專利名稱：胰島素a鏈hla-a*0201限制性ctl表位改造肽配體及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物醫藥領域，涉及一種抗原表位改造肽配體(altered peptide ligand, APL)，特別涉及胰島素A鏈(n^nsA)的HLA_A*0201限制性CTL表位APL。
背景技術：
I型糖尿病(Type 1 diabetes，TlD)是T淋巴細胞介導的以清除生成胰島素的β 細胞為特點的一類自身免疫性疾病，多發于兒童及青少年。同時，由于高血糖可能進一步引發眼、血液、心血管和神經系統疾病，預防和控制胰腺組織破壞等病理性自身免疫反應癥狀也非常重要。目前，TlD主要以外源胰島素替代為主要治療手段，費用高昂且副作用大，因此，急需尋找一種能夠有效下調自身免疫狀態的干預性治療策略。近年來，對于TlD的免疫治療策略主要包括以下幾類化學藥物(如環孢素Α、雷帕霉素、細胞因子或細胞因子受體)治療；抗體(如CD3單抗、CD20單抗、抗淋巴細胞球蛋白抗體)介導的治療；小分子蛋白抑制劑(如酪氨酸激酶抑制劑)治療；抗原特異性耐受策略(如天然肽誘導耐受、APL誘導耐受、抗原肽偶聯ECDI固定的抗原遞呈細胞誘導耐受、負載抗原肽的納米微粒誘導耐受)。其中，化學藥物及抗體等介導的廣泛非特異性免疫耐受雖然在一些動物及臨床試驗中取得了較好的結果，但同時也帶來了更大的致病風險。動物實驗證實給予非肥胖性糖尿病(NOD)小鼠口服或接種自身抗原，可減緩甚至完全阻斷TlD的發生、發展，其免疫耐受重建的機制主要包括克隆缺失、克隆無能、主動抑制及旁觀者抑制等。相對于結構復雜的大分子天然抗原，小分子表位肽具有更易誘導免疫耐受、相對安全、易于實現規模制備和純化等優點，最重要的是可以通過一些氨基酸位點的化學修飾最大限度地增強其免疫調節的能力。近年來，在NOD小鼠模型研究中有愈來愈多的證據表明自身反應性CD8+ T細胞(即細胞毒T淋巴細胞，CTL)在糖尿病致病機制中具有十分重要的作用。單獨將從發生TlD的 NOD小鼠胰島中新鮮分離出的CD4+ T細胞過繼性轉移給NOD scid小鼠，并不能誘導TlD的發生；但單獨輸注發生TlD的NOD小鼠胰島浸潤⑶8+ T細胞，卻能在剔除⑶4+ T細胞的NOD 或NOD scid小鼠中很快誘發T1D，而剔除⑶8+ T細胞或敲除⑶8 α的NOD小鼠同樣表現為 TlD抵抗。此外，研究報道，TlD的發生與HLA-A*0201分子密切相關。因此，近年來陸續鑒定了系列人和小鼠TlD自身抗原HLA-A*0201限制性CTL表位，其中部分存在較高的人、鼠交叉反應性。利用這些CTL表位肽在NOD小鼠體內有效地誘導特異性CTL免疫耐受，對TlD 具有一定的防治作用。在HLA-A*0201 轉基因 NOD 小鼠[NOD. 129P2 (B6) ~β 2mtmlUnclg (HLA-A/H2-D/2M)]中， TlD的發病時間較普通NOD小鼠提前，且程度加重，是良好的人源化NOD小鼠。在人源化NOD 小鼠中，mInsA2_10已被證實為HLA_A*0201限制性優勢CTL表位，且與人源抗原序列具有同源性。因此，通過改造HiInsA2,來獲得對自身反應性CTL具有負調節效應的APL，對TlD的防治研究具有重要意義。

發明內容
有鑒于此，本發明的目的之一在于對人源化NOD小鼠的HLA_A*0201限制性優勢 CTL 表位 n^nsA2_1(l (氨基酸序列為 Ile-Val-Asp-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile)進行改造，從而獲得對自身反應性CTL具有負調節效應的APL ；目的之二在于提供所述APL在制藥領域中的應用。為達到上述目的，本發明提供如下技術方案
1. mlnsA 的 HLA_A*0201 限制性 CTL 表位 APL，氨基酸序列如 Ile-Val-Asp-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile所示，其中第6位Cys為D型氨基酸。也就是說，該APL是將mInsA2_1(1中的第6位氨基酸Z-Cys替換為々-Cys而得。2.所述mlnsA的HLA_A*0201限制性CTL表位APL在制備TlD治療性負調肽疫苗中的應用。本發明的有益效果在于本發明公開的人源化NOD小鼠的HLA-A*0201限制性天然 CTL表位HiInsA2,與人類表位之間存在高度的交叉反應性，而本發明的APL在人源化NOD小鼠體外細胞免疫功能實驗中具有顯著抑制天然表位特異性CTL應答的特性，且肽本身具有易于規模性制備和純化、使用安全等特點，因此，本發明的APL可單獨或聯合其他免疫顯性自身抗原表位肽或APL應用于TlD治療性負調肽疫苗的研制，在人類TlD治療領域具有潛在、良好的開發應用前景。


圖1為APL與HLA_A*0201分子的相對親和力檢測。圖2為ELISpot法檢測APL對胰腺特異性T淋巴細胞IFN- γ分泌能力的影響，* 表示兩組間比較有顯著性差異(P < 0. 05)。圖3為胞內因子染色法檢測APL對表位特異性CTL IFN- γ分泌能力的影響。圖4為CFSE染色法檢測APL對表位特異性CTL增殖能力的影響。
具體實施例方式為了使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將結合附圖對本發明的優選實施例進行詳細的描述。一、APL的設計與初步篩選
采用軟件hsightll對擬改造表位mInsA2_1(1與HLA_A*0201的復合物(pMHC)進行建模，得到PMHC的結構。將擬改造表位HiInsA2,進行單個或多個氨基酸位點的型氨基酸替換，得到一系列APL。分別計算mInSA2_1(1及各APL第1位與第9位Ca原子(C1-C9)的距離、各APL在分子動力學模擬過程中相對HiInsA2,初始坐標發生位置變化的均方根偏差 (RMSD )以及mInsA2_1(1及各APL與HLA_A*0201分子之間的H鍵數目。分析各APL與mInsA2_1(1 的匹配情況，初步篩選出C1-C9距離變化較小、RMSD相對較小、H鍵數目不變或增加的APL (見表1)進行進一步實驗。表1 APL的初步篩選結果
權利要求
1.胰島素A鏈HLA-A*0201限制性CTL表位改造肽配體，其特征在于，氨基酸序列如Il e-Val-Asp-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile 所示，其中第 6 位 Cys 為 D 型氨基酸。
2.權利要求1所述的胰島素A鏈HLA-A*0201限制性CTL表位改造肽配體在制備I型糖尿病治療性負調肽疫苗中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種胰島素A鏈HLA-A*0201限制性CTL表位改造肽配體(APL)，是將人源化NOD小鼠的胰島素A鏈HLA-A*0201限制性天然CTL表位mInsA2-10中的第6位氨基酸L-Cys替換為D-Cys而得，其氨基酸序列如SEQIDNo.1所示；由于該天然CTL表位與人類表位存在高度的交叉反應性，而該APL在人源化NOD小鼠體外細胞免疫功能實驗中具有顯著抑制天然表位特異性CTL應答的特性，且肽本身具有易于規模性制備和純化、使用安全等特點，因此，本發明的APL可單獨或聯合其他免疫顯性自身抗原表位或APL應用于I型糖尿病治療性負調肽疫苗的研制，在人類I型糖尿病治療領域具有潛在、良好的開發應用前景。
文檔編號A61P3/10GK102295684SQ20111025497
公開日2011年12月28日 申請日期2011年8月31日 優先權日2011年8月31日
發明者吳玉章, 牛微, 王莉, 舒馳, 陳曉玲 申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學