專利名稱：一種表達REV env的重組MDV毒株的構建和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種表達REV env的重組MDV毒株的構建和應用，屬于獸用生物制品分子生物學領域。
背景技術：
腫瘤是種雞和商品蛋雞的常發病，雖然其發病率和死亡率不高，但造成的經濟損失很大，主要原因是致腫瘤病毒對雞體所引起的免疫抑制，并進而導致對各種疫苗免疫應答的下降。近幾年來，在我國雞群中腫瘤病的發生率又有抬頭的趨勢。雞群中可引起腫瘤的病毒有三種，即馬立克氏病病毒(Marek’ s disease virus，MDV)、雞白血病病毒(Avian leucosis virus, ALV)和禽網狀內皮增生病病毒 (Reticuloendotheliosis viruses, REV)。長期以來，在雞群中只要一出現腫瘤，就懷疑甚至斷言是馬立克氏病，而忽視了其它二種病毒的致病性。ALV的A、B、C、D亞型可在蛋用雞中誘發腫瘤，而ALV的J亞群則主要在肉用型種雞中誘發腫瘤。REV則在蛋用型和肉用型雞中均可誘發腫瘤。根據臨床病理變化和流行病學特點，雖然可以區別一些典型的馬立克氏病或白血病，但近幾年來雞群中實際發生的腫瘤的表現在逐漸變化，已很難僅僅根據病變來鑒別診斷究竟哪一種病毒引發的腫瘤。特別是，在同一雞群中及同一病雞中，二種不同病毒共感染的現象非常普遍，這更給鑒別診斷帶來了難度。禽網狀內皮增生病病毒(REV)，這是另一種反轉錄病毒，可自然感染多種鳥類，在自然界分布廣泛。REV可能通過雞胚發生垂直感染，垂直感染或早期感染的雛雞，最易發生矮小綜合癥和免抑制綜合癥，同時也會誘發腫瘤。很難根據臨床病變與MDV或ALV腫瘤相區另O。目前，我國雞群中REV感染相當普遍，毫無疑問，有一定比例的腫瘤與REV感染有關。近二、三年中，即使在一些已用MDV CV1988/Rispens株液氮苗(本發明又簡稱 CV1988疫苗)免疫的雞群，仍有腫瘤發病率抬頭的趨勢。由于人們仍把它歸罪于MDV，因此許多人都推測，是否出現了特超強毒型的流行株。但迄今為止，國內外尚未能實驗證明這一點。然而，從這類雞場的腫瘤病雞，通過病毒分離，已發現有相當比例病雞存在著MDV和REV 的共感染。此外，在用REV和MDV 二種病毒同時作人工感染試驗中，也確實能誘發不同細胞類型的腫瘤結節。由于REV感染在我國雞群上已相當普遍，有分析認為，REV的共感染是造成CV1988 疫苗免疫雞群中腫瘤發病率升高的重要原因。由于在一些雞的REV感染造成免疫抑制，也引起了由CV1988疫苗誘發的保護性免疫下降，因而造成免疫雞群仍有腫瘤發生。本實驗室追蹤近5年廣州地區養殖雞群中REV的感染情況，結果表明，REV在我省雞群中的感染率從O到100%，平均約為20%。人工感染實驗表明，REV對雛雞有很強的免疫抑制作用，它既顯著抑制中樞性免疫器官胸腺和法氏囊的發育，也顯著抑制感染雞對NDV 和AIV疫苗免疫后的抗體反應，其中，對禽流感(Avian influenza virus,AIV)疫苗免疫的抑制作用更為顯著(孫淑紅，崔治中等，中國病毒學(英文版)，2006;李延鵬，崔治中等，中國獸醫學報，2008)。已有的比較實驗表明，相對于其它免疫抑制性病毒，如MDV，CAV, ARV,ALV等，REV對雞表現出的免疫抑制作用最強(柳鳳祥，崔治中等，中國農業科學，2009)。REV 單獨感染時可以表現出很強的免疫抑制作用，在與其它病毒共感染時，這種免疫抑制作用還會進一步加強，表現出的免疫抑制更為嚴重。以對AIV-H5疫苗的免疫反應為例，兩種病毒的共感染均顯著地抑制對疫苗的免疫反應。已有的研究結果對REV疫苗提出了迫切的要求，然而到目前為止，竟未出現一種 REV疫苗產品問世！由于REV是反轉錄病毒，使用活疫苗存在轉染進宿主細胞基因組的潛在風險；而REV的增殖速度又決定了目前無法通過大量培養REV以滿足滅活疫苗的生產需要。因此通過基因工程手段表達REV的免疫保護性基因，制造重組基因工程疫苗是解決這一問題的良好方法。從雞群中MDV的流行來看，已從以弱病毒株(mMDV)為主，到以強病毒株(vMDV) 為主，以至近20年來超強病毒(vvMDV)株越來越普遍，10年前還出現了特超強病毒株(vv+MDV) (Witter RL. Increased virulenced of Marek' s Disease Viurs field isolates. Avian Pathology, 1997)。科學家利用各種方法構建了各種MDV候選毒株試圖改進疫苗的效果，但都不成功。例如，Witter和Kreager等比較了 10株新的疫苗候選株的保護性免疫效果，但結果都不比CVI988/Rispens株好(Witter，R. L. and K. S. Kreager. Serotype lviruses modified by backpassage or insertional mutagenesis approaching the threshold of vaccine efficacy in Marek' s disease. Avian Dis, 2004，48 (4) 768-782.)。看來，面對MDV野毒株致病性增強的趨勢，用常規方法改進疫苗似乎已走到了盡頭。但是，根據過去40多年中MDV演變規律，其毒力很有可能會在今后幾年變得更強。近年來，在我國，即使在一些已用CV1988疫苗免疫的雞群，仍有腫瘤發生率上升的趨勢，雖然國內還沒有相關分離到特超強毒株的報道，但MDV的變異卻一直在進行著。利用基因工程手段(插入、突變或缺失)失活強毒的致病性基因使病毒致弱是構建MDV疫苗的一個重要策略。美國禽病腫瘤實驗室利用粘粒系統分別敲除了超強毒株rMD5 的 pp38、 vIL18 禾口 Meq 基因(Reddy, S. M. ，B. Lupiani, I. M. Gimeno, R. F. Silva, L. F. Lee and R. L. Witter. Rescue of a pathogenic Marek' s disease virus with overlapping cosmid DNAs :use of a pp38 mutant to validate the technology for the study of gene function. Proc Natl Acad Sci U S A, 2002,99 (10) 7054 ~ 7059. ；Cui， X.， L F. Lee, H. D. Hunt，W. M. Reed, B. Lupiani and S. M. Reddy. A Marek' s disease virus vIL-8 deletion mutant has attenuated virulence and confers protection against challenge with a very virulent plus strain. Avian Dis，2005，49 (2) :199 206.； Cui,X. ,L. F. Lee,W. M. Reed,H. J. Kung and S. M. Reddy. Marekr s disease virus-encoded vIL一Sgeneis involved in early cytolytic infection but dispensable for es tablishment of latency. J Virol, 2004, 78 (9) :4753 4760. ；Lupiani, B.，LF.Lee， X. Cui，I. Gimeno, A. Anderson，R. W. Morgan，R. F. Silva，R. L. Witter, H. J. Kung and S. M. Reddy. Marekr s disease virus-encoded Meq gene is involved in transformation of lymphocytes but is dispensable for replication. Proc Natl Acad Sci USA， 2004,101(32) :11815 11820.；)，結果顯示上述基因的敲除均能使MDV的毒力減弱或消失，利用上述基因缺失株作為候選疫苗來免疫雞，均能對雞提供一定程度的保護。其中，缺失Meq基因的毒株是最有前景的。最新的研究表明在用超強毒和特超強毒攻擊后，Meq基因缺失毒株能夠提供比CVI988更好的保護，這也是目前報道的保護效果最好MDV候選疫苗株(Lee, L. F. , B. Lupiani, R. F. Silva, H. -J. Kung and S. Μ. Reddy. Recombinant Marek' s disease virus (MDV) lacking the Meq oncogene confers protection against challenge with a very virulent plus strain of MDV. Vaccine,2008,26(15) :1887 1892. ；Lee, L. F. , K. S. Kreager, J. Arango, A. Paraguassu, B. Beckman, H. Zhang, A. Fadly, B. Lupiani and S.M.Reddy. Comparative evaluation of vaccine efficacy of recombinant Marek' s disease virus vaccine lacking Meq oncogene in commercial chickens. Vaccine,2010,28(5) :1294 1299)。本發明以本發明人2007年從廣東某種雞場分離到的MDV強毒株作為載體，將其基因組構建到細菌人工染色體(BAC)上，利用recE/T介導的同源重組技術，首先缺失其中 1個Meq基因，然后用REV env表達盒替換另一個Meq基因，從而構建成2個Meq基因缺失的，能表達REV env基因的MDV弱毒疫苗株。該重組毒株將同時滿足保護MDV和REV的雙重需要，而MDV疫苗早期免疫的特性又符合免疫抑制性病毒需要早期進行免疫的要求。重組MDV-REV疫苗的成功研制將為控制MDV、REV以及MDV-REV共感染對家禽養殖業所造成的災難帶來有力的武器。

發明內容
本發明在構建MDV⑶07細菌人工染色體(BAC)的基礎上，采用recE/T高效重組技術，通過兩次重組，最終缺失了 MDV⑶07基因組中的兩個與MDV致腫瘤相關的Meq基因， 并在其中一個Meq的位置插入了禽網狀內皮增生癥病毒(REV)囊膜蛋白env基因表達框， 使最終獲得的重組病毒既失去了 MDV原有的致瘤能力，又保留了良好的免疫原性，同時還對禽網狀內皮增生癥具有一定的免疫保護效果。是通過利用recE/T介導的突變技術敲除MDV⑶07株病毒中的1個Meq基因，并再次通過Red/ET介導技術，用REV env表達盒替代另一個Meq基因。
具體實施例方式一、馬立克氏病疫苗病毒⑶07-env株的的構建1. REV env表達框的構建。(1)通過引物擴增REV env的完整閱讀框(ORF)，并將PCR產物用HindIII酶和 XbaI酶消化后克隆進pBudCE4. 1載體質粒中，獲得重組質粒pBud-env。F(envl) :5，-CGCCAAGCTTGACAACCAAGAAGAATG-3，(序列 1，含 HindIII 位點)R(envl) :5，-CGTATCTAGACCTAGGGTATCCATCTC-3，(序列 2，含 XbaI 位點)(2) PCR擴增env基因表達框。以pBud-env為模板，設計如下引物進行PCR F (env2)5，-atggccatgtggtctctacggcgcaaatctagcaggagtgtgcaactccgGCGCGCGTT GACATTGATTA-3，(序列3大寫字母表示的堿基序列對應于env基因表達框l#_20#bp的位置)。R(env2)5， -ttataagtaggattccccgtctcctgttggcgattcccgaagatttgtcaCCCCAACTT GTTTATTGCAG-3，(序列4大寫字母表示的堿基序列對應于env基因表達框2673#_2692#bp 的位置)。
本對引物所擴增出的PCR產物既包含了用于同源重組的馬立克病毒基因組Meq 上、下游各50bp的同源臂(小寫字母表示)，又包含了 P(。mv)啟動子的全部序列，同時也包含了 SV40的早期的mRNApolyA結構。

2. Meq基因的敲除參照已發表的研究(李延鵬馬立克氏病病毒meq基因缺失株生物學特性及其免疫效果研究，博士學位論文，2010，中國農業科學院畜牧獸醫研究所)，利用卡那霉素抗性基因 (Kanr)取代一個meq基因后，挑取菌落接種于LB液體培養基中搖振培養，待其OD值達到 0. 5時，加10%的阿拉伯糖誘導lh，使宿主菌內的質粒flp重組酶被激活，從而去除Karf基因。誘導后將菌分別涂布于含有30 μ g/mL氯霉素或50 μ g/mL卡那霉素的LB瓊脂平板上 32°C過夜培養，篩選只在含有30 μ g/mL氯霉素的LB瓊脂平板上生長，但不能在含50 μ g/mL 卡那霉素的LB瓊脂平板上生長的菌，即為重組菌。該重組質粒中在被去掉的第一個Meq基因所在的位置仍保留一個flp重組酶識別的位點(flp recognition target，FRT)。3. REV env表達框替代另一個Meq基因(1)利用Red/ET同源重組將選擇標記基因rpsL-neo表達盒替換另一個Meq基因。敲除一個Meq基因并經驗證后，參照本實驗室前期的研發方法(陳瑞愛.基于BAC 平臺表達REV env基因的重組rCVI988-erw的構建及其免疫效果評價.博士學位論文， 2010，中國農業大學)，利用GeneBridge公司試劑盒(Red/ET重組系統Counter-Selection BAC Modification Kit)中的rpsL-neo質粒為PCR模板，擴增兩側帶有MDV基因組Meq基因上、下游各50bp大小同源臂的選擇標記基因rpsL-neo表達盒。引物設計如下 F(rpsL-neo)5，-atggccatgtggtctctacggcgcaaatctagcaggagtgtgcaactccgGGCCT GGTGATGATGGCGGG-3'(序列 5)。R(rpsL-neo)5， -ttataagtaggattccccgtctcctgttggcgattcccgaagatttgtcaTCAGA AGAACTCGTCAAGAA-3，(序列 6)。引物中的大寫字母是用來擴增rpsL-neo的序列，小寫字母為MDVMeq基因50bp的
同源重組臂。取回收純化后的rpsL-neo基因表達盒PCR產物1 2 μ L(約0. 1 0. 2 μ g)加入到30 μ L預先制備好的既包含了 PRedET質粒又包含MDV⑶07 (in BAC)的DH10B感受態細胞中，進行電轉化(2000ν，100Ω，25μΡ)。電擊完成后，立即加入ImL事先預熱至37°C 的LB培養液中混勻，吸入到1. 5mL滅菌的EP管中，37 °C，220r/min,振蕩活化70min (此時，在Red α /Red β蛋白的介導下發生同源重組)，取100 μ L細胞懸液涂布于含有氯霉素 (Cmr, 30 μ g/mL)、四環素(Tet，3 μ g/mL)和卡那霉素(Kan，15 μ g/mL)的三種抗生素的固體瓊脂平板上，在30°C恒溫生化培養箱中培養24h，挑選具有這三種抗性的陽性菌落，接種到同樣加入三種抗生素的5mL LB培養液中，30°C，220r/min，避光振蕩培養16h左右，取少量菌液劃線接種于含有氯霉素(Cmr，30 μ g/mL)、卡那霉素(Kan，15 μ g/mL)和鏈霉素(Str， 50 μ g/mL)三種抗生素的平板上，37°C恒溫生化培養箱中培養24h左右，用以驗證選擇標記基因rpsL-neo表達盒的表達功能是否能夠正常得發揮；同時取0. 5mL菌液按1 %的比例接種到IOOmL同時含有氯霉素(Cmr，30 μ g/mL)、卡那霉素(Kan，15 μ g/mL)和四環素(Tet， 3 μ g/mL)三種抗生素的LB培養液中，37°C，220r/min，避光振蕩培養16h左右中量提取并純化重組質粒，經過凝膠電泳初步觀察為大分子DNA的克隆然后進一步做PCR鑒定；鑒定結果表明具有氯霉素、四環素和卡那霉素抗性而不具有鏈霉素抗性，而且能特異性的擴增到 rpsL-neo基因的細菌克隆即為重組克隆。 (2)利用Red/ET同源重組將env基因表達盒替換掉rpsL-neo表達盒。將鑒定正確的包含rpsL-neo基因的重組陽性克隆劃線接種到含有氯霉素(Cmr， SOyg/mL)、四環素(Tetdyg/mL)和卡那霉素(Kan，15 μ g/mL)三種抗生素的LB固體瓊脂平板上，30°C恒溫培養箱中培養24h左右，挑取陽性單個菌落，將其制備成電轉化感受態細胞。取1 2yL env基因表達盒PCR回收產物加入到50 μ L上述新鮮制備的電轉化感受態細胞中，混合均勻后，置于冰浴上預冷3 5min，然后轉入到冰浴預冷的0. 2cm電轉杯中，電轉參數設置為200(^，100 0，25 4 1mm。電擊完成后立即加入ImL事先預熱至37°C 不含抗生素的LB培養液，混勻后立即轉入到新的1. 5mL滅菌的EP管中，37°C，220r/min振蕩培養70min左右，10000r/min,離心2min，棄去上清，用100 μ L不含抗生素的LB培養液重新懸浮菌體，涂布于含有氯霉素(Cmr，30yg/mL)和鏈霉素(Str，50 μ g/mL)兩種抗生素的固體瓊脂平板上，37°C恒溫生化培養箱中培養24h左右，待單個菌落長到合適大小時，同一單菌落用兩只細小的槍頭各挑取一定量菌體，分別接種到含有氯霉素(Cmr，30y μ g/mL) 與鏈霉素(Str，50 μ g/mL)的兩種抗生素的LB培養液和含有氯霉素Cmr，30 μ g/mL)與卡那霉素(Kan，15yg/mL)兩種抗生素的LB培養液中，驗證選擇標記基因rpsL-neo是否被替換掉，具有氯霉素與鏈霉素兩種抗性，但不具備卡那霉素抗性的細菌單克隆為所需克隆，該克隆被命名為⑶07-env。4.重組病毒的拯救根據QIAGEN plasmid Maxi kit試劑盒(QIAGEN公司)的操作說明書，進行重組質粒⑶07-env的大量提取。按照轉染試劑LipfectamineTM2000 (Invitrogen公司)的說明書，取QIAGEN plasmid Maxi kit試劑盒提取的經鑒定正確的重組質粒⑶07_env DNA Iyg 于 100μ LDMEM(Gibco 公司)中，取 IOyL Iipfectamine 于 100 μ L DMDM 中，將兩者混勻，室溫放置20min后，將混合物用DMDM補充至lmL，加入到細胞平鋪至90 %的6孔板中，37°C， 5% CO2培養箱中培養6h后，將6孔板中的液體換為含5%犢牛血清的DMEM培養基，繼續培養幾天，待病毒蝕斑形成后，將細胞消化，傳至已長成單層的原代CEF，如此連續傳3 4代以擴大病毒量，待擴增到一定量時，用0. 25%胰酶(含0.01%的EDTA)將細胞消化，離心收集細胞，用凍存液(DMS0 小牛血清DMEM為1:3:6)重懸細胞后將其凍存于液氮中保存。該命名為 Marek’ s disease virus GD07/Δ 2Meq_env,簡稱 Marek’ s disease virus ⑶07-env，或MDV⑶07_env)。該病毒株已于2011年08月29日保藏在北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所內中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No. 5169。二、馬立克氏病病毒⑶07-env株的鑒別特性該病毒基因組上帶有三個位于特定位點的特定序列可作為本病毒的鑒別性標志(1)在Meq基因缺失的位點留下一個34bp的FRT序列(5 ‘ -GAAGTACCTATTCTTTCTAGAGAATAGGAACTTC-3 ‘)(序列 7)；(2)在Meq基因被REV-env替代的位點，有env基因表達框，可用如下引物鑒定
F(env) 5' -GCGCGCGTTGACATTGATTA-3‘(序列 8)R(env) 5' -CCCCAACTTGTTTATTGCAG-3‘(序列 9)。本對引物所擴增出的PCR產物包含了 P(。mv)啟動子，env 0RF,以及polyA結構。PCR 產物序列大小為2692bp。三.MDV⑶07-env株病毒對雞的致病性和保護性免疫作用為了研究重組MDV⑶07-env在實驗室條件下對馬立克氏病病毒強毒京-1和網狀內皮組織增殖癥病毒的的免疫保護效果，將1日齡SPF雞210只隨機分為7組，每組30只， 分別飼養于7個帶有正壓過濾空氣的SPF動物飼養隔離罩內。1日齡時第1組雞以2000PFU/ 只的劑量腹腔接種⑶07-env，第2組雞以2000PFU/只的劑量腹腔接種CVI988/Rispens疫苗株，第3組為馬立克病毒強毒京-1攻毒對照組，第4組雞以2000PFU/只的劑量腹腔接種 ⑶07-env，第5組為網狀內皮組織增殖癥病毒攻毒對照組，第6組以2000PFU/只的劑量腹腔接種⑶07-env用來檢測REV抗體。第7組為空白對照組。免疫接種7天后，第1、2、3組分別以500PFU/只的劑量攻擊MDV京-1株。免疫接種30天后，第4、5組用REV病毒SNV 株(山東農業大學崔治中教授饋贈)以105TCID50/只的劑量進行攻毒，以后每隔IOd無菌采血，以雞胚成纖維細胞進行血液病毒分離試驗并采用間接免疫熒光試驗進行檢測，用來確定血液中REV病毒是否存在。通過ELISA標準試劑盒(IDEXX公司)檢測血清中抗REV 抗體的變化。攻毒后每周觀察雞的生長態勢。整個實驗期間，⑶07-env免疫組、CVI988/Rispens免疫組以及京_1攻毒對照組雞只死亡后都進行解剖、觀察病變，記錄死亡率以及由MD引起的病變情況。MD病變百分數由病變雞除以存活雞與死亡雞的總和乘以100得來。疫苗免疫效力由保護指數(PI)來確定，PI計算方法為攻毒對照組產生MD病變百分數減去免疫組雞產生MD病變百分數再除以攻毒對照組雞產生MD病變百分數乘以100，為了增加結果的客觀性，實驗重復一次。與空白對照組相比，攻毒對照組感染京-1后雞群個體小且大小不均，生長發育狀況差，羽毛粗亂、無光澤，共濟失調，一肢或雙肢的不對稱性、進行性不全麻痹。⑶07-env與 CVI988/Rispens免疫組雞感染京_1后大小均一，長勢正常，其中⑶07_env組有6雞只死亡，CVI988/Rispens組有7只雞死亡。⑶07_env組雞群個體大小均勻，長勢正常。在攻毒后90天把所有存活雞處死并剖檢，進行肉眼觀察。與空白對照組相比，攻毒對照組肝臟、脾臟、心臟腫瘤明顯，CVI988/Rispens免疫雞有極個別表現輕微的MDV癥狀外(無肉眼可見明顯病變)，其余雞均正常，而MDV⑶07-env免疫后感染京-1組有3只雞表現輕微的MDV 癥狀外(無肉眼可見明顯病變)，其余雞均正常。與空白對照組相比，REV攻毒對照組羽毛發育異常，體重明顯偏低，個體矮小，剖檢發現，胸腺和法氏囊嚴重萎縮，外周神經腫大，腺胃出現慢性潰瘍性炎癥。⑶07-env免疫組雞群個體大小均勻，長勢正常。剖檢并沒有發現臟器的病變。通過觀察在SPF雞群中攻強毒京-1后產生的保護效果，比較了 MDV⑶07-env和 MDVCVI988/Rispens疫苗(簡稱CVI988)的保護率。未免疫SPF雞群表現出97%的馬立克氏病的特有的死亡和損傷現象(表1)，MDV⑶07-env免疫感染京-1組的全部雞和CVI988/ Rispens免疫后感染京-1的SPF雞群與空白對照組相比，大小均一，長勢正常。與CVI988/ Rispens免疫組表現出11%的MD輕微癥狀相比，MDV⑶07_env免疫組表現出8. 5%的MD 輕微癥狀。因此，⑶07-env和CVI988/Rispens對強毒京_1的保護指數分別為91. 5%和89%。表IMDV GD07-env與MDV CVI988疫苗對SPF雞的免疫保護比較
權利要求
1.一種表達REV env的重組MDV毒株，其特征在于(1)該重組病毒既失去了MDV原有的致瘤能力，保留了良好的免疫原性，同時能表達禽網狀內皮增生癥病毒Reticuloendotheliosis virus囊膜蛋白env基因，對禽網狀內皮增生癥具有一定的免疫保護效果；(2)該重組病毒MDV⑶07-env株已于2011年8月29日保藏在北京市朝陽區北辰西路 1號院3號中國科學院微生物研究所內中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心， 保藏號為 CGMCC No. 5169 ；(3)該病毒基因組上帶有二個位于特定位點的特定序列可作為本病毒的鑒別性標志1)在原有的二個Meq基因位點，在敲除Meq基因后，在其中一個Meq基因的位置上留下一個 34bp 的序列 FRT 該序列為5，-GAAGTACCTATTCTTTCTAGAGAATAGGAACTTC-3，；2)在另一個Meq基因的位置上，含有REVenv基因表達框。
2.如權利要求1所述的一種表達REVenv的重組MDV毒株，其特征在于該重組病毒的構建是通過利用recE/T介導的突變技術敲除MDV⑶07株病毒中的1個Meq基因，并再次通過Red/ET介導技術，用REV env表達盒替代另一個Meq基因。
3.一種根據權利要求1所述的一種表達REV env的重組MDV毒株在制備用于預防雞馬立克氏病或/和雞網狀內皮增生癥的雞馬立克氏病-網狀內皮增生癥活疫苗中的用途。
4.一種預防雞馬立克氏病或/和雞網狀內皮增生癥的方法，其中向雞給予預防有效劑量的雞馬立克氏病_網狀內皮增生癥活疫苗，所述的疫苗包含權利要求1所述的表達REV env 的重組 MDV GD07_env 株。
全文摘要
本發明涉及一種表達REV env的重組MDV毒株的構建和應用。本發明所涉及毒株一株以雞馬立克氏病疫苗病毒(MDV)廣東分離株(GD07)為載體，重組進禽網狀內皮增生癥病毒(Reticuloendotheliosis virus，REV)囊膜蛋白基因env的構建和應用。本發明所獲得的重組病毒MDV GD07-env株用作生產毒株所制備的疫苗，免疫1日齡雛雞，能夠預防超強毒株MDV誘發的雞馬立克氏病，其保護性免疫效果優越于目前國內外市場上應用最廣泛的MDVCVI988/Rispens株疫苗；該重組病毒同時還能對REV病毒具有良好的免疫保護作用。
文檔編號A61P31/14GK102344914SQ20111026302
公開日2012年2月8日 申請日期2011年9月7日 優先權日2011年9月7日
發明者陳瑞愛 申請人:廣東大華農動物保健品股份有限公司, 肇慶大華農生物藥品有限公司