專利名稱：一種表達狂犬病病毒g蛋白的重組假型桿狀病毒及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于病毒學(xué)和基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種表達狂犬病病毒主要免疫原性糖蛋白(G蛋白)的重組假型桿狀病毒的構(gòu)建，本發(fā)明還涉及以該重組假型桿狀病毒制備的疫苗及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒(Rabies virus, RV)引起的，可以導(dǎo)致人和哺乳動物發(fā)生急性腦炎和周圍神經(jīng)炎癥的一種人獸共患病。狂犬病的臨床特征為恐水、怕風(fēng)、咽肌痙攣及進行性麻痹等，一旦發(fā)病，死亡率幾乎達100%。狂犬病的發(fā)生最早可以追溯到公元前2300年，迄今仍在世界范圍內(nèi)流行。在亞洲，每年報道人的狂犬病約3.5萬例，其中94%是由患病犬或攜毒犬咬傷引起的。近年來，我國平均每年因狂犬病而死亡的人數(shù)達2000-3000例，且一直呈逐年上升的趨勢，盡管我國已廣泛使用了高質(zhì)量的細胞培養(yǎng)滅活疫苗，也在一定程度上取得了令人滿意的效果，但狂犬病對我國(尤其是農(nóng)村和山區(qū))人民正常生活的威脅仍然日趨明顯。狂犬病病毒屬于彈狀病毒科(Rhabdoviridae),同一科的病毒還包括水皰性口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus, VSV)、牛流行熱病毒(Bovine Ephemeral FeverVirus, BEFV)等。其病毒粒子形態(tài)呈子彈狀,長180nm,直徑75nm,頭部為半球形,末端常為平端，病毒顆粒由外殼和核心兩部分組成。基因組為單鏈不分節(jié)段的負鏈RNA，大小約12kb。每個RV粒子由一個分子的基因組RNA和五種蛋白組裝而成。這五種蛋白分別為:(I)依賴RNA的RNA聚合酶(L蛋白)；(2)糖蛋白(G蛋白)，為狂犬病病毒的主要免疫原性蛋白；(3)核蛋白(N蛋白)，為磷酸化的蛋白；(4)磷酸蛋白(P蛋白)；(5)基質(zhì)蛋白或膜蛋白(M蛋白)。其中糖蛋白與病毒的感染和免疫密切相關(guān)(殷震.動物病毒學(xué).科學(xué)出版社，1997，第二版 329-331)。

糖蛋白是RV粒子的表面膜蛋白，以三聚體的形式定位于病毒的表面，形成病毒的棘狀突起(Gaudin Y, Ruigrok Rff, Tuffereau C et al.Rabies virus glycoprotein isa trimer.Virology, 1992,187:627-632) 0它由四個功能區(qū)組成，分別是前19個氨基酸的信號肽、20-439位氨基酸的膜外區(qū)(抗原區(qū))、440-461位氨基酸的跨膜區(qū)、462-504位氨基酸的膜內(nèi)區(qū)(附著區(qū))(Fu S，Deisseroth AB.Use of the cosmid adenoviral vectorsystem for the in vitro construction of recombinant adenoviral vectors.Hum GeneTher, 1997,8:1321-1330) 0 RV G蛋白是有效的保護性抗原，能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體和細胞免疫反應(yīng)(Saxena S，Dahiya SS, Sonwane AA et al.A sindbis virus replicon-basedDNA vaccine encoding the rabies virus glycoprotein elicits immune responses andcomplete protection in mice from lethal challenge.Vaccine，2008，26:6592-6601)。以單克隆抗體中和實驗技術(shù)研究G蛋白上的抗原結(jié)合位點，發(fā)現(xiàn)G蛋白上至少存在3個中和抗體結(jié)合位點。由于G蛋白與狂犬病病毒的毒力及致病性密切相關(guān)，而且又是狂犬病病毒的主要保護性抗原，越來越多的研究關(guān)注G蛋白在狂犬病防治中的應(yīng)用。狂犬病疫苗誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體的水平主要取決于G蛋白的量，表達G蛋白基因的重組活病毒載體疫苗在狂犬病的預(yù)防中展現(xiàn)了良好的應(yīng)用前景。研究證實表達RV G蛋白的重組痘苗病毒經(jīng)消化道免疫狐貍，能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生抗狂犬病病毒的中和抗體，可有效地保護狐貍抵抗狂犬病病毒的感染(Lambot M, Blasco E, Barrat J et al.Humoraland cell-mediated immune responses of foxes(Vulpes vulpes)after experimentalprimary and secondary oral vaccination using SAG2 and V-RG vaccines.Vaccine,2001，19:1827-1835)。在歐洲與美國，通過大量投放這種重組狂犬病口服活疫苗，對控制狂犬病病毒在狐貍與浣熊等野生動物中的流行發(fā)揮了重要作用。然而，由于痘苗病毒本身具有潛在的致病性，因此，重組痘苗病毒活疫苗不能用來免疫家養(yǎng)動物。為了獲得安全、高效、廉價的狂犬病基因工程疫苗，也有研究人員用其它的無致病性的表達系統(tǒng)表達G蛋白來研制亞單位疫苗。Fu等證實，浣熊口服桿狀病毒表達的狂犬病病毒G蛋白疫苗，可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生抗狂犬病病毒的中和抗體，并能保護浣熊抵抗狂犬病病毒高致病性毒株的攻擊(Fu ZF,Ruppreeht CE, Dietzschold B et al.0ral vaccination of raccoons(Procyon lotor)with baculovirus-expressed rabies virus glycoprotein CJ7.Vaccine,1993,11:925-928)。但由于G蛋白不易純化，研制狂犬病病毒G蛋白亞單位疫苗的進展緩慢，因此，許多研究轉(zhuǎn)向利用G蛋白基因構(gòu)建DNA核酸疫苗。DNA疫苗不但能誘導(dǎo)體液免疫和細胞免疫，而且具有生產(chǎn)簡便、成本低廉、穩(wěn)定性好等優(yōu)點。用表達狂犬病病毒G蛋白的質(zhì)粒經(jīng)肌肉免疫小鼠，能誘導(dǎo)高水平的體液免疫與細胞免疫，并能保護80 %以上的小鼠抵抗狂犬病病毒的攻擊。最新的研究還發(fā)現(xiàn)，用表達狂犬病病毒G蛋白的DNA疫苗經(jīng)皮內(nèi)免疫犬I次，機體不但能產(chǎn)生高滴度的中和抗體，維持時間長，而且能保護免疫犬在免疫I年后仍能抵抗致死劑量狂犬病病毒的攻擊(Lodmell DL, Ewah LC, Parnell MJ et al.0ne-timeintradermal DNA vaccination in ear pinnae one year prior to infection protectsdogs against rabies virus.Vaccine，2006，24:412-416)。G蛋白不僅能誘導(dǎo)很強的中和抗體，還能刺激機體產(chǎn)生細胞免疫反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，RV激活的天然免疫反應(yīng)，尤其是IFN-α/β的上調(diào)表達，與RV G蛋白的表達水平密切相關(guān)。在中樞性神經(jīng)系統(tǒng)和初級神經(jīng)元細胞上，減毒RV表達G蛋白的量是高致病性RV表達量的3倍以上，且兩者誘導(dǎo) 的炎癥反應(yīng)和G蛋白的表達量呈反相關(guān)。通過基因芯片分析和real-time PCR驗證表明，在減毒RV感染的小鼠體內(nèi)能檢測到大量炎癥因子的上調(diào)表達，而高致病RV感染引起的炎癥反應(yīng)很弱甚至沒有。而且，減毒RV能誘導(dǎo)許多與天然免疫和抗病毒效應(yīng)相關(guān)的基因上調(diào)表達，尤其是與IFN-α/β以及炎癥趨化因子信號通路有關(guān)的分子。其中，上調(diào)表達的IFN信號基因有STAT1、STAT2、STAT3和JAK-2等，IFN調(diào)節(jié)基因有IRF-1、IRF-2、IRF-7, IFN 效應(yīng)基因有 0AS、Mx、PKR 等，以及趨化因子 MCP-1、IP-10、RANTES等(Wang Zff, Sarmento L, Wang Y et al.Attenuated rabies virus activates, whilepathogenic rabies virus evades,the host innate immune responses in the centralnervous system.J Virol, 2005, 79:12554-12565) Faber 等還發(fā)現(xiàn) RV 在接種小鼠以后，致病性RV在腦組織中的病毒滴度是減毒RV的1000倍，進一步的研究還表明致病性RV是通過限制自身G蛋白的表達來逃避機體的天然免疫屏障，使其具有更強的致病性和更強的增殖倉泛力(Faber M, Pulmanausahakul R, Hodawadekar SS et al.0verexpression of therabies virus glycoprotein results in enhancement of apoptosis and antiviralimmune response.J Virol,2002, 76:3374-3381 ；Faber M，Pulmanausahakul R，Nagao Ket al.1dentification of viral genomic elements responsible for rabies virusneuroinvasiveness.Proc Natl Acad Sci USA, 2004,101:16328—16332) 由于 G 蛋白的限制性表達有利于RV逃避機體的天然免疫屏障，在設(shè)計狂犬疫苗時，利用高效表達載體在體內(nèi)大量表達G蛋白，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生強的特異性體液免疫和細胞免疫，更有利于機體在接種疫苗后抵抗RV的感染。

RV G蛋白作為RV最主要的保護性抗原，不僅可誘導(dǎo)特異性中和抗體的產(chǎn)生，而且可剌激機體產(chǎn)生細胞免疫，在抵抗RV的感染中起到了決定性的作用，因此，研制針對RV G蛋白的基因工程疫苗已成為狂犬病疫苗的研究熱點。桿狀病毒載體是目前應(yīng)用十分廣泛的病毒表達載體之一，它被廣泛的應(yīng)用于蛋白表達、基因治療、疫苗開發(fā)等領(lǐng)域。桿狀病毒表達系統(tǒng)作為一種真核表達系統(tǒng)，在外源基因表達方面具有糖基化、磷酸化和蛋白切割加工等修飾過程，表達產(chǎn)物的生物學(xué)特性與天然產(chǎn)物相似，而且表達效率高(Luckow VA, Summers MD.High level expression of nonfusedforeign genes with Autographa californica nuclear polyhedrosis virus expressionvectors.Virology, 1989,170:31-39)。傳統(tǒng)的桿狀病毒由于其宿主特異性，這種高效表達載體僅限用于介導(dǎo)外源基因在其受納昆蟲細胞內(nèi)表達。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，攜帶哺乳動物啟動子的重組桿狀病毒能介導(dǎo)外源基因在各種哺乳動物細胞和動物體內(nèi)使外源蛋白得到高效穩(wěn)定的表達，且其自身基因組并不復(fù)制和表達(Volkman LE，Goldsmith PA.1n VitroSurvey of Autographa californica Nuclear Polyhedrosis Virus Interaction withNontarget Vertebrate Host Cells.Appl Environ Microbiol，1983，45:1085-1093)。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，表面展示有水泡性口炎病毒(Vesicular Stomatatis Virus，VSV)糖蛋白(VSV/G)的假型桿狀病毒，能轉(zhuǎn)導(dǎo)更多種類的細胞，且介導(dǎo)基因表達的效率更高(Barsoum J，Brown R，McKee M et al.Efficient transduction of mammalian cells bya recombinant baculovirus having the vesicular stomatitis virus G glycoprotein.Hum Gene Ther，1997，8:2011-2018 ;Pieroni L，Maione D，La Monica N.1n vivo genetransfer in mouse skeletal muscle mediated by baculovirus vectors.Hum GeneTher, 2001,12:871-881)。許多研究結(jié)果證實，通過直接注射介導(dǎo)免疫原性蛋白表達的桿狀病毒疫苗就能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生高水平的體液免疫和細胞免疫反應(yīng)(Wu Q，F(xiàn)ang L，Wu Xet al.A pseudotype baculovirus-mediated vaccine confers protective immunityagainst lethal challenge with H5N1 avian influenza virus in mice and chickens.Mol Immunol，2009，46:2210-2217 ；Bai B,Lu XiMeng J et al.Vaccination of mice withrecombinant baculovirus expressing spike or nucleocapsid protein of SARS-1ikecoronavirus generates humoral and cellular immune responses.Mol Immunol，2008，45:868-875)。RV和VSV同屬彈狀病毒科成員，其糖蛋白具有類似的特性，如介導(dǎo)膜融合的活性。早在1992年，Tuchiva利用桿狀病毒在昆蟲細胞中表達RV G蛋白時就發(fā)現(xiàn)，RV G蛋白能介導(dǎo)細胞間的融合，且這種融合能被RV G蛋白的抗血清所抑制(Tuchiya K,MatsuuraY，Kawai A et al.Characterization of rabies virus glycoprotein expressed byrecombinant baculovirus.Virus Res, 1992, 25:11-13)。此外，Tani 在研究重組桿狀病毒體外和體內(nèi)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率時發(fā)現(xiàn)，表面展示有RV G蛋白的桿狀病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)神經(jīng)元細胞的效率是未經(jīng)修飾桿狀病毒的 500 倍(Tani H, Limn CK, Yap CC et al.1n vitro and in vivogene delivery by recombinant baculoviruses.J Virol, 2003, 77:9799-97808)。基于上述原因，申請人以狂犬病病毒G蛋白對桿狀病毒載體進行修飾，使其展示在桿狀病毒囊膜表面，并以修飾后的假型桿狀病毒為載體構(gòu)建能在哺乳動物細胞中表達狂犬病病毒G蛋白的重組假型桿狀病毒疫苗。以此獲得的重組桿狀病毒疫苗既具有亞單位疫苗的特性，又具有活病毒載體疫苗的特性，并在小鼠模型上探討該疫苗誘導(dǎo)的體液免疫和細胞免疫效力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，其第一個目在于以狂犬病病毒G蛋白對桿狀病毒進行修飾，使其展示在桿狀病毒囊膜表面，并以此假型桿狀病毒為載體構(gòu)建能高效轉(zhuǎn)導(dǎo)哺乳動物細胞并表達狂犬病病毒G蛋白的重組假型桿狀病毒。本發(fā)明的第二個目的是利用上述重組病毒制備防治狂犬病的疫苗，該疫苗具有亞單位疫苗和活病毒載體疫苗的雙重特性。本發(fā)明的第三個目的還包括將上述獲得的疫苗用于狂犬病的防制。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實施:以狂犬病病毒G蛋白對桿狀病毒進行修飾，使其展示在桿狀病毒囊膜表面，構(gòu)建狂犬病病毒G蛋白修飾的假型桿狀病毒載體。然后，在此假型桿狀病毒載體中插入含狂犬病病毒G蛋白基因的哺乳動物細胞表達盒。申請人:所在的華 中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家點實驗室動物傳染病室通過分子生物學(xué)技術(shù)獲得一株重組假型桿狀病毒BV-RVG/RVG，該重組病毒于2010年10月22日送交湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏編號為CCTCC NO:V201022，該重組毒株的特征在于:具有表達狂犬病病毒G蛋白的雙表達盒，既含有Pph啟動子驅(qū)動狂犬病病毒G蛋白表達并使其展示在病毒粒子囊膜表面的昆蟲細胞表達盒PPH-RVG-poly (A)，又含有CMV啟動子驅(qū)動狂犬病病毒G蛋白在哺乳動物細胞中高效表達的哺乳動物細胞表達盒CMV-RVG-poly(A)，其中所述的狂犬病病毒G蛋白核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示。本發(fā)明的優(yōu)點在于:1.本疫苗的第一個優(yōu)勢是將狂犬病病毒主要免疫原性糖蛋白(RVG)展示在桿狀病毒粒子的囊膜表面，其作用有兩個:①囊膜表面展示有RVG蛋白的重組桿狀病毒，即為假型桿狀病毒，所展示的RVG蛋白能介導(dǎo)細胞間的融合，促進假型桿狀病毒在體外和體內(nèi)的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，進一步提高外源基因的表達效率；②純化的假型桿狀病毒粒子表面展示有大量的RVG蛋白，以此假型桿狀病毒免疫動物能刺激機體產(chǎn)生針對RVG的特異性免疫反應(yīng)。2.本疫苗的第二個優(yōu)勢是以囊膜表面展示有RVG蛋白的重組假型桿狀病毒為載體構(gòu)建表達RVG蛋白的活病毒載體疫苗，該疫苗在體外和體內(nèi)都能高效轉(zhuǎn)導(dǎo)哺乳動物細胞并高效表達RVG蛋白。3.本疫苗突破以往單純亞單位疫苗和活病毒載體疫苗的局限，同時兼具亞單位疫苗和活病毒載體疫苗的雙重特性。


序列表SEQ ID NO:1是本發(fā)明中人工合成的RVG基因編碼序列。其完整編碼區(qū)序列全長為1575bp，編碼524個氨基酸。圖1:是本發(fā)明的總體技術(shù)流程圖。圖2:是本發(fā)明中轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBac-RVG-poly(A)-CMV_EGFP的構(gòu)建路線圖。圖3:是本發(fā)明中轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBac-RVG-poly(A)-CMV_RVG的構(gòu)建路線圖。圖4:顯示了本發(fā)明中轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBac-RVG-poly⑷-CMV-EGFP的酶切鑒定圖。圖中Marker為DNA分子量大小標準；I為Bgl 11/Xho I雙酶切轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBac-RVG-poly (A) -CMV-EGFP 的鑒定結(jié)果。圖5:顯示了本發(fā)明中轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBac-RVG-poly (A)-CMV-RVG的酶切鑒定圖。圖中Marker為DNA分子量大小標準；I為Xho I單酶切轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBac-RVG-poly (A) -CMV-RVG 的鑒定結(jié)果。圖6:是重組假型桿狀病毒BV-RVG/EGFP和BV-RVG/RVG的結(jié)構(gòu)示意圖。圖7:是重組假型桿狀病毒BV-RVG/EGFP和BV-RVG/RVG在Sf9細胞上的病變圖，圖左是BV-RVG/EGFP在Sf9細胞上的病變圖；圖右是BV-RVG/RVG在Sf9細胞上的病變圖。圖8:是表達報告蛋白(EGFP)的重組假型桿狀病毒BV-RVG/EGFP和野生型桿狀病毒(Wide type BV)轉(zhuǎn)導(dǎo)Hela細胞后的熒光圖片，圖左是BV-RVG/EGFP ;圖右是野生型桿狀病毒(Wide type BV)。 圖9:是重組假型桿狀病毒BV-RVG/EGFP和BV-RVG/RVG在小鼠模型中誘導(dǎo)的RV特異性ELISA抗體水平。圖10:是重組假型桿狀病毒BV-RVG/EGFP和BV-RVG/RVG在小鼠模型中誘導(dǎo)的RV特異性中和抗體水平。圖11:是重組假型桿狀病毒BV-RVG/EGFP和BV-RVG/RVG免疫BALB/c小鼠后，用ELISA方法檢測小鼠脾淋巴細胞分泌IFN-Y的水平。
具體實施例方式實施例1:本發(fā)明中轉(zhuǎn)移質(zhì)粒 pFastBac-RVG-poly (A)-CMV-EGFP 和pFastBac-RVG-poly (A) -CMV-RVG 的構(gòu)建本發(fā)明中轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBac-RVG-poly (A)-CMV-EGFP 和pFastBac-RVG-poly (A)-CMV-RVG的構(gòu)建路線圖見圖1和圖2所示。l.poly(A)序列和EGFP基因的引物設(shè)計、PCR擴增以及基因克隆根據(jù)載體pC1-neo (Cat.N0.E1S41,購買自Promega公司)中poly(A)的核苷酸序列，設(shè)計上游引物 poly (A) -Forward:TTTAGATCTCGACATGATAAGATACA (下劃線部分為 Bgl
II酶切位點);下游引物 Poly(A)-Reverse:TTTGGATCCTACCACATTTGTAGAGG(下劃線部分為BamH I酶切位點)。以載體pCI_neo為模板,進行poly (A)序列的擴增,poly (A)序列的擴增條件為:95°C 3min變性后進入循環(huán)，循環(huán)參數(shù)為:95°C lmin，56°C 30sec，72°C lmin，35個循環(huán)后72°C延伸lOmin。在1.6%的瓊脂糖凝膠上電泳回收約220bp的擴增產(chǎn)物并將其克隆至PMD18-T載體上，獲得重組質(zhì)粒pMD18T-poly (A)，進行序列測定，證實無堿基誤配。根據(jù)載體pBSmut4EGFP(由美國Stanford大學(xué)Okada Ami博士惠贈；文獻來源:OkadaA, Lansford R, Weimann JM, et al.1maging Cells in the Developing NervousSystem with Retrovirus Expressing Modified Green Fluorescent Protein.ExpNeurol，1999，156:394-406)中綠色熒光蛋白(EGFP)的完整編碼區(qū)核苷酸序列設(shè)計上游弓丨物 EGFP-Forward:TTTAGATCTACCATGGTGAGCAAGGGC(下劃線部分為 Bgl II 酶切位點)，下游引物 EGFP-Reverse:TTTGGATCC GCTTTACTTGCACAGCTCG (下劃線部分為 BamH I 酶切位點)。以載體pBSmut4EGFP為模板，進行EGFP的擴增，其擴增條件為:95°C變性3min后進入循環(huán)，循環(huán)參數(shù)為:95°C lmin,55°C lmin, 72°C 1.5min ;35 個循環(huán)后 72°C延伸 lOmin。在I %的瓊脂糖凝膠上電泳回收約750bp的擴增產(chǎn)物并將其克隆至pMD18-T載體，獲得重組質(zhì)粒PMD18T-EGFP，進行序列測定，證實無堿基誤配。進一步用BamH I和Bgl II雙酶切 pMD18T-EGFP，回收約 750bp 的 EGFP 基因片段，插入 pcDNA3.1 (Cat.N0.V790-20,購買自Invitrogen公司)的BamH I位點，獲得重組質(zhì)粒pcDNA3.1-EGFP。2.本發(fā)明中pFastBac-RVG骨架質(zhì)粒的構(gòu)建根據(jù)GenBank中公布的狂犬病病毒CVS_B2c株的G蛋白完整編碼區(qū)核苷酸序列(GenBank:AF042824.1)，在其核苷酸序列的5’端引入Bgl II位點，在3’端引入BamH I位點，并在保持氨基酸序列不變的條件下將第1335位的核苷酸G人工突變?yōu)锳，以消除基因內(nèi)部的Bgl II酶切位點。RV G基因的人工 合成由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。合成序列如下: 5，AGATCTACCATGGTTCCTCAGGTTCTTTTGTTTGTACTCCTTCTGGGTTTTTCGTTGTGTTTCGGGAAGTTCCCCATTTACACGATACCAGACAAACTTGGTCCCTGGAGCCCTATTGACATACACCATCTCCGCTGTCCAAATAACCTGGTTGTGGAGGATGAAGGATGTATCAACCTGTCCGGGTTCTCCTACATGGAACTCAAAGTGGGATACATCTCAGCCATCAAAGTGAACGGGTTCACTTGCACAGGTGTTGTGACAGAGGCAGAGACCTACACCAACTTTGTTGGTTATGTCACAACCACATTCAAGAGAAAGCATTTCCGCCCCACCCCAGACGCATGTAGAGCCGCGTATAACTGGAAGATGGCCGGTGACCCCAGATATGAAGAGTCCCTACAAAATCCATACCCCGACTACCACTGGCTTCGAACTGTAAGAACCACCAAAGAGTCCCTCATTATCATATCCCCAAGTGTGACAGATTTGGACCCATATGACAAATCCCTTCACTCAAGGGTCTTCCCTGGCGGAAAGTGCTCAGGAATAACGGTGTCCTCTACCTACTGCTCAACTAACCATGATTACACCATTTGGATGCCCGAGAATCCGAGACCAGGGACACCTTGTGACATTTTTACCAATAGCAGAGGGAAGAGAGCATCCAACGGGAACAAGACTTGCGGCTTTGTGGATGAAAGAGGCCTGTATAAGTCTCTAAAAGGAGCATGCAGGCTCAAGTTATGTGGAGTTCTTGGACTTAGACTTATGGATGGAACATGGGTCGCGATGCAAACATCAGATGAGACCAAATGGTGCTCTCCAGATCAGTTGGTGAATTTGCACGACTTTCGCTCAGACGAGATTGAGCATCTCGTTGTGGAGGAGTTAGTCAAGAAAAGAGAGGAATGTCTGGATACATTAGAGTCCATCATGACCACCAAGTCAGTAAGTTTCAGACGTCTCAGTCACCTGAGAAAACTTGTCCCAGGGTTTGGAAAAGCATATACCATATTCAACAAAACCTTGATGGAGGCTGATGCTCACTACAAGTCAGTCCGGACCTGGAATGAGATCATCCCCTCAAAAGGGTGTTTGAAAGTTGGAGGAAGGTGCCATCCTCATGTGAACGGGGTGTTTTTCAATGGTATAATATTAGGGCCTGACGACCGTGTCCTAATCCCAGAGATGCAATCATCCCTCCTCCGGCAACATATGGAGTTGTTGGAATCTTCAGTTATCCCCCTGATGCACCCCCTGGCTGACCCTTCTACAGTTTTCAAAGAAGGTGATGAGGCTGAGGATTTTGTTGAAGTTCACCTCCCCGATGTGTACAAACAAATCTCAGGGGTTGACCTGGGTCTCCCGAACTGGGGAAAGTATGTATTGATGACTGCAGGGGCCATGATTGGCCTGGTGTTGATATTTTCCCTAATGACATGGTGCAGAAGAGCCAATCGACCAGAATCGAAACAACGCAGTTTTGGAGGGACAGGGGGGAATGTGTCAGTCACTTCCCAAAGCGGAAAAGTCATACCTTCATGGGAATCATATAAGAGTGGAGGTGAGATCAGACTGTGAGGATCC3，(5 ’ 端下劃線部分為Bgl II酶切位點，3’端下劃線部分為BamHI酶切位點)將人工合成的RV G基因連接至pMD18-T載體獲得獲得重組質(zhì)粒pMD18T-RVG。以Bgl 11/BamH I雙酶切pMD18T_RVG后，回收1.5kb的G基因，插入到桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體 pFastBacl (Cat.N0.10360-014,購自 Invitrogen 公司)的 BamH I 位點，獲得重組質(zhì)粒pFastBac-RVG,在重組質(zhì)粒中RVG基因上游的Bgl II酶切位點消失，下游的BamH I繼續(xù)存在，進一步對其進行酶切鑒定和測序鑒定，證實無堿基誤配。3.轉(zhuǎn)移質(zhì)粒 pFastBac-RVG-poly (A)-CMV-EGFP 的構(gòu)建將pMD18T_poly (A)以Bgl 11/BamH I雙酶切后，回收poly (A)片段，插入真核表達質(zhì)粒 pcDNA3.1-EGFP 的 Bgl II 位點，獲得重組質(zhì)粒 pcDNA3.1-poly (A) -CMV-EGFP,并經(jīng)酶切鑒定證實構(gòu)建正確；以Bgl II/EcoRI雙酶切pcDNA3.1-poly (A) -CMV-EGFP,回收基因片段poly(A)-CMV-EGFP，插入pFastBac-RVG的BamH I/EcoR I位點，獲得重組質(zhì)粒pFastBac-RVG-poly (A)-CMV-EGFP，經(jīng)酶切驗證，酶切片段大小與預(yù)期大小一致(圖3)。4.轉(zhuǎn)移質(zhì)粒 pFa stBac-RVG-poly (A)-CMV-RVG 的構(gòu)建將pMD18T-poly(A)以Bgl 11/BamH I雙酶切后，回收基因片段poly (A)，插入真核表達載體pcDNA3.1的Bgl II位點，獲得重組質(zhì)粒pcDNA3.1-poly (A);以Bgl Π /EcoR
I雙酶切 pcDNA3.1-poly (A)，回收基因片段 poly (A)-CMV，將其插入 pFastBac-RVG 的 BamHI/EcoR I 位點，獲得重組質(zhì)粒 pFastBac-RVG-poly (A)-CMV。再以 Bgl Π /Sal I 雙酶切PMD18T-RVG,將切下的 RVG 片段回收并插入 pFastBac-RVG-poly (A) -CMV 的 BamH I/Sal I位點，獲得重組質(zhì)粒pFastBac-RVG-poly (A) -CMV-RVG,經(jīng)酶切驗證，酶切片段大小與預(yù)期大小一致(圖4)。實施例2:重組假型桿狀病毒疫苗的獲得以實施例1所構(gòu)建的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBac-RVG-poly (A)-CMV-EGFP和pFastBac-RVG-poly (A) -CMV-RVG包裝本發(fā)明中的重組假型桿狀病毒，詳細步驟如下:1.轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的轉(zhuǎn)座(I)取轉(zhuǎn)移質(zhì)粒 pFastBac-RVG-po Iy (A) -CMV-EGFP 和pFastBac-RVG-poly (A)-CMV-RVG 各 lng，分別加入兩管 DHlOBac 感受態(tài)(Cat.N0.12331-013,購自Invitrogen公司)中，輕輕混勻，冰浴30min。(2) 42°C水浴熱擊 45sec，再冰浴 2_5min。(3)加入900μ1的LB培養(yǎng)基(1 %胰蛋白胨，0.5 %酵母浸出物，1 % NaCl，pH
7.0),37 °C 225r/min 搖床復(fù)蘇 4h。(4)將上述復(fù)蘇菌液用LB培養(yǎng)基稀釋至10' 10_2、10_3，在每塊LB培養(yǎng)平皿(LB液體培養(yǎng)基中加入1.5%瓊脂粉，并含卡那霉素50 μ g/ml、慶大霉素7 μ g/ml、四環(huán)素10 μ g/ml、X-gal 100 μ g/ml和異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG) 40 μ g/ml)中加入上述稀釋液各100μ 1，涂布均勻；37°C培養(yǎng)48h，挑取白色克隆，在LB平皿上劃線純化，37°C培養(yǎng)過夜。2.重組Bacmid DNA的分離提取(I)挑取白色克隆于2ml LB培養(yǎng)基(含50 μ g/ml卡那霉素，7 μ g/ml慶大霉素，10 μ g/ml 四環(huán)素)，37°C搖床 250-300r/min 培養(yǎng) 24h 以上。(2)取1.5ml培養(yǎng)物于1.5ml EP管中，12000r/min離心lmin。棄上清液，然后加入 0.3ml 的溶液 I(15mM Tris-HCl, IOmM EDTA, 100 μ g/ml RNase)，輕輕吹打重懸細胞。(3)加入 0.3ml 溶液 II (0.2MNa0H, I % SDS)，輕輕混勻，室溫放置 5min。(4)緩緩加入0.3ml溶液III (3M KAc)，輕輕混勻，冰上放置5-lOmin。(5) 12000r/min室溫離心IOmin,期間另取一 2ml離心管，加入800 μ I異丙醇。(6)輕輕把上清液轉(zhuǎn)入含異丙醇的離心管，避免把白色沉淀帶入。輕輕倒轉(zhuǎn)離心管數(shù)次，冰上放置5min,室溫12000r/min離心15min。(7)棄上清，倒置離心管于吸水紙上吸干，然后加入70%乙醇洗滌沉淀，12000r/min室溫離心5min,棄上清。(8)使沉淀在空氣中自然干燥5-10min，加40 μ I TE溶液(ImM EDTA, IOmMTris-Cl,pH 8.0)溶解沉淀。3.重組假型桿狀病毒的獲得 (I)將形態(tài)良好、生長旺盛的Sf9細胞(購買自湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，CCTCC)接入6孔細胞培養(yǎng)板，2ml/孔，8 X IO5細胞/孔，室溫放置Ih使細胞貼壁。(2)配制昆蟲細胞轉(zhuǎn)染液:①取 8μ I 脂質(zhì)體 Cellfectin II (Cat.N0.10362-100，Invitrogen)加入 100 μ I 無血清 Grace，s (Cat.N0.10902-096, Invitrogen)液，潤旋混勻；②取I U g Bacmid DNA加入100 μ I無血清Grace’ s液,輕輕混勻；5min后，再將脂質(zhì)體Cellfectin II稀釋液和Bacmid DNA稀釋液輕輕混勻，室溫孵育25min。(3)將轉(zhuǎn)染混合液均勻滴入6孔板的細胞上，置27°C溫箱，5h。(4)棄掉6孔板中的轉(zhuǎn)染液，換為2ml的含10%胎牛血清(Cat.N0.10099-141，Invitrogen)的Grace’s生長液,繼續(xù)培養(yǎng)72h,待出現(xiàn)細胞病變后,收集細胞培養(yǎng)上清即可獲得第一代(Pl代)重組假型桿狀病毒，分別命名為BV-RVG/RVG和BV-RVG/EGFP，重組假型桿狀病毒結(jié)構(gòu)示意圖見圖6，該重組假型桿狀病毒在昆蟲細胞中引起的細胞病變圖見圖7。4.重組假型桿狀病毒疫苗的生產(chǎn)工藝重組假型桿狀病毒疫苗的生產(chǎn)工藝包括重組病毒的擴大、濃縮以及滴度測定。(I)重組假型桿狀病毒的擴增Pl代重組桿狀病毒的滴度較低，其滴度范圍一般為IX IO6-1X 107PFU/ml。繼續(xù)以0.1個感染復(fù)數(shù)(MOI)接種昆蟲細胞，3天后收獲病毒上清，能獲得滴度較高的P2代重組桿狀病毒，其滴度能達到I X IO7-1 X 108PFU/ml ;以P2代重組桿狀病毒為毒種，將每種重組桿狀病毒以0.1個MOI各接種8個T175細胞瓶的Sf9細胞，3天后收獲細胞上清(病毒液)。(2)重組假型桿狀病毒的濃縮將收獲的病毒液在4°C條件下，5000g離心15min，以除去細胞碎片；再將去除細胞碎片的病毒液轉(zhuǎn)移至加有3ml 25%鹿糖墊層的38ml超速離心管,24000r/min (Beckman,JS-24.38rotor)離心2h。病毒沉淀用PBS在4°C冰箱溶解過夜后，混勻并分裝凍存于_80°C冰箱。(3)重組假型桿狀病毒的滴度測定。用桿狀病毒專用滴度測定試劑盒測定重組假型桿狀病毒的滴度，詳細方法見試劑盒說明書(BacPAK Baculovirus Rapid Titer Kit User Manual, Cat.N0.631406,Clontech)。實施例3:重組假型桿狀病毒BV-RVG/EGFP轉(zhuǎn)導(dǎo)Hela細胞1.在6孔板中接種Hela細胞(購買自湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，CCTCC)，9X105細胞/孔，37°C培養(yǎng)lh，使細胞貼壁。2.用憐酸鹽緩沖液(PBS, 140mmol NaCl, 2.7mmo1 KCI , 10mmoI Na2HPO4,1.8mmoIKH2PO4, pH 7.4)洗細胞3次，以MOI = 50的劑量將重組假型桿狀病毒BV-RVG/EGFP以及野生型桿狀病毒(Wild type BV,購自Invitrogen公司)接入細胞中，27°C感作4h后棄掉上清，加入含5% FBS的DMEM培養(yǎng)基。3.將細胞置于37°C 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后，在熒光顯微鏡下觀察EGFP的表達，說明RVG蛋白修飾的假型桿狀病毒能高效轉(zhuǎn)導(dǎo)哺乳動物細胞，其熒光圖片見圖8。實施例4:本發(fā)明中重組假型桿狀病毒疫苗對小鼠免疫效力的生物學(xué)實驗1.BALB/c小鼠的免疫程序BALB/c小鼠分為4組，分別為BV-RVG/RVG免疫組、BV-RVG/EGFP免疫組、BV-VSVG-CMV-EGFP (BV-VSVG/EGFP,見文獻:Wu Q，F(xiàn)ang L, Wu X et al.A pseudotypebaculovirus-mediated vaccine confers protective immunity against lethalchallenge with H5N1 avian influenza virus in mice and chickens.Mol Immunol,2009,46:2210-2217)對照組和PBS對照組，每組10只，采用后腿肌肉注射，每只小鼠IOOy I (含IX IO8PFU的上述重組病毒)，共免疫2次，間隔3周。在首免后第3周和第5周經(jīng)尾靜脈負壓采血，分離血清，檢測RV特異性中和抗體和ELISA抗體。于二免后2周，斷頸處死實驗小鼠，無菌取出脾臟，利用淋巴細胞分離液(購自深圳達科為生物技術(shù)有限公司)分離脾淋巴細胞，進行細 胞免疫(IFN-Y)檢測。2.RV特異性ELISA抗體米用Saxena 等報道(Saxena S, Dahiya SS, Sonwane AA et al.A sindbis virusreplicon—based DNA vaccine encoding the rabies virus glycoprotein elicitsimmune responses and complete protection in mice from lethal challenge.Vaccine,2008,26:6592-6601)的RV特異性ELISA抗體檢測方法，檢測血清中特異性針對RV的ELISA抗體水平，結(jié)果表明，無論是在首次免疫后還是加強免疫后，BV-RVG/RVG疫苗組的ELISA抗體水平均最高，并且在加強免疫后迅速上升，達到較高水平，而表面僅展示有RV G蛋白的重組假型桿狀病毒BV-RVG/EGFP免疫組的ELISA抗體水平較低，加強免疫后上升緩慢，與BV-RVG/RVG疫苗組相比，差異顯著(P < 0.05，t-test)，BV-VSVG/EGFP對照組和PBS對照組未檢測到特異性ELISA抗體，實驗結(jié)果見圖9。3.RV特異性中和抗體米用Yuan 等報道(Yuan Z, Zhang S, Liu Y et al.A recombinant pseudorabiesvirus expressing rabies virus glycoprotein:safety and immunogenicity in dogs.Vaccine, 2008, 26:1314-1321)的RV特異性中和抗體檢測方法，檢測血清中特異性抗RV的中和抗體水平，結(jié)果表明，無論是在首次免疫后還是加強免疫后，BV-RVG/RVG疫苗組的中和抗體水平均較高，并且在加強免疫后上升迅速，達到較高水平，而表面僅展示有RV G蛋白的重組假型桿狀病毒BV-RVG/EGFP免疫組的中和抗體水平較低，在加強免疫后上升較慢，與BV-RVG/RVG疫苗組相比，差異顯著(P < 0.05，t-test)，BV-VSVG/EGFP對照組和PBS對照組未檢測到特異性中和抗體，實驗結(jié)果見圖10。4.ELSIA夾心法檢測脾淋巴細胞分泌的IFN- Y水平采用ELISA方法(龍振洲.醫(yī)學(xué)免疫學(xué)(第2版).人民衛(wèi)生出版社，2000年版)檢測小鼠脾淋巴細胞被特異抗原刺激后分泌IFN-Y的能力。結(jié)果表明本發(fā)明經(jīng)修飾改造后的重組假型桿狀病毒疫苗BV-RVG/RVG免疫組分泌IFN- Y水平要顯著高于重組桿狀病毒BV-RVG/EGFP 免疫組(P < 0.01, t-test)。此外，BV-VSVG/EGFP 對照組誘導(dǎo)的 IFN- Y 水平顯著高于PBS對照組(P <0.01，t-test)，說明桿狀病毒作為疫苗載體具有誘導(dǎo)非特異性細胞免疫的佐劑效應(yīng)，實驗結(jié) 果見圖11。
權(quán)利要求
1.株重組假型桿狀病毒BV-RVG/RVG，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，其保藏編號為CCTCC NO:V201022，其特征在于，該重組病毒具有表達狂犬病病毒G蛋白的雙表達盒，既含有Pph啟動子驅(qū)動狂犬病病毒G蛋白表達并使其展示在病毒粒子囊膜表面的昆蟲細胞表達盒PPH-RVG-poly (A)，又含有CMV啟動子驅(qū)動狂犬病病毒G蛋白在哺乳動物細胞中高效表達的哺乳動物細胞表達盒CMV-RVG-poly(A)，其中所述的狂犬病病毒G蛋白核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所不。
2.權(quán)利要求1所述的重組假型桿狀病毒BV-RVG/RVG制備的疫苗。
3.權(quán)利要求1所 述的重組假型桿狀病毒BV-RVG/RVG在制備狂犬疫苗中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求2所述疫苗在預(yù)防狂犬病中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于病毒學(xué)和基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種表達狂犬病病毒主要免疫原性糖蛋白(RVG)的重組假型桿狀病毒的構(gòu)建、疫苗制備及應(yīng)用。本發(fā)明得到的重組假型桿狀病毒含有雙表達盒，既含PPH啟動子驅(qū)動RVG表達并使其展示在病毒粒子囊膜表面的昆蟲細胞表達盒，又含CMV啟動子驅(qū)動RVG在哺乳動物細胞中高效表達的哺乳動物細胞表達盒。用該重組桿狀病毒制備的狂犬病疫苗具有亞單位疫苗和活病毒載體疫苗的雙重特性。免疫小鼠后，能刺激機體產(chǎn)生高水平的狂犬病病毒特異性ELISA抗體、中和抗體以及IFN-γ，具有潛在的疫苗應(yīng)用價值。該重組桿狀病毒BV-RVG/RVG保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，其保藏編號為CCTCC NOV201022。本發(fā)明還包含了該重組桿狀病毒疫苗的制備及應(yīng)用。
文檔編號A61P31/14GK103088063SQ201110349009
公開日2013年5月8日 申請日期2011年11月4日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月4日
發(fā)明者方六榮, 吳群峰, 肖少波, 于福來, 傅振芳, 陳煥春 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)