專利名稱：一種裝載難溶性抗腫瘤藥物的殼聚糖-羧化殼聚糖納米球、制備方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于藥物制劑領域，涉及納米載體在生物技術領域的應用，具體公開了一種裝載難溶性抗腫瘤藥物的殼聚糖-羧化殼聚糖納米球、制備方法及其應用，裝載難溶性抗腫瘤藥物的殼聚糖-羧化殼聚糖納米球經靜脈注射后到達病變部位，發揮藥效。此發明具有潛在的臨床治療應用價值。
背景技術：
惡性腫瘤已經成為嚴重危害全球人類健康的常見致命性疾病之一，其近年來發病率和死亡率都呈增加的趨勢。據WHO統計，2002年全世界因惡性腫瘤死亡人數達710. 6萬。 我國2000年癌癥發病人數180 200萬，死亡140 150萬。由于腫瘤形成的機制還不十分清楚，因此腫瘤的早期診斷、臨床治療及預后評估等都存在著非常多的困難。目前，臨床上惡性腫瘤的治療主要是采用手術、放療、化療、生物治療(包括免疫治療)等綜合治療手段，其中化療已經成為各種晚期惡性腫瘤有效治療的基礎。然而，臨床上常用較為有效的抗腫瘤藥物(如紫杉醇、喜樹堿等)多為難溶性藥物，給其應用帶來巨大的挑戰。另外，抗腫瘤藥物在體內呈全身性分布，腫瘤組織內很難達到有效藥物濃度，由于其對腫瘤部位的靶向性不明顯，進而對其他實質性器官造成不可逆轉的損害，造成全身毒性反應，常常導致化療失敗。在眾多的難溶性抗腫瘤藥物中，紫杉醇(PTX)是紅豆杉屬植物中一種復雜的次生代謝產物，也是目前所了解的唯一一種可以促進微管聚合和穩定已聚合微管的廣譜抗癌藥物，對肺癌、卵巢癌、乳腺癌、頭頸癌、胃癌、前列腺癌、宮頸癌等都具有良好的治療作用，是一種非常典型的難溶性抗腫瘤藥物。為了解決其難溶問題，臨床使用的注射制劑是將藥物溶于聚氧乙烯蓖麻油與無水乙醇的混合溶媒中，經葡萄糖或氯化鈉稀釋后進行靜脈注射。 這不僅會引起血管炎癥，而且聚氧乙烯蓖麻油在體內降會釋放組胺，從而導致嚴重的副反應。因此，病人在給藥前不得不先注射抗過敏藥物，導致整個治療過程繁瑣和不便，而且還需謹慎監測用藥過程。0-(氯乙酰氨甲酰基)煙曲霉素醇(AGM 1470)是近年來剛開發的一種煙曲霉素的活性類似物，對新生血管具有很好的抑制作用。然而，由于其本身的難溶性， 臨床上不得不加入助溶劑等以增加血液中藥物濃度。II期臨床試驗證明，其血藥清除率高， 副作用非常大，主要表現為惡心、嘔吐、腹瀉、神經毒性、疲乏、胃炎、皮疹等。很多患者也因此放棄治療。盡管科學家們為此做了很多的研究，例如轉向新型制劑的研究，包括將藥物裝載在脂質體、聚合物膠束、聚乳酸(PLA)和固體脂質體納米球內等。如專利CN 102166189A公開了一種靶向和熒光雙功能的難溶性抗腫瘤藥物納米結構脂質載體。該難溶性抗腫瘤藥物納米結構脂質載體，由固態脂質、液態脂質、表面活性劑和難溶性抗腫瘤藥物形成內部包載藥物的脂質載體，脂質載體表面經過化學修飾，共價連接上具有腫瘤靶向的配體，可以延長難溶性抗腫瘤藥物的體內循環時間，提高難溶性抗腫瘤藥物的生物利用度，還可通過熒光成像用于腫瘤的定位診斷。然而，脂質體在體內容易被酶類氧化，穩定性差，釋放藥物緩慢，突釋現象嚴重。而聚合物膠束由于在血液中會被稀釋到臨界膠束濃度以下，也存在著穩定性差的問題。PLA、固體脂質體等納米球疏水性強，雖然對難溶性藥物可能有較高的包埋率，但由于材料疏水性強，造成釋藥速率緩慢、血內清除率高和生物利用度低等問題。另外， 這些方法還存在著規模化制備困難、產品批次間差異性大的問題。為了提高難溶性藥物的水溶性、解決目前注射制劑嚴重毒副作用及現行研發制劑存在的問題，急需開發一種親水性好、載藥率高、穩定性好、生物利用度高的靶向給藥體系。可生物降解聚合物納米球在難溶性藥物包埋和傳輸方面具有潛在優勢，通過對納米球制備材料篩選和制備過程控制，能夠使難溶性藥物以微晶或細小顆粒形式被包裹于內部，可大大改善難溶性藥物溶出。納米球可以通過EI3R效應(實體瘤組織的高通透性和滯留效應)到達腫瘤部位，實現藥物的被動傳輸。另外，納米球可以在表面修飾一具有隱形效果的PEG鏈和腫瘤靶向分子，延長藥物在體內的循環周期，提高藥物的靶向性，進一步提高藥效。如專利CN 102083742A公開了一種制造尺寸均勻的、含難溶性藥物的聚合物納米顆粒的方法，具體地，所述方法包括第一步，將生物可降解的聚合物溶解在非揮發性的極性有機溶劑中；第二步，將難溶性藥物添加到水和所述生物可降解的聚合物的溶液中以生成分散液；第三步，在低機械能水平攪拌條件下，將所述分散液批量添加到乳化劑溶液中。該發明的聚合物納米顆粒能通過使用非揮發性的極性溶劑尤其是與水具有相似極性的溶劑作為生物可降解的聚合物與難溶物質的混合溶液的溶劑、并在乳化過程中采用低機械能條件和批量添加分散液的簡便方法制造納米尺寸的、小而均勻的聚合物納米顆粒。該聚合物納米顆粒的優點為包含在聚合物顆粒中的難溶性藥物的溶出度得到顯著提高，且所述難溶性藥物逐漸且穩定地得以釋放，并長期保持在恒定濃度。但到目前為止，還未成功開發出兼具隱形和靶向的應用于體內難溶性藥物傳輸的有效納米球載體，嚴重限制了難溶性抗腫瘤藥物的臨床應用。殼聚糖是一種天然的陽離子生物高聚物，具有良好的生物粘附性、生物相容性和生物可降解性等優點，是制備難溶性藥物納米載體的理想材料。CN1760213A公開了一類季銨化殼聚糖衍生物，尤其是能形成兩親性聚合物分子的季銨化殼聚糖衍生物，其能對難溶性藥物具有增溶作用，并且載藥后形成的膠束粒徑小，約為50nm。此外，還公開了這類衍生物的制備方法、其作為難溶性藥物增溶劑的作用以及含其的藥物組合物。CN 1698899A公開了一類以殼聚糖或其衍生物作為藥物載體的新型藥物組合物，能被載體負載的藥物主要包括抗腫瘤藥物、難溶于水的非抗腫瘤藥物和DNA，方法是通過在殼聚糖分子上接枝疏水性側鏈基團，而獲得水溶性的殼聚糖衍生物再以它為載體負載抗腫瘤藥物或難溶于水的非抗腫瘤藥物或DNA，以及直接將抗腫瘤藥分子或其它藥物通過化學鍵與殼聚糖分子相連接，制備具有新型載體的高分子藥物。目前作為難溶性藥物載體的殼聚糖及其衍生物存在以下難題(1)親水性的殼聚糖納米球無法實現對難溶性藥物的直接裝載，本發明采用0/W/0復乳法實現對難溶性藥物的裝載，復乳液進一步固化即可制得裝載難溶性藥物的納米球。復乳液特別是納米復乳液滴在制備過程中的穩定性是一個極大的挑戰。( 難溶性藥物如紫杉醇通常在制備過程中很容易析晶形成大的晶體顆粒而破壞乳液，造成藥物泄漏甚至包埋失敗。(3)純的殼聚糖納米球具有實心結構，釋放液很難進入納米球，導致藥物釋放速率緩慢。(4)殼聚糖制備的納米球大多采用化學交聯法，經化學交聯固化后，殼聚糖納米球表面的功能基團氨基由于交聯時被占用，無法進一步連接PEG鏈或嫁接靶向分子。( 制備方法非常有限，主要采用機械攪拌法，采用這種方法在制備乳液時，由于粒徑不均一，小的乳滴會被大的乳滴吸收，同時大的乳滴又會因剪切力的作用而破壞，這導致所制得的殼聚糖納米球粒徑很不均一。而且，由于乳滴的粒徑不均一，在交聯過程中小液滴容易被大液滴吸附，大液滴又容易被剪切成小液滴，從而會形成很多交聯凝聚物。同時，在液滴的合并和破裂過程中，內包藥物容易逃逸到液滴外面，導致藥物的包埋率降低。納米球粒徑的不均一還會為殼聚糖及其衍生物納米球的實際應用帶來諸多困難。(6)大多數納米球經靜脈注射給藥后會被網狀內皮系統識別并迅速清除，使藥物無法達到治療濃度。(7)簡單的納米球載體由于缺乏靶向性，給正常機體組織帶來不可恢復的毒副作用。

發明內容
針對現有技術中裝載難溶性抗腫瘤藥物的納米球存在的問題，本發明的目的之一在于提供一種裝載難溶性抗腫瘤藥物的殼聚糖-羧化殼聚糖納米球。所述裝載難溶性抗腫瘤藥物的殼聚糖-羧化殼聚糖納米球粒徑均一，多分散指數在0. 2以內，對難溶性藥物的載藥率高達10-50%。通過在納米球基質中改變殼聚糖與羧化殼聚糖的比例，實現納米球多孔結構的構建，孔徑可控制在50納米以內，保證藥物穩定快速釋放，釋放速率可控。該納米球由于偶聯有隱形效果的聚乙二醇PEG鏈，減少血液相關蛋白與納米球之間的相互作用，有效地延長藥物在體內的循環時間長達20小時。該納米球由于嫁接有腫瘤靶向分子，增加了其在腫瘤部位的親和力，增加了腫瘤細胞的內吞，有良好的腫瘤靶向特性。該納米球其相對于傳統的注射制劑相比，有較低的毒副作用。目前臨床上為了克服藥物的難溶問題，常選用聚氧乙烯蓖麻油等脂溶性溶劑作為助溶劑，再行靜脈注射給藥。該注射劑型所用的助溶劑引起嚴重的毒副作用，如嚴重的致敏反應、惡心、呼吸困難等。由于殼聚糖-羧化殼聚糖天然的親水性及納米球本身在Era效應的作用下被動靶向腫瘤的優勢，因此該納米球無需使用聚氧乙烯蓖麻油等脂溶性溶劑。另外，傳統抗腫瘤藥物注射制劑給藥后藥物在體內呈全身性分布，腫瘤組織內很難達到有效藥物濃度，由于其對腫瘤部位的靶向性不明顯，進而對其他實質性器官造成不可逆轉的損害，造成全身毒性反應，常常導致化療失敗。本發明所提供的難溶抗腫瘤藥物注射制劑產品兼具隱形和靶向效果(如

圖1所示)，延長藥物在體內的循環周期，提高藥物的靶向性，降低了藥物對機體正常組織所產生的毒副作用，提高藥物的生物利用度。難溶性藥物納米晶以原位結晶的形式均勻分布在殼聚糖及其衍生物納米球中，極大的提高了親水性材料載體對難溶性藥物的載藥率，克服了親水性材料無法實現對難溶性藥物的有效包埋等困難。避免了難溶性藥物以大的晶體形式存在于載體中而導致的突釋現象。該納米球裝載的難溶性藥物能夠穩定快速釋放，還可以通過改變載體孔徑控制釋藥速率。所述載藥率按下式計算
權利要求
1.一種裝載難溶性抗腫瘤藥物的殼聚糖-羧化殼聚糖納米球，其特征在于，具有多孔結構，含有PEG鏈及可以偶聯腫瘤靶向配體的官能團。
2.如權利要求1所述的殼聚糖-羧化殼聚糖納米球，其特征在于，所述難溶性藥物納米晶在納米球內均勻分布；優選所述難溶性藥物納米晶的粒徑在20納米以下，進一步優選在15納米以下，更優選在10納米以下，特別優選為3納米以下；優選所述難溶性藥物為脂溶性而水不溶性的抗腫瘤藥物，優選為紫杉醇、多烯紫杉醇、 喜樹堿、0-(氯乙酰氨甲酰基)煙曲霉素醇或其混合物，特別優選為紫杉醇、0-(氯乙酰氨甲酰基)煙曲霉素醇或其混合物。
3.如權利要求1所述的殼聚糖-羧化殼聚糖納米球，其特征在于，其多孔孔徑優選在 50納米以內，進一步優選在40納米以內，更優選在30納米以內，特別優選在20納米以內；優選所述的殼聚糖-羧化殼聚糖納米球，其釋藥速率可控；優選所述的殼聚糖-羧化殼聚糖納米球，其平均粒徑在2000納米以下，優選為1500納米以下，進一步優選為20-1500納米，更優選為50-350納米；優選所述的殼聚糖-羧化殼聚糖納米球，粒徑多分散指數< 0. 2，優選< 0. 15，特別優選< 0. 1。
4.如權利要求1所述的殼聚糖-羧化殼聚糖納米球，其特征在于，所述PEG鏈的相對分子量范圍優選為1000-7000，進一步優選為2000-6000，特別優選為2000-5000 ；優選所述可以偶聯腫瘤靶向配體的官能團位于PEG鏈的末端。優選所述可以偶聯腫瘤靶向配體的官能團為Arg-Gly-Asp(RGD)。
5.如權利要求1-4任一項所述的裝載難溶性抗腫瘤藥物的殼聚糖-羧化殼聚糖納米球的用途，其特征在于，可用于治療腫瘤的一種注射制劑、口服藥劑，優選用于注射制劑。
6.一種制備裝載難溶性抗腫瘤藥物的殼聚糖-羧化殼聚糖納米球的方法，包括如下步驟(1)提供溶解了難溶性藥物的與水不互溶的溶液作為內油相I(O1)；(2)提供含有水相乳化劑且溶解有殼聚糖-羧化殼聚糖的酸性溶液作為水相(W)；(3)提供含有油溶性乳化劑且與水互不相溶的油性物質作為外油相II(O11)；(4)將內油相I與水相混合得到O1Z^W型初乳液；(5)將上述制得的(VW型初乳液與外油相II混合得到(VWA)11型預復乳液；(6)將上述預復乳液過微孔膜，得到粒徑均一的復乳液滴；(7)向復乳液中加入交聯劑與殼聚糖和/或羧化殼聚糖上的氨基反應，使乳滴交聯固化得到裝載難溶抗腫瘤藥物的殼聚糖-羧化殼聚糖納米球；(8)將制備的殼聚糖-羧化殼聚糖納米球懸浮于含有EDC和NHS的PBS中；(9)向上述懸濁液中加入具有異端雙官能團的PEG，與殼聚糖-羧化殼聚糖納米球上的羧基偶聯反應；(10)將上述制備的裝載難溶性藥物的PEG化的殼聚糖-羧化殼聚糖納米球重懸于溶解有靶向配體的水溶液中反應。
7.如權利要求6所述的制備方法，其特征在于，步驟(7)中所述乳滴交聯優選分為以下兩個階段第一階段，將乳液在低溫下固化一段時間。固化溫度優選為5-30°C，特別優選為 10-25°C，固化時間優選0. 5小時以上，特別優選為0. 5-3. 5小時；第二階段緩慢加熱至較高溫度固化。較高溫度優選為40-85°C，進一步優選為 40-75°C，特別優選為40-65°C，加熱速率優選1°C /分鐘以上，特別優選為1°C /分鐘_5°C / 分鐘，再次交聯固化時間優選4小時以上，進一步優選為5小時以上，特別優選為5-12小時。
8.如權利要求6-7任一項所述的方法，其特征在于，該方法適用于親水性材料對水不溶而脂溶性藥物的包埋；優選所述難溶性藥物為脂溶性而水不溶性的抗腫瘤藥物，優選為紫杉醇、多烯紫杉醇、 喜樹堿、0-(氯乙酰氨甲酰基)煙曲霉素醇或其混合物，特別優選為紫杉醇、0-(氯乙酰氨甲酰基)煙曲霉素醇或其混合物；優選步驟(1)中所述的溶劑為有機溶劑，進一步優選為鹵代烷烴、酯類或其混合物，再一步優選為C1-C5烷烴的鹵代物、酯類或其混合物，更優選為C1-C3烷烴的氯代物、酯類或其混合物，特別優選二氯甲烷、三氯甲烷、二氯乙烷、乙酸乙酯或其混合物；優選步驟O)中所述的殼聚糖和羧化殼聚糖的粘均分子量為1000000以下，進一步優選為 5000-980000，特別優選為 10000-100000 ；優選步驟( 中所述殼聚糖與羧化殼聚糖混合物中，羧化殼聚糖含量為5%-100%，特別優選為10% -100% ；優選步驟⑵中所述的水相乳化劑為水溶性乳化劑，為Bnf 35、吐溫-20、吐溫-40、吐溫-60、Triton-X405及其混合物；
9.如權利要求6-7任一項所述的方法，其特征在于，步驟(3)中所述油性物質優選為石蠟、醚類、植物油、其他烷類碳氫化合物或其混合物，特別優選為液體石蠟、石油醚、橄欖油、 棉子油、豆油、葵花子油、其它烷類碳氫化合物或其混合物；優選步驟(3)中所述油溶性乳化劑其親水親油平衡值HLB在3-6之間，具體的例子可以是失水山梨醇倍半油酸酯、甘油醚的聚合物、聚氧乙烯氫化蓖麻油、失水山梨醇三油酸酯、失水山梨醇單油酸酯、失水山梨醇三硬脂酸酯、親油-親水嵌段共聚物，P0-500、P0-310 或其混合物；優選步驟(3)中所述外油相中油溶性乳化劑的濃度，基于外油相的質量，為20wt%以下，優選為 0. 5wt% -IOwt % ；優選步驟(4)中的初乳液優選經乳化得到，進一步優選經高速均質乳化或超聲乳化得到；優選步驟中內油相(O1)與水相(W)的比例范圍為1:2-1: 30，特別優選為 1 3-1 20 ；優選步驟(5)中預復乳液通過乳化得到，進一步優選經高速均質乳化或超聲乳化得到；優選步驟(5)中初乳液與外油相(O11)的比例范圍為1:2-1: 80，特別優選為 1:3-1: 60。
10.如權利要求6-7任一項所述的方法，其特征在于，步驟(6)中所述預復乳液優選在壓力作用下通過微孔膜；優選步驟(6)中所述微孔膜孔徑均一；優選步驟(6)中所述微孔膜孔徑范圍為15微米以下，進一步優選為9. 0微米以下，特別優選為0. 2-9. 0微米；優選步驟(6)中乳液過膜次數1次以上(包括1次)，即通過同一微孔膜至少1次得到所述0/W/0型乳液，優選為2次以上，特別優選為2-5次；優選步驟(6)中所述過膜壓力為基本恒定的壓力，其與所用膜孔徑、內外油相粘度和水相中殼聚糖含量有關。所述基本恒定的壓力范圍優選為0.5MPa以上，特別優選 0. 5-5. OMPa ；優選所述基本恒定的壓力是指壓力的波動不超過10 %，優選不超過5 %，更優選不超過；優選步驟(7)中所述交聯劑為醛類，特別優選為戊二醛、甲醛或其混合物； 優選步驟(9)中所述具有異端雙官能團的PEG的濃度范圍為l-5mg/mL。 優選步驟(10)中所述靶向配體的加入量為20-500 μ g/mL。
全文摘要
本發明涉及一種裝載難溶抗腫瘤藥物的殼聚糖-羧化殼聚糖納米球。該納米球具有多孔且孔徑可控的結構，從而控制藥物較快、穩定地釋放。該納米球表面偶聯有PEG鏈及靶向腫瘤的特異性分子，能夠有效延長藥物在體內的循環周期，改善納米球對腫瘤細胞的親和能力，提高藥物生物利用度。另外，該納米球有較低的毒副作用和更好的抑瘤效果。本發明還提供了一種制備裝載(或聯合裝載)難溶性藥物的殼聚糖-羧化殼聚糖納米球的方法，即利用殼聚糖/羧化殼聚糖的氨基交聯成球，羧化殼聚糖上的羧基偶聯PEG鏈并嫁接靶向分子，能夠控制藥物以原位結晶的形式均勻分散在殼聚糖及其衍生物納米球中，極大的提高藥物的裝載率，穩定藥物的釋放速率。
文檔編號A61P35/00GK102389572SQ20111034250
公開日2012年3月28日 申請日期2011年11月2日 優先權日2011年11月2日
發明者呂丕平, 周煒清, 王連艷, 蘇志國, 馬光輝, 魏煒 申請人:中國科學院過程工程研究所