專利名稱：結合Grb7蛋白SH2結構域的非磷酸化配體及其制藥用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及結合Grb7蛋白的SH2結構域的非磷酸化配體及其制藥用途。
背景技術：
Grb7蛋白家族最初是由篩選編碼磷酸化酪氨酸受體配體的cDNA表達文庫而發現的(I，2)，作為接頭蛋白，該家族成員通過SH2結構域募集下游信號分子并參與多種信號通路傳導途徑。該家族蛋白一共有3個成員Grb7、GrblO和Grbl4，其中，Grb7蛋白主要參與細胞的遷移和血管化過程，GrblO蛋白在細胞代謝調節和發育過程中發揮重要作用，而 Grbl4則主要參與調節細胞代謝和細胞增殖過程(3) 蛋白家族的結構上一共有3個主要的功能區域，N末端為富含脯氨酸的序列(2)，其PS/AIPNPFPEL結構域可以結合某些蛋白中的SH3結構域(4)，中間的功能區域稱為GM區，該區包括3個功能性的結構域，分別為PH 結構域、RA結構域和BPS結構域(Between PH and SH2),該結構域和線蟲Caenorhabditis 的Mig-1O蛋白有著很高的序列同源性(5，6)，C末端為一 SH2結構域。
SH2結構域作為接頭蛋白、激酶、細胞骨架等結構，在細胞信號傳導中發揮重要作用(7)。由于SH2結構域的發現，人們開始由結構域之間的相互作用來研究蛋白-蛋白間的相互作用及細胞的信號通路(8)。SH2結構域由約100個氨基酸殘基構成，其二級結構包括一個反平行的β折疊和兩個α螺旋(9)，SH2結構域中有一個陽性的結合口袋(10)，通過這個結構，SH2結構域可以直接識別并結合磷酸化酪氨酸模序(11)。不同的SH2結構域在結合各自的磷酸化配體時，有各自不同的偏好(12)。近年來的研究顯示，SH2結構域的結合特性遠超過目前用計算機軟件所預測的結果，因此，在研究SH2結構域的生物活性時，應采取個性化的措施，且應把發生相互作用的SH2/磷酸化配體對的空間構象考慮在內(13)。
盡管SH2結構域主要識別磷酸化配體，不過SH2結構域并非只是識別磷酸化配體， 且SH2結構域與磷酸化配體間的結合也并非很牢固(10)。目前已有許多關于SH2結構域識別非磷酸化酪氨酸模序的報道。非磷酸化配體結合SH2結構域的親和力，大約是磷酸化配體與SH2結構域間親和力的1/104 IO5 (35)。
Grb7蛋白家族的SH2結構域與其它典型的SH2結構域略有不同，首先，在氨基酸的排列上，Grb7蛋白家族的SH2結構域更具擴展性(14)，其次，其它的SH2結構域通常為單體結構，但GrblO Y蛋白SH2結構域和Grb7蛋白SH2結構域卻可以形成二聚體結構(15)。 同時，Grb7蛋白家族3個成員之間的SH2結構域也有所不同首先，從氨基酸序列來看， GrblO蛋白和Grbl4蛋白更為相似(I)，其序列重合性約為90%，Grb7蛋白的SH2結構域僅有60% 70%的氨基酸是和GrblO蛋白和Grb 14蛋白相似的，其次，只有Grb7蛋白SH2結構域傾向于結合具有β折疊結構的肽段，該特性和Grb2蛋白SH2結構域的結合特性相似(16)。
Grb7蛋白通過其SH2結構域廣泛參與各種信號傳導途徑，如胰島素的信號傳導途徑(17)，表皮生長因子受體ErbB2、ErbB3和ErbB4的信號傳導途徑(18)，黏著斑激酶的信號傳導途徑(19)，c-Kit/SCFR的信號傳導途徑(20)等。由于Grb7蛋白的SH2結構域與某些腫瘤的惡性擴增和轉移密切相關，如乳腺癌(21)，食管癌(22)，胰腺癌(23)，白血病(24) 等，目前，已有許多將該結構域作為靶點設計的抗腫瘤藥物，Krag等人已發現了一種可結合 Grb7蛋白SH2結構域的非磷酸化肽段-G7-18NATE，在體外試驗中，該肽段與Grb7蛋白SH2 結構域的親和力約為磷酸配體ErbB3與Grb7蛋白SH2結構域親和力的1/10 (25)，且該肽段可有效抑制Grb7蛋白和ErbB3蛋白的結合(26)、抑制胰腺癌的轉移(23)和乳腺癌細胞的增殖(27)，可作為化學藥物的研發基礎(28)。
酵母雙雜交是一種具有較高靈敏度的檢測蛋白相互作用的方法，尤其是能檢測到一些不容易被其它方法檢測到的蛋白相互作用(8)，根據一篇綜述的報道，在酵母雙雜交系統里面被檢測到的相互作用蛋白間的親和力是μΜ級別的范圍(31)。因此，酵母雙雜交技術非常靈敏，能夠檢測到常規生物化學方法檢測不到的、弱的或瞬時的蛋白質相互作用 (29，30)。這是由于細胞內陽性信號經過了多次放大(比如轉錄、翻譯、酶體系的逐級放大)。而且，雙雜交反應發生在細胞內，使蛋白能夠最大程度的保留其原始信息，這也大大增加了檢測的靈敏度和準確性。但是，傳統酵母雙雜交技術是用于篩選cDNA文庫，這會導致由于蛋白表達的豐度差異而使低豐度配體被高豐度配體掩蓋；而且一次實驗一般只篩選一種組織來源的cDNA文庫，不能得到全面的結果。而用酵母雙雜交篩選隨機多肽文庫，則可以同時解決親和力競爭、豐度抑制和組織差異表達的問題。因此從理論上來說，一次隨機多肽文庫篩選就可以相對全面地研究目的結構域的結合特性。
識別線形模體的蛋白質相互作用結構域的結合特性可利用隨機的或多樣性的多肽文庫來研究。通過篩選高度復雜的短肽文庫，能夠全面地研究目的結構域的識別特性。根據得到的識別規律搜索蛋白數據庫，可在全蛋白質組水平上預測潛在的天然配體。篩選隨機多肽文庫還能得到篩選cDNA文庫無法得到的非天然配體。這種非天然配體不僅可作為一種模擬工具用于功能研究，而且可能為藥物分子的研究提供重要依據。
由于Grb7蛋白SH2結構域參與了眾多的信號傳導途徑，和腫瘤的惡性增殖及轉移密切相關(33，34)，因此針對Grb7蛋白SH2結構域研發抗Grb7蛋白高表達的腫瘤藥物，具有重要的臨床意義。比如，最近報道了一類Grb7蛋白SH2結構域的化學拮抗劑，此類拮抗劑是基于計算機輔助的Grb7蛋白SH2結構域配體設計，通過搜索NCI的化學數據庫而得到的，且被證實可有效抑制高表達Grb7蛋白的MDA-MB-468乳腺癌細胞系的生長(28)。
同時，由于與磷酸化配體比較，非磷酸化配體因不易被體內廣泛存在的磷酸酶降解而穩定存在，同時，酵母細胞內無磷酸化修飾，適合篩選蛋白的非磷酸化配體。
美國專利號No. 7229960公開了一類非磷酸化肽段及其在體內體外試驗中可以特異結合Grb7蛋白的信號傳導的實驗結果。
因此，本發明的技術目的在于利用酵母雙雜交技術和隨機多肽文庫篩選Grb7蛋白SH2結構域的非磷酸化配體并探究所述非磷酸化配體在制藥領域中的用途。發明內容
因此，本發明的第一方面涉及一種肽段，其具有通式1:gipt/k/nx15g/wd/ip所示的序列，其中X選自氨基酸殘基P、S、T、Q、N、H、A、Y、L、E、D、F、R、K，X15整體富含P、S、T、 Q、N，且其中P占21%，T占18%，S占13%，且所述肽段是Grb7蛋白SH2結構域的非磷酸化配體，能夠結合Grb7蛋白SH2結構域。優選地，X1選自氨基酸殘基H、Y、A或Q，X2選自S、T、P、F、Q 或 D，X3 選自 S、P、T、Q 或 N，X4 選自 P、T、S 或 N，X5 選自 Q、T、P、S、D 或 A，X6 選自 Y、P、S、T 或 A，X7 選自 3、1'3、￥或札父8選自 P、L、N、Q 或 S，X9 選自 P、L、A、S、E 或 T，Xltl 選自 S、L、N、P 或 Q，X11 選自 T、P、H 或 S，X12 選自 Y、R、P、S、A、Q 或 H，X13 選自 S、P、H、N、E 或K，X14選自P、L、Q、T或N，X15選自P、T或N。優選地，所述的肽段選自
3 和 52. GIPTHSSPQYSPPSTYSPPO)P(SEQIDNo.l)
10.GIPNYTPTTPTLLLTRPLPGIP (SEQIDNo. 2
16.GIPTATTSPYENANPPHQTWDP(SEQIDNo. 3
41-A.GIPTQPTTSSEPSPPSNPPWDP(SEQIDNo. 4
41-BGIPTHHQNDTYNSPHAHPNRDP(SEQIDNo. 5
60.RNSYFTFLPARSLYLIKTHWDP(SEQIDNo. 6
67.GIPKAQNTTATPEQHASPTGIP(SEQIDNo. 7
98.GIPNQDPPAATQSPSQETTWDP(SEQIDNo. 8
106.GIPTSTPNTHSTTSHHKNPWDP(SEQIDNo. 9
本發明的第二方面涉及一種含有上述肽段的肽段，其具有通式II =BhGIPiyK/ NXuG/WD/IPZh，其中u為不大于5的數值，優選地，u為3，優選地，B1為V，B2為A，B3為V， j為不大于5的數值，優選地，j為3，優選地，Z1為G，Z2為R，Z3為V。最優選 地，所述肽段的序列為 VAVGIPTQPTTSSEPSPPSNPPWDPGRV。
本發明的第三方面涉及一種包含有效量的上述肽段的組合物，其中所述肽段為組合物的活性成分。
本發明的第四方面涉及一種編碼上述肽段的核苷酸序列。
本發明的第五方面涉及一種包含上述的編碼上述肽段的核苷酸序列的核酸構建物，其中所述核苷酸構建物能在原核或真核宿主細胞內有效表達，優選地，所述原核宿主細胞是大腸桿菌或枯草芽孢桿菌，所述真核宿主細胞是酵母菌、昆蟲細胞或哺乳動物細胞， 優選地，所述核酸構建物是原核表達載體或真核表達載體，優選地，所述原核表達載體是質粒，更優選地，所述原核表達載體是pBridge ;優選地,所述真核表達載體是pEFGF_C3或 pXflag-CMV-14。
本發明的第六方面涉及一種包含上述核酸構建物的宿主細胞，優選地，所述宿主細胞是原核宿主細胞或真核宿主細胞，更優選地，所述真核宿主細胞是哺乳動物細胞，最優選地，所述真核宿主細胞是人細胞。
本發明的第七方面涉及上述肽段、組合物、核苷酸序列、核酸構建物或宿主細胞在制備治療腫瘤的藥物中的用途，優選地，所述腫瘤為乳腺癌、食管癌、胰腺癌或白血病。
本發明的第八方面涉及一種上述的肽段、組合物、核苷酸序列、核酸構建物或宿主細胞，其分別用作治療腫瘤的藥物，優選地，所述腫瘤為乳腺癌、食管癌、胰腺癌或白血病。
本發明的第九方面涉及一種篩選上述肽段的方法，其包括如下步驟
a)構建能在酵母細胞中表達Grb7蛋白的SH2結構域的誘餌蛋白質粒；
b)將所述誘餌蛋白質粒轉化酵母菌并篩選獲得陽性克隆；
c)將隨機多肽文庫質粒轉化上述獲得的陽性克隆并確定相互作用情況；
d)酵母雙雜交二次驗證非磷酸化肽段和Grb7SH2結構域的相互作用；
e)將獲得的陽性質粒進行測序。
優選地，所述誘餌蛋白質粒為pBridge，所述酵母菌為CG1945，所述隨機多肽文庫質粒為Clonetech目錄號PT303921的產品，確定相互作用情況時利用β _半乳糖甘酶活性檢測實驗進行。
換言之，Grb7蛋白是一種接頭蛋白，該蛋白是Grb7蛋白家族的成員之一,這個家族的蛋白包括Grb7、GrblO和Grb 14。現在研究發現,Grb7蛋白在一些惡性腫瘤組織中,尤其是高轉移性腫瘤組織中處于高表達狀態，比如乳腺癌，食管癌，胃癌等。編碼Grb7蛋白的基因位于人染色體17ql2_q21，該區域在臨床檢驗中已被證實在某些腫瘤中有明顯的擴增，這一基因基礎，決定了 Grb7蛋白有可能成為臨床治療腫瘤的一個重要靶點。在Grb7蛋白中， 一共有3個主要的功能區域，N末端富含脯氨酸，中間序列和Caenorhabditis elegans的 Mig-1O有很高的相似性，該結構域在細胞遷移中發揮了重要作用。其中，C末端是一個SH2 結構域。SH2結構域在Grb7蛋白參與的細胞信號傳導通路中發揮了重要作用。雖然Grb7 SH2結構域主要是以結合磷酸化酪氨酸模序為主，但研究發現Grb7蛋白也可以結合非磷酸化肽段序列，而且由于非磷酸化肽段較磷酸化肽段更加穩定，所以研究Grb7的SH2結構域與非磷酸化肽段的結合特性更有助于研制針對Grb7蛋白高表達的腫瘤治療的藥物。在本文的研究中，發明人通過使用酵母雙雜交的方法，在隨機多肽文庫中篩選到了可結合Grb7 蛋白SH2結構域的一系列非磷酸化肽段，這些肽段的共同之處在于，每個肽段序列中均有一個含22個氨基酸的序列，其中，N末端為GIPT/N/K的保守序列，C末端為G/WD/IP的保守序列，中間為15個隨機排列的氨基酸，計算獲得的非磷酸化配體的序列可見，該片段富含脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺等中性氨基酸，很少含有空間位阻大的氨基酸殘基，突變實驗表明在22個氨基酸序列中，兩端保守的7個氨基酸對非磷酸化肽段和 Grb7SH2結構域的結合起重要作用，這種新的結合方式在體外免疫共沉淀和活細胞內的熒光能量轉移實驗都已得到證實。據我們所知，未有過結合Grb7的SH2結構域的該序列的類似報道，這是一種全新的結合Grb7的SH2結構域的非磷酸化序列。發明人將該22個氨基酸的序列歸納為公式GIPT/KX15G/WD/IP模序(X代表任意氨基酸)。
當識別磷酸化酪氨酸配體時，SH2結構域中的EF環通常識別+3位氨基酸(磷酸化酪氨酸為O位，左側為_，右 側為+)，這一特性決定了不同的SH2結構域具有不同的識別特性(32)。發明人猜想在SH2結構域識別非磷酸化配體時，EF環狀結構也起到了識別關鍵位點的作用，因組成EF環氨基酸序列的不同，造成了是Grb7蛋白SH2結構域，而不是Grb2 蛋白和Grbl4蛋白的SH2結構域，能夠結合非磷酸化的模序。
發明人在研究中發現，非磷酸化的22個氨基酸模序結合Grb7蛋白SH2結構域的親和力略高于磷酸化配體結合Grb7蛋白SH2結構域的親和力(圖4)，活細胞內的熒光能量轉移實驗也證實，非磷酸化肽段41結合Grb7蛋白SH2結構域的530/480nm比值，是ErbB3 結合Grb7蛋白SH2結構域的530/480nm比值的80% (圖3A和圖3B)，這進一步揭示了當結合Grb7蛋白SH2結構域時，發明人得到的非磷酸化的22個氨基酸模序與Grb7蛋白SH2 結構域的天然配體具有相似的親和力。有人發現，當結合SAP蛋白SH2結構域時，非磷酸化的n-Y-c肽段具有和磷酸化配體相似的親和力(36)。這一發現也證實了本發明的結論。功能試驗中，我們也發現瞬時轉染非磷酸化肽段41質粒的SK-BR-3人乳腺癌細胞的增殖速度明顯慢于對照組(圖5)，在未來的研究中，本發明發現的非磷酸化肽段可以像非磷酸化肽段G7-18NATE —樣，可以作為研發治療Grb7蛋白高表達的腫瘤藥物的基礎。


圖1 :顯示了本發明篩選出的肽段41和Grb7蛋白SH2結構域的免疫共沉淀圖譜， 其中mRLUC是空白對照，10是肽段10，41是肽段41，IOCM是陰性對照肽段10CM。A圖顯示了編碼非磷酸化肽段的質粒在真核細胞內表達時，肽段10的表達量少(原因不詳)，肽段 41，0CM及陰性對照的表達量正常。B圖顯示了免疫共沉淀實驗中檢測到非磷酸化肽段41 結合Grb7蛋白SH2結構域。
圖2 :A_E顯不的是質粒在真核細胞內的轉染效率，其中mRLUC是空白對照，10是肽段10，41是肽段41，IOCM是陰性對照肽段10CM，ErbB3是Grb7天然配體，EYFP-mRLUC是陽性對照。
圖3A :顯示的是非磷酸化肽段41和10·結合Grb7SH2結構域的親和力雖然不及 Grb7蛋白的天然配體ErbB3強，但是卻超過了陰性對照IOCM和空白對照的空載體，其中 mRLUC是空白對照，10是肽段10，41是肽段41，IOCM是陰性對照肽段10CM，ErbB3是Grb7 天然配體，EYFP-mRLUC是陽性對照，此圖為熒光強度對比圖。
圖3B :顯示的是非磷酸化肽段41和10結合Grb7SH2結構域的親和力雖然不及 Grb7蛋白的天然配體ErbB3強，但是卻超過了陰性對照IOCM和空白對照的空載體，其中 mRLUC是空白對照，10是肽段10，41是肽段41，IOCM是陰性對照肽段10CM，ErbB3是Grb7 天然配體，EYFP-mRLUC是陽性對照，此圖為相對熒光強度對比圖。
圖4:顯示的是體外實驗中，非磷酸化肽段41-A和磷酸化肽段均可以干擾非磷酸化肽段41與Grb7SH2結構域的結合，甚至非磷酸化肽段41-A的干擾效果要優于磷酸化肽段。41-A的序列為VAVGIPTQPTTSSEPSPPSNPPWDPGRV，磷酸化肽段的序列為 DEEYEpY(l 180) MNRRR,該肽段來源于 ErbB3 蛋白。
圖5 :18 24小時細胞內蛋白表達較少，G418的殺傷作用占主導，因此細胞數量逐漸減少；24 48小時細胞內蛋白表達逐漸達到高峰，細胞增殖占主導，雖然起始細胞數是相同的，但是轉染41-mRLUC質粒的細胞數一直少于轉染陰性對照mRLUC質粒的細胞數， 說明肽段41可結合Grb7蛋白SH2結構域并在一定程度上阻止了 Grb7蛋白SH2結構域參與的細胞增殖的信號轉導通路；48 60小時蛋白表達逐漸減少，G418的殺傷作用占主導， 細胞數量一直下降。
具體實施方式
下面將通過下述非限制性實施例進一步說明本發明，本領域技術人員公知，在不背離本發明精神的情況下，可以對本發明做出許多修改，這樣的修改也落入本發明的范圍。
下述實驗方法如無特別說明，均為常規方法，所使用的實驗材料如無特別說明，均可容易地從商業公司獲取。
實施例
實施例1實驗材料
1、菌株大腸桿菌菌株E. coli DH5 α ,酵母菌株CG1945 (Clontech Laboratories, Inc,目錄號 PT3247-1)。
2、質粒載體pBridge (含Gal4DNA結合結構域編碼序列，BD BiosciencesClontech,目錄號6184-1)、pGADGH(Clontech Laboratories, Inc,目錄號 PT3062-1)、 pGADT7 (含Gal4轉錄激活結構域編碼序列，Clontech Laboratories, Inc,目錄號 PT3249-5)、PEGFP-C3(含GFP標簽，用于免疫共沉淀和熒光能量轉移實驗，BDBiosciences Clontech,目錄號6082-1)、p3XFLAG_CMV_14 (含flag標簽，用于免疫共沉淀和熒光能量轉移實驗，sigma.目錄號E4901)。
3、cDNA 和核苷酸片段Grb7、Grbl4 cDNA 克隆購于 Proteintech Group, Inc.； Grb2, ABL_1質粒獲自Brandeis University, USA ;mRLUC(海參突光素酶,用于免疫共沉淀和熒光能量轉移實驗)和EYFP (用于免疫共沉淀和熒光能量轉移實驗)參考文獻(37)； ErbB3 cDNA克隆購于Sino Biological Inc. ErbB3_mRLUC融合蛋白編碼質粒由北京神州義翹生物公司合成，構建于p3Xflag-CMV-14載體的Ν0ΤΙ、ClaI之間，mRLUC構建于ΚρηΙ、 BamHI之間。
4、肽段磷酸化肽段DEEYEpY (1180) MNRRR和非磷酸化肽段VAVGIPTQPTTSSE PSPPSNPPWDPGRV均由上海強耀生物科技有限公司合成。
5、工具酶、分子量標準、DNA制備試劑盒分別購自北京天根公司、博大泰恒公司和大連寶生物。
6、隨機多肽文庫購于Clonetech (目錄號PT303921)
7、細菌、酵母培養用品、細菌和酵母轉化用品分別購自Sigma公司、MERCK公司、北京欣經科公司、博大泰恒公司、0X0ID公司、Difco、Clontech Laboratories Inc,本發明實施例中使用的其他化學試劑均可從商業公司容易地獲得。
8、細胞試驗相關試劑均由北京邁晨科技公司購得。
本發明所使用的溶液、試劑的配置方法均可從常規分子生物學操作手冊，如冷泉港出版社出版的“分子克隆”第三版等容易地獲取。
實施例2誘館蛋白(bait)構建
1、利用下述引物進行PCR從質粒中擴增SH2結構域，質粒可購于Protein Tech Group, Inc. Grb2 (目錄號BC000631)，Grb7 (目錄號BC006535)，Grbl4 (目錄號: BC053559)，ABL-1 (目錄號BC024254)。
利用下述引物從cDNA質粒中擴增SH2結構域的編碼基因，質粒來源見實施例1。
克隆引物ABLl human(inS: 5’- ccggaattcagtctggagaaacactcc-35(SEQ ID NO. 10)pBridge)A: 5 ’-cgcggatccgttacttgttgcgctttgggg-3 ’(SEQ ID NO. 11)Grb2 human(inS: 5 ’-ccggaattcgaaatgaaaccacatccg-3 ’(SEQ ID NO. 12)pBridge)A: 5 ’-cgcggatccttatcggctgctgtggcacct-3’ (SEQ ID NO. 13)Grb 7 human(inS: 5，-ccggaattcatccaccgcacccaactc-3 ’ (；SEQ ID NO. 14)pBridge)A:5’-cgcggatccttaagagggccacccgcgtgc-3’ (SEQ ID NO. 15) Grb 14 human(inS: 5 ’-ccggaattccagagctctgccacaaac-3 ’(SEQ ID NO. 16)pBridge)A: 5 ’-cgcggatccttatcacttctggcttgtcta-3 ’(SEQ ID NO. 17)
從瓊脂糖凝膠中回收DNA片段(按博大泰克試劑盒操作說明進行);
酶切目的片段及載體DNA (如EcoRI和BamHI)；
從瓊脂糖凝膠中回收DNA片段(按博大泰克試劑盒操作說明進行);
純化酶切產物(按天根試劑盒操作說明進行)；
純化的酶切產物和酶切載體用T4DNA連接酶進行連接。
四個SH2結構域基因片段以及全長基因分別由引物擴增后，經過酶切、連接到GAL 4BD下游的酶切位點之間，構建成pBridge-Grb2-SH2、pBridge-Grb7_SH2、 pBridge-Grb14-SH2 和 pBridge-ABL_l_SH2 四個誘傅蛋白質粒。
連接產物轉化DH5a化學感受態細胞。挑取陽性克隆，擴增培養后小量制備質粒 DNA，進行酶切鑒定和測序鑒定，獲得含有插入片段的重組質粒DNA。
用YH)固體培養基培養CG1945酵母菌并驗證表型后，采用醋酸鋰法轉化上述四個誘餌質粒，采用標準方法進行誘餌蛋白的β -半乳糖苷酶活性檢測(誘餌蛋白自激活)、His 滲漏情況檢測及誘餌蛋白的毒性檢測，獲得含有重組誘餌質粒的酵母單克隆。
實施例3誘餌蛋白篩選隨機多肽文庫(順序轉化法)
隨機多肽文庫的擴增，按照Clonetech的說明書進行操作。
文庫質粒的大量提取常規的質粒大量提取，按照北京博大泰恒質粒大提試劑盒說明書進行。
采用標準的PEG/LiAc法將文庫質粒DNA轉化新鮮制備的含目的基因(SH2結構域)的酵母(CG1945)克隆的酵母感受態細胞，于SD/-Trp-Leu-His+3-AT的固體培養基上 (15cm)、30°C倒置培養4-7天。挑取文庫轉化后在SD/-Trp-Leu_His固體培養基上長出的酵母菌落于3ml SD/-Trp-Leu的培養液中、30°C搖床培養過夜。利用β _半乳糖苷酶活性檢測(LacZ)實驗確定相互作用情況，一般在8小時內變藍的菌落被認 為是陽性克隆。
為了驗證結合非磷酸化肽段是否為SH2結構域蛋白的共同特性，我們挑選了 3個含SH2結構域的蛋白，即ABL_1，Grb2和Grb7蛋白。將3種蛋白的SH2結構域構建于pBridge 載體(表I)。經過第一次篩選，Grb2和Grb7的SH2結構域均篩選到陽性結果，Grb2的SH2 結構域得到I個陽性結果，Grb7的SH2結構域得到13個陽性結果(表2、表3)，經過第二次驗證，只有Grb7的SH2結構域得到9個陽性結果(表4)，且這九個結果經過3次以上獨立實驗(LacZ 二次篩選)的驗證，這9個陽性克隆的最大特性就是每個克隆里面都含有一個22個氨基酸的固有序列，即GIPT/K/NX15G/WD/IP序列(X代表任意氨基酸)，其中，肽段 41含有兩個22氨基酸固有序列，肽段60中含有的22氨基酸固有序列不具有左端的4個保守序列。根據我們的知識，這種新的Grb7SH2結構域的結合方式是一種全新的結合方式，以前從未有過類似的報道。經過蛋白序列庫的搜索，未發現有類似序列的蛋白存在。
表I不同SH2結構域的插入氨基酸序列
權利要求
1.一種肽段，其具有通式1:gipt/k/nx15g/wd/ip所示的序列，其中X選自氨基酸殘基 、3、1\0、隊!1、六、￥、1^3、0、卩、1 、1(，父15整體富含？、5、1\0、1且其中？ ^ 21%, T 占 18%,S占13%，且所述肽段是Grb7蛋白SH2結構域的非磷酸化配體，能夠結合Grb7蛋白SH2結構域。
2.根據權利要求1或2所述的肽段，其特征在于X1選自氨基酸殘基H、Y、A或Q，X2選自 S、T、P、F、Q 或 D，X3 選自 S、P、T、Q 或 N，X4 選自 P、T、S 或 N，X5 選自 Q、T、P、S、D 或 A，X6選自 Y、P、S、T 或 A，X7 選自 S、T、E、Y 或 H，X8 選自 P、L、N、Q 或 S，X9 選自 P、L、A、S、E*T，X1。選自 S、L、N、P 或 Q，Xn 選自 T、P、H 或 S，X12 選自 Y、R、P、S、A、Q 或 H，X13 選自 S、P、H、N、E 或 K，X14 選自 P、L、Q、T 或 N，X15 選自 P、T 或 N。
3.根據權利要求1或2所述的肽段，其選自 3 和 52. GIPTHSSPQYSPPSTYSPP⑶P(SEQ ID NO.1) 10.GIPNYTPTTPTLLLTRPLPGIP(SEQ ID No. 2) 16.GlPTATTSPYENANPPHQTffDP(SEQ ID No. 3) 41-A.GIPTQPTTSSEPSPPSNPPWDP(SEQ ID No. 4) 41-BGIPTHHQNDTYNSPHAHPNRDP(SEQ ID No. 5) 60.RNSYFTFLPARSLYLIKTHWDP(SEQ ID No. 6) 67.GIPKAQNTTATPEQHASPTGIP(SEQ ID No. 7) 98.GIPNQDPPAATQSPSQETTWDP(SEQ ID No. 8) 106.GIPTSTPNTHSTTSHHKNPWDP(SEQ ID No. 9)。
4.一種含有根據權利要求1至3任一項所述肽段的肽段，其具有通式II =BhGIPiyK/NXuG/WD/IPZh，其中u為不大于5的數值，優選地，u為3，優選地，B1為V，B2為A，B3為V，j為不大于5的數值，優選地，j為3，優選地，Z1為G，Z2為R，Z3為V。
5.一種包含有效量的根據權利要求1到4任一項所述的肽段的組合物，其中所述肽段為組合物的活性成分。
6.一種編碼根據權利要求1到4任一項所述的肽段的核苷酸序列。
7.一種包含根據權利要求6所述的編碼根據權利要求1到4任一項所述的肽段的核苷酸序列的核酸構建物，其中所述核苷酸構建物能在原核或真核宿主細胞內有效表達，優選地，所述原核宿主細胞是大腸桿菌或枯草芽孢桿菌，所述真核宿主細胞是酵母菌、昆蟲細胞或哺乳動物細胞，優選地，所述核酸構建物是原核表達載體或真核表達載體，優選地，所述原核表達載體是質粒，更優選地，所述原核表達載體是pBridge ;優選地,所述真核表達載體是 PEFGF-C3 或 pXflag-CMV-14。
8.一種包含根據權利要求7所述的包含根據權利要求6所述的編碼根據權利要求1到4任一項所述的肽段的核苷酸序列的核酸構建物的宿主細胞，優選地，所述宿主細胞是原核宿主細胞或真核宿主細胞，更優選地，所述真核宿主細胞是哺乳動物細胞，最優選地，所述真核宿主細胞是人細胞。
9.一種根據權利要求1至4所述的肽段、根據權利要求5所述的組合物、根據權利要求6所述的核苷酸序列、根據權利要求7所述的核酸構建物或根據權利要求8所述的宿主細胞在制備治療腫瘤的藥物中的用途，優選地，所述腫瘤為乳腺癌、食管癌、胰腺癌或白血病。
10.一種根據權利要求1至4所述的肽段、根據權利要求5所述的組合物、根據權利要求6所述的核苷酸序列、根據權利要求7所述的核酸構建物或根據權利要求8所述的宿主細胞，其分別用作治療腫瘤的藥物，優選地，所述腫瘤為乳腺癌、食管癌、胰腺癌或白血病。
11.一種篩選根據權利要求1到4任一項所述的肽段的方法，其包括如下步驟 a)構建能在酵母細胞中表達Grb7蛋白的SH2結構域的誘館蛋白質粒； b)將所述誘餌蛋白質粒轉化酵母菌并篩選獲得陽性克隆； c)將隨機多肽文庫質粒轉化上述獲得的陽性克隆并確定相互作用情況； d)酵母雙雜交二次驗證非磷酸化肽段和Grb7SH2結構域的相互作用； e)將獲得的陽性質粒進行測序。
12.根據權利要求11所述的方法，其特征在于所述誘餌蛋白質粒為pBridge，所述酵母菌為CG1945，所述隨機多肽文庫質粒為Clonetech目錄號PT303921的產品，確定相互作用情況時利用β_半乳糖甘酶活性檢測實驗進行。
全文摘要
本發明涉及結合Grb7蛋白SH2結構域的非磷酸化配體及其制藥用途。具體而言，本發明涉及一種肽段，具有通式IGIPT/K/NX15G/WD/IP所示的序列，其中X選自氨基酸殘基P、S、T、Q、N、H、A、Y、L、E、D、F、R、K，X15整體富含P、S、T、Q、N，且其中P占21％，T占18％，S占13％，且所述肽段是Grb7蛋白SH2結構域的非磷酸化配體，能夠結合Grb7蛋白SH2結構域。本發明還涉及含有通式I所示肽段的肽段、包含所述肽段的組合物、所述肽段的編碼序列、含有所述編碼序列的核酸構建物、含有所述編碼序列和/或所述核酸構建物的宿主細胞，及其用途，及篩選所述肽段的方法。
文檔編號A61K38/16GK103012566SQ20111028873
公開日2013年4月3日 申請日期2011年9月26日 優先權日2011年9月26日
發明者高友鶴, 張丹, 胡斯奇, 馬素參 申請人:中國醫學科學院基礎醫學研究所