，本發明的優點在于制備的乳桿菌完整肽聚糖微乳組合物，遇體液可自發形成納米級粒徑的微乳，可明顯提高藥物的溶解度，增加藥物穩定性、提高藥物的生物利用度；乳桿菌完整肽聚糖制備方法簡單、性質穩定；制備得到的完整肽聚糖采用微乳作為藥物載體制成口服完整肽聚糖微乳，在開發具有抗過敏性能的免疫增強劑等方面具有潛在應用價值。


圖1為約氏乳桿菌的顯微鏡鏡檢圖；圖2為約氏乳桿菌的透視電鏡圖；圖3Sekine提取肽聚糖的透視電鏡圖㈧與本發明的改良法提取肽聚糖的透視電鏡圖⑶；圖4為肽聚糖微乳對BLG致敏小鼠血清中總IgE、BLG特異性IgE和總IgG的影響。1 空白微乳組；2 致敏組；3 肽聚糖組；4 肽聚糖微乳組
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明做進一步說明，應該理解的是，這些實施例僅用于例證的目的，決不限制本發明的保護范圍。實施例1乳桿菌完整肽聚糖、完整肽聚糖微乳的制備1. 1. 1實驗菌株約氏乳桿菌KLDS1. 7032由嬰兒腸道中篩選得到，約氏乳桿菌KLDS1. 7032，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其菌種保藏編號為CGMCC 5050，保藏日期為2011年7月8日。1.1. 2實驗試劑鹽酸、濃硫酸、磷酸、氯化鈉、氫氧化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、碳酸鈉、無水乙醇(食用級)、正丁酸乙酯、甲醛、甲醇、丙酮、過氧化氫、高氯酸、抗壞血酸、乙酸、乙醚、乙酸內酮、苯酚、氯仿、葡萄糖、膽固醇、溶菌酶、Tris、乙酸鈉、苯酚、Triton X-100, SDS，胰蛋白酶、堿性蛋白酶(均為分析純，購自大連寶生物工程有限公司)。結晶紫、碘液、沙黃(均為分析純，Sigma公司)。吐溫-80、維生素E(市售，食品級)。對二甲氨基苯甲醉、氨基葡萄糖等(均為分析純，購自南京博爾迪生物科技有限公司)。去離子水，實驗室自制。1. 1.3實驗儀器
阿貝折光儀上海光學儀器廠
FA25型高剪切分散乳化機上海弗魯克流體機械制造有限公司
激光粒徑儀
美國PSS公司
6
定氮儀KDN-04B上海新嘉電子有限公司
氨基酸分析儀835-50日本HITACHI
核酸蛋白檢測儀HD-2上海滬西分析儀器
LGJ-I冷凍干燥機上海醫用分析儀器廠
UV-2401PC分光光度計日本島津林式會社
離子色譜DIONEX 1(^2500
倒相型系統光學顯微鏡奧林巴斯光學エ業林式會社
透射電鏡日本日立H-7650
核酸/蛋白質分析儀DU-800Beckman Coulter
光學顯微鏡(OLYMPUS )奧林巴斯光學エ業林式公社
酸度計梅特勒-托利多儀器有限公司
高壓均質機Niro Soavi-NS 1001L
恒溫磁力撹拌器常州國華電器有限公司
電導率儀梅特勒-托利多儀器有限公司1. 2實驗方法1. 2. 1乳桿菌完整肽聚糖的提取(1)菌體的清洗與收集將約氏乳桿菌菌種活化傳代后，按3%接種于IOOOmLMRS 液體培養基中，37°C靜止培養18h ；培養完畢后迅速降溫至4°C。在5000g、4°C離心20min， 收集菌體沉淀；4°C蒸餾水反復洗滌至菌體白色，收集菌體，置于100°C沸水水浴箱中滅活 30min，得到熱致死菌泥；(2)去磷壁酸將步驟(1)所述的熱致死菌泥懸浮于200mL預熱的質量分數為 10%三氯乙酸溶液中，沸水浴20min以裂解菌體；冷卻后，5000g、4°C離心15min，收集沉 淀；(3)脫脂用濃度為0. 05mol/L乙酸調節濃度為0. 02mol/L乙酸鈉溶液pH值至 4. 6，將上述溶液混合后再與氯仿、甲醇，三者按體積比4 5 10混合。用混合液溶解步 驟⑵得到的沉淀，體積比為15 1。室溫攪拌18h，8000g、4°C離心20min，收集沉淀。(4)去蛋白上述步驟C3)得到的沉淀中加入15倍沉淀體積的胰蛋白酶和堿性蛋 白酶磷酸緩沖液(3mg/mL胰蛋白酶和:3mg/mL堿性蛋白酶；0. lmol/L磷酸緩沖液；pH 8. 0)， 37°C水浴振蕩12h，以5000g、4°C離心5min，沉淀用去離子水洗2次。(5)提純步驟(3)得到的沉淀經0. Olmol じ1硫酸溶液IOmL 95°C處理5min。冰 水浴中立即冷卻，12000g、4°C離心30min后棄上清，沉淀用去離子水在4°C條件下連續透析 7d，冷凍干燥后置4°C保存備用。1. 2. 2肽聚糖提取物的化學鑒定(1)乳桿菌完整肽聚糖形態學檢查采用顯微鏡(東北農業大學乳品科學教育部重點實驗室)和透射電鏡(東北農業大學生命中心)觀察。(2)乳桿菌完整肽聚糖化學組分分析i Morgan-Elson比色法測定氨基己糖取一定量的完整肽聚糖樣品用經6mol/L 鹽酸105°C水解lOhrs，用2mol/L碳酸鈉中和至pH7.0。取IOmL帶塞刻度試管，加入樣液 2mL,加入ImL乙酞丙酮試劑，搖勻，沸水浴30min，取出冰水冷卻，加入2mL無水乙醇、ImL對二甲氨基苯甲醛試劑，搖勻，用無水乙醇補至10mL，于60°C水浴保溫1小時，冷卻，在30min 內530nm下測定吸光值。同法以100 μ g/mL氨基葡萄糖為標準溶液繪制標準曲線，根據標準曲線和樣品濃度計算一含量。 蛋微量凱氏定氮法測定蛋白質采用國標GB/T5009. 5-850測定蛋白質含量。iii中性糖的測定精密稱取105°C干燥至恒重的葡萄糖10mg，置IOOmL容量瓶中，用蒸餾水溶解混勻，定容成lOOmg/mL的標準溶液。分別取此標準溶液0. lmL、0. 2mL、 0. 3mL、0. 4mL、0. 5mL、0. 6mL、0. 7mL至IOmL帶塞試管中，加入蒸餾水補足體積至ImL作為標準管，取蒸餾水ImL作為空白對照管，取檢測樣品ImL作為檢測管，分別向各管加入1. 4mL 5%苯酚搖勻，濃硫酸5mL搖勻，置100°C水浴25min，在490nm處檢測各管吸光度值，計算和繪制標準曲線并按以下公式推算出樣品中的糖含量多糖含量(％) =CXDXV/WX100其中C為樣品中葡萄糖濃度(yg/mL)，D為樣品的稀釋倍數，V為樣品體積(mL)， W為樣品重量(mg)iv總脂肪的測定繪制標準曲線將膽固醇標準液與乙醇搖勻后，分別取0. 2mL，加入濃硫酸混勻后 100°C水浴IOmin使脂類水解，冷卻至室溫后加入顯色劑，室溫靜置20min，于525nm處測定光吸收，取兩管平均值，以標準膽固醇含量為橫坐標，光吸收值為縱坐標，繪制標準曲線。總脂測定程序同上，測得光吸收值，從標準曲線上查得總脂含量。ν氨基酸的測定測定方法采用國家標準GB/T14965-1994。取一定量的肽聚糖提取物，用6mol/L鹽酸110°C真空水解20hrs，用日立835-50型氨基酸分析儀分別測定氨基酸組成。vi微量磷法測核酸根據核酸為含磷的有機化合物，其含磷量為9. 5%，因此，可以通過有機磷總磷一無機磷的含量來計算出核酸的含量。(3)溶菌酶溶解試驗稱取肽聚糖提取物，以pH6. 2的磷酸鹽緩沖液配成lmg/mL溶液，加蛋清溶菌酶 200 μ g/mL,可見光分光光度計測A450后，37°C，120r/min震蕩處理，分別于不同時間測A45(1。(4)提取乳桿菌完整肽聚糖得率的計算本試驗用用三批生產菌粉提取肽聚糖，計算出kkine法和改良法提取約氏乳桿菌肽聚糖的得率。1. 2. 3肽聚糖微乳制備及其類型的鑒別方法本實驗通過偽三元相圖法研究肽聚糖微乳的形成條件，并對所制備肽聚糖微乳的粒徑大小、分布范圍、初步理化性質、微乳形態及體系類型等進行研究。(1)肽聚糖微乳的制備稱取吐溫-802. 348g，無水乙醇9. 392g，分散于79g水中成水相，稱取4. 382g正丁酸乙酯，維生素E 1.878g混合成溶液做為油相，實施例1. 2. 1節制備得到的完整肽聚糖3g加入油相中，兩相分別預熱至70°C，將油相和水相混合后經高速剪切乳化機在6000rpm下剪切5min制得IOOg粗乳，加入5倍體積的生理鹽水稀釋6倍，再采用高壓均質機在70MPa的壓力下均質6次，調節pH至6. 5 6. 8，流通蒸汽滅菌15min， 即得微乳制劑。(2)微乳的鑒別方法性狀透明或略帶乳光的溶液，偏光顯微鏡下無雙折射現象。離心法采用lOOOOr/min離心15min，觀察其是否分層及是否維持澄明，如仍維持澄明可判為微乳。染色法利用油溶性染料蘇丹紅和水溶性染料亞甲蘭在微乳中紅色或藍色的擴散快慢來判斷微乳的類型，若紅色擴散快速于藍色則為W/0型微乳；反之為0/W型。折光率按文獻規定方法恒溫20°C測定粒徑取少量靜置1周的微乳樣品，用去離子水稀釋至樣品含水量約為98%，用旋渦混合器混合均勻，再經過0. 22 μ m微孔濾膜過濾，過膜后的樣品注入納米粒度分布儀的樣品池中，設定溫度為25°C和各種油相的折光率，進行粒徑測定，每個樣品平行測定3次。1. 3實驗結果1.3. 1肽聚糖外觀檢查所得乳桿菌肽聚糖為乳白色外觀呈棉絮狀分布，在水中分布均勻易發生沉降。 顯微鏡鏡檢圖如圖1所示，透視電鏡圖如圖2所示，本試驗通過對提取工藝的摸索，對比 Sekine提取肽聚糖方法，確定了最佳提取約氏乳桿菌肽聚糖的改良法，由于條件溫和，且整個純化過程中不使用任何物理與化學方法破壞細胞壁的骨架結構，因此分離得到了細胞骨架完整的肽聚糖，通過透射電鏡觀察所提取到的細胞骨架呈現袋狀結構，如圖3所示。1. 3. 2約氏乳桿菌肽聚糖的主要成分本實驗利用現行摸索的改良法提取約氏乳桿菌肽聚糖，其主要成分為蛋白質和中性糖，含量分別為和40%，其次為脂肪、氨基己糖、核酸。傳統％1^1^法提取約氏乳桿菌肽聚糖，其主要成分為蛋白質和中性糖，含量分別為58%和42%，其次為脂肪、氨基己糖、核酸。所測改良法提取約氏乳桿菌肽聚糖各項成分與傳統kkine法提取相比較，其品質沒有降低。1. 3. 3約氏乳桿菌肽聚糖的提取得率通過溶菌酶溶解試驗證實分離純化步驟所得的提取物的主要成分確系肽聚糖。通過用三批不同批次工業化生產的約氏乳桿菌菌粉提取肽聚糖，采用質量比(終WPG質量/ 起始菌粉質量)比較改良法法提取完整肽聚糖得率。結果表明改良法的得率為 18%，而傳統kkine法僅能獲得3%的提取率。1. 3. 4肽聚糖微乳制備及其類型的鑒別選擇食品級吐溫-80為表面活性劑，選擇正丁酸乙酯和維生素E的混合物為油相。 采用乙醇為助表面活性劑。由相圖考察所得結果，按比例秤取一定量的肽聚糖、表面活性劑、助表面活性劑和油相混合均勻，滴加蒸餾水，攪拌混勻即得液滴直徑在30 45nm的半透明狀乳液產品。獲得肽聚糖微乳經離心后，溶液均無分層。外觀澄黃、透明、可見乳光、具有一定流動性。本實驗結果顯示亞甲基蘭在微乳中的擴散速度明顯快于蘇丹IV，可以判定肽聚糖微乳為Ο/w型微乳。將3批配制的肽聚糖微乳于37°C烘箱中放置3個月，觀察性狀、分層、含量測定等指標表明各項指標無明顯變化，該制劑的穩定性良好。透射電鏡下呈圓球形，分布均勻，平均粒徑為(39. 6 士 3. 3) nm。實施例2 口服完整肽聚糖微乳對致敏模型動物過敏反應的干預作用將實施例1制備得到的完整肽聚糖微乳及肽聚糖用于以下實驗研究2. 1實驗材料2. 1. 1實驗動物雌性清潔級BALB/c小鼠，6 8周齡，購自哈爾濱腫瘤醫院實驗動物中心。飼養環境溫度(23 士 2) °C，濕度50 % 75 %，標準小鼠飼料喂養。2. 1.2主要試劑實施例1制備得到的肽聚糖提取物、實施例1制備得到的肽聚糖微乳、IL-12、 IFN- y、IL-4ELISA試劑盒(美國R&D公司)、總IgE試劑盒(美國bethyl公司)、羊抗鼠IgE酶標二抗(英國AbD Serotec公司)、羊抗鼠IgG酶標二抗(中國中杉金橋公司)、 RPMI1640培養液(美國GIBCO公司)、胎牛血清(杭州四季青生物工程材料公司)、淋巴細胞分離液(Salarbio公司)、牛乳β -乳球蛋白標品和弗氏完全佐劑(Sigma公司)等。2. 1.3儀器設備
HF90型CO2培養箱 Model 680型酶標儀 EL104/00型電子天平 2~1 OOOpL可調定量移液器 96孔培養板 AE-30倒置生物顯微鏡 VD-1320型潔凈工作臺
LD4-2型低速離心機2. 2實驗方法2. 2. 1灌服用的完整肽聚糖及其微乳的制備灌服用的完整肽聚糖的制備稱取實施例1中1. 2. 1制備得到的完整肽聚糖4g， 加入20g無菌生理鹽水(含0.9% (W/V)的氯化鈉水溶液)溶解，即稀釋6倍使用，制得混懸液。灌服用的完整肽聚糖微乳的制備取實施例1中1. 2. 3的制備得到的完整肽聚糖微乳灌服使用。灌服用空白微乳的制備稱取吐溫-802. 348g，無水乙醇9. 392g，分散于82g水中成水相，稱取4. 382g正丁酸乙酯，維生素E 1. 878g混合成溶液做為油相，兩相分別預熱至 70°C，將油相和水相混合后經高速剪切乳化機在6000rpm下剪切5min制得粗乳100g，加入 5倍體積的生理鹽水稀釋6倍，再采用高壓均質機在70MPa的壓力下均質6次，調節pH至
香港力康公司美國 Beckman 梅特勒公司德國Eppendorf公司美國 Corning Incorporated costar 公司麥克奧迪實業集團有限公司北京東聯哈爾儀器制造有限公司北京醫用離心機廠6. 5 6. 8，流通蒸汽滅菌15min,即得空白微乳制劑。2. 2. 2動物模型建立小鼠購進后適應性喂養4天，隨機分組(每組8只)，即空白組、致敏組、肽聚糖組以及肽聚糖微乳組。自第1天起，肽聚糖組以及肽聚糖微乳組小鼠分別灌服完整肽聚糖及其微乳0. ImL/只，每周3次，共4周，空白組同時以等量空白微乳灌服。致敏組、肽聚糖組以及肽聚糖微乳組小鼠在第7、21、觀天給予腹腔注射0. ImL 0. 5mg/mL的過敏原(ImL弗氏佐劑+ImL lmg/mL BLG)，空白組小鼠腹腔注射等量生理鹽水。于實驗的第30天，即末次腹腔注射4 后檢測指標。2. 2. 3ELISA法檢測細胞因子無菌取各組小鼠脾臟，用玻璃針芯在200目篩網上研磨后，加入到RPMI1640培養液中制成單細胞懸液。加入淋巴細胞分離液進行離心，分離出淋巴細胞，再用RPMI1640培養液洗滌GOOOr/min) 2次。調細胞密度為2 X 106個/mL。將細胞與含有100mL/L小牛血清的RPMI1640培養基及BLG (終濃度lg/L)加入到96孔培養板中，每孔總體積200 μ L，每組設3個重復(n =幻。在37°C，50mL/LC02培養箱飽和濕度條件下培養4 后，離心收集上清。嚴格按照各ELISA試劑盒說明書進行操作，在波長450nm處用酶標儀測定各孔的吸光度(A)值，從相應的標準曲線查得各樣品的IL-12、IFN-y、IL-4濃度。2. 2. 4ELISA法檢測抗體水平各組小鼠摘除眼球放血，離心后吸取血清，嚴格按照各抗體試劑盒說明書檢測小鼠血清中總IgE, BLG特異性IgE和總IgG濃度。2. 3實驗結果2. 3. 1完整肽聚糖微乳對致敏小鼠Thl/Th2細胞平衡的影響由于Thl、Th2細胞的比例同IFN- γ和IL_4的分泌水平密切相關，益生菌肽聚糖通過糾正Thl/Th2細胞失衡來緩解過敏所致的炎癥反應，故本實驗以IFN- y /IL-4比值為代表研究乳酸菌肽聚糖微乳對淋巴細胞Thl/Th2平衡的影響。如表1所示，與致敏組相比， 肽聚糖微乳組小鼠的IL-4質量濃度顯著下降(P < 0.05)，而IFN-Y分泌值明顯增高(P < 0. 05)，其IFN- y /IL-4比值顯著高于空白微乳組和致敏組(P < 0. 05)。表1肽聚糖微乳對BLG致敏小鼠Thl/Th2細胞分泌的影響pg/mL，n = 3)
權利要求
1.乳桿菌完整肽聚糖在制備抗乳球蛋白過敏免疫增強劑中的應用。
2.如權利要求1所述的應用，其特征在于是將所述的乳桿菌完整肽聚糖應用于制備抗 IgE介導的乳球蛋白過敏的免疫增強劑中。
3.如權利要求2所述的應用，其特征在于所述的完整肽聚糖是從約氏乳桿菌 KLDS1. 7032中提取的，所述的約氏乳桿菌KLDS1. 7032，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其菌種保藏編號為=CGMCC 5050。
4.一種制備權利要求3所述的完整肽聚糖的方法，其特征在于包括以下步驟(1)菌體的清洗與收集將約氏乳桿菌KLDS1.7032菌種活化傳代后，接種于MRS液體培養基中，37°C靜止培養18h，培養完畢后迅速降溫至4°C ；在5000g、4°C離心20min，收集菌體沉淀；4°C蒸餾水反復洗滌至菌體白色，收集菌體，置于100°C沸水水浴箱中滅活30min， 得到熱致死菌泥；所述的約氏乳桿菌KLDS1. 7032，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其菌種保藏編號為=CGMCC 5050 ；(2)去磷壁酸將步驟(1)所述的熱致死菌泥懸浮于預熱的質量分數為10%三氯乙酸溶液中，沸水浴20min以裂解菌體；冷卻后，5000g、4°C離心15min，收集沉淀；(3)脫脂濃度為0.02mol/L, pH值為4. 6的乙酸鈉溶液，與氯仿、甲醇，三者按體積比 4:5: 10混合；用混合液溶解步驟( 得到的沉淀，所述混合液的體積與沉淀體積比為 15 1 ；室溫攪拌18h，8000g、4°C離心20min，收集沉淀；(4)去蛋白上述步驟(3)得到的沉淀中加入15倍沉淀體積的含有:3mg/mL胰蛋白酶和:3mg/mL堿性蛋白酶的pH 8. 0的0. lmol/L磷酸緩沖液，37°C水浴振蕩12h，以5000g、4°C 離心5min，沉淀用去離子水洗2次；(5)提純步驟(4)得到的沉淀經0.Olmol -L"1硫酸溶液85 95°C處理5min，冰水浴中立即冷卻，12000g、4°C離心30min后棄上清，沉淀用去離子水在4°C條件下連續透析7天， 冷凍干燥后置4°C保存備用。
5.按照權利要求4所述的制備方法制備得到的乳桿菌完整肽聚糖。
6.一種抗乳球蛋白過敏的微乳制劑，其特征在于包括有效劑量的權利要求3或5 所述的完整肽聚糖作為活性成分、還包括油相、表面活性劑、助表面活性劑和水。
7.如權利要求6所述的微乳制劑，其特征在于所述的表面活性劑為吐溫-80，所述的助表面活性劑為無水乙醇，所述的油相為正丁酸乙酯和維生素E的混合物。
8.如權利要求7所述的微乳制劑，其特征在于微乳制劑包括以下重量分數的各物質 權利要求3或5所述的完整肽聚糖3. 00%，質量比為7 3的正丁酸乙酯和維生素E組成的混合物1. 07% 13. 59%，質量比為2 8的吐溫-80和無水乙醇組成的混合物2. 10% 25. 42%及水 58. 00% 89. OOV0o
9.如權利要求8所述的微乳制劑，其特征在于是由以下方法制備得到的將質量比為 2 8的吐溫-80和無水乙醇組成的混合物2. 10% 25. 42%分散于58. 00% 89. 00%水中成水相，質量比為7 3的正丁酸乙酯和維生素E的混合物1.07% 13. 59%為油相，權利要求3或5所述的完整肽聚糖3. 00%加入油相中，兩相分別預熱至70°C，將油相和水相混合后經高速剪切乳化機在6000rpm下剪切5min制得粗乳，加入5倍體積的生理鹽水稀釋 6倍，再采用高壓均質機在70MPa的壓力下均質6次，調節pH至6. 5 6. 8，流通蒸汽滅菌15min，即得微乳制劑。
10.權利要求6-9任一項所述的微乳制劑在制備抗乳球蛋白過敏免疫增強劑中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種具抗β-乳球蛋白過敏效果的乳桿菌完整肽聚糖的制備方法、產品及其應用。本發明還涉及由本發明所得到的乳桿菌完整肽聚糖制備成的微乳制劑，其中乳桿菌完整肽聚糖作為主要功效成分，將完整肽聚糖、油相、表面活性劑、助表面活性劑、水在70℃邊加熱邊攪拌使完整肽聚糖完全溶解，混勻即得液滴直徑在30～45nm的半透明狀乳液產品。本發明的乳桿菌完整肽聚糖微乳制劑經口服到達體內后，能有效刺激淋巴細胞分泌IL-12和IFN-γ，降低IL-4水平，逆轉Th2細胞過度亢進，在抑制IgE介導的β-乳球蛋白過敏炎癥中發揮了重要作用。在開發具有抗過敏性能的免疫增強劑等方面具有潛在應用價值。
文檔編號A61P37/04GK102335413SQ201110236429
公開日2012年2月1日 申請日期2011年8月16日 優先權日2011年8月16日
發明者孟祥晨, 李艾黎, 杜鵬, 馬冬雪 申請人:東北農業大學