專利名稱：一種重組羧肽酶g2的藥物組合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物醫藥領域，特別涉及一種可提高藥物穩定性的重組羧肽酶G2藥物組合物凍干粉針制劑及其制備方法。
背景技術：
羧肽酶G2 (Carboxypeptidase G2，簡稱CPG^可水解葉酸C端谷氨酸殘基、葉酸的聚谷氨酰衍生物、葉酸類似物，例如氨甲喋呤(MTX)、以及葉酸的亞片段如對氨基苯甲酰谷氨酸(Chabner et al. 1972 ；Goldman 1975 ；Kalghatgl&Bertinol981)。CPG2 最初是從假單胞菌屬菌株RS-16中分離得到的一種細菌酶(Levy&Goldman 1967)，到80年代時在大腸桿菌中被克隆、純化(Minton，et al 1983)。羧肽酶G2水解MTX成無毒的非活性代謝物 2，4_二甲基-NlO-甲基蝶呤酸(DAMPA)和谷氨酸，兩者可以通過肝臟代謝，提供了一個非腎的MTX清除通道，減輕了腎臟毒性。MTX是葉酸的類似物，對二氫葉酸還原酶具有高度親和力，并對其有強大而持久的抑制作用。與二氫葉酸還原酶結合后，阻止二氫葉酸(ra2)還原為生理活性的四氫葉酸 (FH4)，使蛋白質和核酸的合成延遲或受阻，切斷細胞代謝途徑。合成的MTX自1948年已用于臨床(Bleyer 1978)，是用于治療腫瘤的多種化療藥物的重要成分。高劑量MTX (HD-MTX) 是很多腫瘤的一線治療藥物，通常以長時間輸注的方式給藥，經常用于治療非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性淋巴細胞白血病(ALL)以及軟組織腫瘤(如骨肉瘤)等。此外，MTX具有免疫調節效應，可用于如類風濕性關節炎(RA)、多發性硬化癥(MS)和牛皮癬的治療。MTX在發揮治療作用的同時，對人體正常細胞的毒性損傷非常強，其副作用包括粘膜毒性、骨髓抑制及肝腎臟損傷等。在早期研究中，應用高劑量MTX治療的患者中，10%出現了嚴重的毒性作用，死亡率達到6%。MTX及其代謝產物易堵塞腎小管，大劑量MTX會引發急性腎功能衰竭，結果導致MTX排泄延緩和MTX血藥濃度升高。實驗證明，MTX毒性反應的強度在很大程度上取決于細胞在超限濃度下所暴露的時間。目前，臨床上MTX高劑量化療所致的毒副作用，通常采用亞葉酸鈣進行解救。亞葉酸鈣與MTX競爭進入細胞、靶組織(骨髓、胃腸道上皮)，阻止MTX的作用，補償DNA合成代謝途徑，從而達到緩解HD-MTX引發的不良反應。MTX濃度升高時需要更高濃度的亞葉酸I丐， 但大劑量亞葉酸鈣同樣可解救腫瘤細胞，降低抗腫瘤效果。通過水化和堿化尿液增強MTX 的水溶性來降低腎毒性，可將毒性影響范圍降低到1. 5%，但仍會發生因清除延遲而致全身毒性。CPG2是目前被證明用于MTX大劑量治療的特異性解救藥，其可特異迅速裂解MTX為谷氨酸和2，4-二氨基-NlO-甲基蝶酸(DAMPA)，且不透過血-腦屏障(BBB)和細胞膜，因而不會抵消細胞內MTX的作用。谷氨酸和DAMPA可在肝代謝，因此CPG2治療實際上間接提供了一種肝解毒途徑。羧肽酶G2活性分子是一種鋅(Zn)依賴的同源二聚體蛋白質，亞單位分子量為 41400Da，具有較復雜的高級結構，且其高級結構對維持活性至關重要。CPG2是目前被證明用于MTX大劑量治療最有效的解救藥。重組的CPG2 (Glucarpidase，商品名Voraxaze)最初由ftOtherics Plc公司開發(2008年被BTG公司收購)，于2003年被美國和歐洲確定為罕見孤兒藥(Orphan Drug)，正處于新藥申報中，暫未獲準上市，臨床上用于MTX腫瘤化療的患者的解救。用量為50U/kg，以靜脈輸液泵在5min內輸入或者團注，可顯著降低MTX血藥濃度，避免臟器毒性。根據臨床試驗報告，血漿MTX清除可達到98%，將使MTX快速降到安全血藥難度下，對MTX蓄積引起的腎功能衰竭有很好的預防作用。與亞葉酸鈣比較，CPG2在解救途徑上與之完全不同，其顯著優勢表現在(1)CPG2不透過血腦屏障，不影響細胞內的MTX水平，不會減弱MTX的療效；(2) CPG2顯著降低MTX血藥濃度，清除率可達98%，從根本上清除MTX。而亞葉酸鈣只是補償核酸代謝的通暢，拮抗MTX對細胞的毒性，并不能降低MTX濃度；( CPG2將MTX 酶解為無活性、無毒、可通過肝臟排泄的代謝產物，避免了腎臟毒性，能幫助MTX導致腎毒性患者的腎功能恢復；(4)CPG2是解決MTX清除延遲唯一有效的方法。因此，CPG2將發展成為預防HD-MTX導致腎衰和MTX清除延緩的最有效治療方法(Daniel M Patterson&Siow Ming Lee, ExpertOpin. Biol.Ther.2010,10 (1) :105-111)。作為生物大分子，羧肽酶G2對溫度、光照、濕度等因素較傳統的小分子藥物更敏感；同時各種化學因素，如PH、離子強度、緩沖劑、保護劑等，對蛋白質的穩定性也有重大影響。這些因子的作用，可能導致蛋白變性、解聚等物理或化學變化，從而導致蛋白質生物活性的喪失，引起給藥藥效的變化。天然微生物來源的羧肽酶G2在動物體內特異性高，抗原性不強，但要開發用于人體的治療性藥物，羧肽酶G2必須配制成穩定的、無毒的藥物制劑形式。蛋白結構的多樣性決定了在藥物組成上有著不同的要求，同時，還需要滿足產業化生產方便、成本控制合理的要求。此外，為保證長期保存，對蛋白質進行冷凍干燥處理去除水分通常具有更好的穩定性。我公司在專利(申請號200910103526. 1)中已公開了重組羧肽酶G2的載體構建及制備方法。重組羧肽酶G2以大腸桿菌表達系統生產，產物以可溶方式表達，具有天然結構和生物活性，無需變性和復性；重組CPG2表達量不低于可溶蛋白的30%，最終得率為 500mg/L，顯著地高于已有研究報道(Sherwood etal. 1985)。該蛋白活性形式為非共價結合的同源二聚體，單體理論設計序列為390個氨基酸殘基(氨基酸序列見圖6所示)。目前，常用重組羧肽酶G2與乳糖組成藥物組合物，由于乳糖作為凍干制劑有以下缺陷BTG公司產品說明書記載了用乳糖作為凍干制劑，但在保存和冷凍干燥過程中，蛋白質和還原性的乳糖易發生梅拉德反應(Maillard反應)導致純度降低，影響藥效的內容 (見 Withdrawal assessment report for Voraxaze，EMEA/CHMP/171907/2008)。同時鑒于乳糖中所含雜蛋白的潛在風險和在亞洲人群中不耐性等安全性問題，因此，有必要尋求其他輔料用于羧肽酶G2注射劑。到目前為止，尚沒有一種適合羧肽酶G2穩定保存和便于臨床應用的制劑報道。

發明內容
本發明的目的是提供一種重組羧肽酶G2的藥物組合物，所述組合物藥物穩定性高，便于保存，方便臨床使用。本發明所提供的重組羧肽酶G2藥物組合物，包括重組羧肽酶G2、藥學可接受的賦型劑和穩定劑、含有金屬離子的不揮發性緩沖溶液，其中活性成分為羧肽酶G2。
其中，每ml重組羧肽酶G2藥物組合物溶液中，活性成分重組羧肽酶G2為500 2000U，重量體積比(w/v)為3 6%的賦型劑30 60mg，1 3%的穩定劑10 30mg，含有二價鋅離子的Tris-HCl緩沖溶液使重組羧肽酶G2藥物組合物溶液中的pH值為6. 8 7. 8。所述的賦型劑為多羥基醇。所述的多羥基醇為甘露醇或山梨醇。所述的穩定劑為糖類。所述的糖類為蔗糖、乳糖、海藻糖、葡萄糖中一種或幾種。所述的糖類優選蔗糖。所述含有二價鋅離子的不揮發性Tris-HCl緩沖溶液為含有0. 1 0. 5mM 二價鋅離子的PH值為7. 3 士 0. 5的Tris-HCl緩沖溶液。所述二價鋅離子溶液選自氯化鋅或硫酸鋅溶液。本藥物制劑通過以下步驟實現1、經過最終純化、符合臨床用藥要求的重組羧肽酶G2原液(純度> 98% )，與重量體積比計3 6%的賦型劑和1 3%的穩定劑、緩沖溶液等配制成半成品，其中重組羧肽酶 G2 活性成分 500U/ml、1000U/ml、1500U/ml 和 2000U/ml，優選 1000U/ml ；2、進一步將制成的半成品溶液，進行除菌過濾，1. Iml/支分裝入干烘滅菌的3ml 西林瓶中；3、以凍干劑水分含量、成型度為考察指標，確定優化的冷凍干燥程序，凍干成粉針劑，并壓蓋封裝；對以上凍干制劑，按照《中國藥典2010版第二部》中藥物制劑穩定性試驗指導原則進行試驗，考察不同溫度、不同影響因素條件下的活性保持和純度變化情況。本發明所述藥物組合物選用以無菌水配制的Tris-HCl作為緩沖劑，緩沖范圍 7. 3士0. 5，其中添加0. 1 0. 5mM Zn2+，其中二價鋅離子較優的濃度為0. 2mM。本發明所述的二價鋅選自硫酸鋅或氯化鋅溶液中的一種。羧肽酶G2活性分子為同源二聚體，其活性需要Zn2+。每個酶分子包含4個Si2+。Si2+對于維持蛋白活性起著重要作用。通過尺寸排阻HPLC和還原性SDS-PAGE分析可知，該蛋白表觀分子量分別為83KD和 42. 0KD，顯示出該蛋白具有天然的同源二聚體結構，分子間的疏水相互作用可能是維持其高級結構的重要因素之一。經實驗驗證，本發明所述的藥物組合物，在無菌條件下，將含有醫學有效劑量的重組羧肽酶G2、藥用輔料及緩沖溶液分裝為1. Iml/支在3ml西林瓶中，利用冷凍干燥技術凍干成具有一定形狀的、能迅速復溶的疏松粉塊，因此方便臨床使用和儲存、運輸等。本制劑中賦型劑選自甘露醇或山梨醇，優選甘露醇，含量范圍為3 6%。它作為保護劑及凍干過程中的膨化劑，容易形成良好的骨架，且不影響藥物體內生理活性，對機體不會產生任何過敏反應和無毒副作用等優勢，是理想的凍干賦型劑。作為凍干保護劑的糖，可以選擇葡萄糖、α-D-吡喃甘露糖、蔗糖、乳糖、海藻糖、纖維二糖、甘露糖、麥芽糖、肌糖、棉白糖、菊糖、右旋糖酐、麥芽糖糊精、麥芽多糖等，糖在水性組合物中可作為凍干支持結構，有效防止蛋白質在凍干過程中失水時的變性。乳糖既可與甘露醇合用，也可單獨作為凍干賦型劑和穩定劑，其含量濃度為5%。本制劑中，優選蔗糖，其含量在1 3%范圍，可有效保護目的蛋白。本發明的有益效果是通過優選的制劑配方和制備工藝，提供一種水分含量不超過3%的、無菌粉末狀制劑。該制劑在2 8°C條件下，活性成分和純度可穩定保持M個月，能滿足臨床使用對藥物制劑的要求，且具有生產簡單、成本低廉、使用方便等優點，為今后藥物的臨床研究及上市提供基礎。本發明制劑中加入的緩沖劑，除了保證藥物穩定性要求(或高級結構)外，接近生理pH環境，有利于在體內發揮生理活性，同時對人體不會產生過敏及增加新的毒副作用。按照BTG公司有關VORAXAZE 的藥品說明書規定，本藥物制劑以常規的生理鹽水(0.9%氯化鈉)復溶后即可靜脈推注使用，制劑生產規格1000U/支，同時可根據患者體重調整臨床使用量。用于HD-MTX化療過程中MTX中毒或高危患者解救的臨床劑量為50U/ kg,以靜脈輸液泵在5min內輸入或者團注，可顯著降低MTX血藥濃度，避免臟器毒性。


圖1是實施例4所述發明藥物組合物2 8°C保存條件下高效液相色譜純度和生物活性分析；圖2是實施例5所述發明藥物組合物2 8°C保存條件下高效液相色譜純度和生物活性分析；圖3是實施例6所述發明藥物組合物2 8°C保存條件下高效液相色譜純度和生物活性分析；圖4是實施例7所述發明藥物組合物2 8°C保存條件下高效液相色譜純度和生物活性分析；圖5是實施例4-7所述發明藥物組合物25 °C加速試驗條件下SDS-PAGE純度分析；圖6是本制劑中活性成分羧肽酶G2氨基酸序列。
具體實施例方式下面結合具體實施例，對本發明作進一步闡述。應該理解，此處所描述的具體實施例僅用以解釋本發明，但并不是對本發明的限定。本發明的藥物組合物為凍干粉末形式，其中所述的緩沖溶液、賦型劑、穩定劑、輔助金屬離子等均采用藥用級輔料配制，可以通過市售獲得。本發明涉及的藥物組合物中的活性成分是重組羧肽酶G2，來源于基因工程手段獲得的重組蛋白質，通過大腸桿菌可溶表達獲得，表達量高，純化工藝簡單高效，具體參見專利(申請號:200910103526. 1)。本發明賦型劑選用甘露醇。甘露醇具有不易吸濕，流動性好的特點，易于形成膨松的骨架結構。同時，化學穩定性好，與羧肽酶G2不發生相互作用，可用作蛋白質活性保護劑；亦對人體無過敏和毒副作用。本發明的藥物組合物選用蔗糖或乳糖作為凍干保護劑，基于蔗糖為多羥基雙糖， 能代替水分子同蛋白質表面部分結合，且具有較高的玻璃化溫度，故對組織蛋白質二級結構的改變、凍干處理過程中及儲藏期內蛋白質多肽鏈的伸展和聚集起著顯著作用。乳糖也普遍地用于各種制劑的賦型劑，并已在注射級乳糖方面形成嚴格的質量標準，最大限度控制生產過程中的外源蛋白。本發明中所提供的重組羧肽酶G2凍干制劑中，羧肽酶G2氨基酸序列見圖6所示。 在具體實施方案中，賦型劑甘露醇終濃度為3 6% (W/V)，保護劑蔗糖和乳糖的終濃度分別為 1 3%禾口 5% (W/V)，含 0. 2mM ZnCl2 的 pH 為 7. 3士0. 5 的緩沖。實施例1 賦型劑濃度對制劑成型、溶解度的影響甘露醇和山梨醇兩種賦型劑在不同濃度條件下，凍干品的成型度及復溶的溶解度考察。具體實驗過程為以含有0. 2mM ZnCl2的pH為7. 3的25mM Tris-HCl緩沖溶液配制濃度為20%的甘露醇和山梨醇；分別取5ml羧肽酶G2原液QOOOU/ml)和一定量的甘露醇或山梨醇母液(0ml、0. 5ml、l. OmlU. 5ml,2. 0ml,2. 5ml、3ml、3. 5ml,4. 0ml,5. 0ml)，以上述Tris-HCl緩沖液定容至10ml，得到含不同濃度賦型劑的1000U/ml羧肽酶G2溶液，按 1. Iml/支分裝，凍干；在25°C條件下，放置20天后，每支樣品以Iml注射用水復溶，觀察溶解性，并進行RP-HPLC分析1、甘露醇對制劑穩定性影響
權利要求
1.一種重組羧肽酶G2藥物組合物，包括重組羧肽酶G2、藥學可接受的賦型劑和穩定劑、含有金屬離子的不揮發性緩沖溶液，其中活性成分為羧肽酶G2。
2.根據權利要求1所述的重組羧肽酶G2，其特征在于每ml重組羧肽酶G2藥物組合物溶液中，活性成分重組羧肽酶G2為500 2000U，重量體積比(w/v)為3 6 %的賦型劑 30 60mg，1 3%的穩定劑10 30mg，含有二價鋅離子的Tris-HCl緩沖溶液使重組羧肽酶G2藥物組合物溶液中的pH值為6. 8 7. 8。
3.根據權利要求1或2所述的重組羧肽酶G2藥物組合物，其特征在于所述的賦型劑為多羥基醇。
4.根據權利要求3所述的重組羧肽酶G2藥物組合物，其特征在于所述的多羥基醇為甘露醇或山梨醇。
5.根據權利要求1或2所述的重組羧肽酶G2藥物組合物，其特征在于所述的穩定劑為糖類。
6.根據權利要求5所述的重組羧肽酶G2藥物組合物，其特征在于所述的糖類為蔗糖、乳糖、海藻糖、葡萄糖中一種或幾種。
7.根據權利要求6所述的重組羧肽酶G2藥物組合物，其特征在于所述的糖類為蔗糖。
8.根據權利要求2所述的重組羧肽酶G2藥物組合物，其特征在于所述含有二價鋅離子的不揮發性Tris-HCl緩沖溶液為含有0. 1 0. 5mM 二價鋅離子的pH值為7. 3士0. 5的 Tris-HCl緩沖溶液。
9.根據權利要求2所述的重組羧肽酶G2藥物組合物，其特征在于所述二價鋅離子溶液選自氯化鋅或硫酸鋅溶液。
全文摘要
本發明涉及一種重組羧肽酶G2藥物組合物。本藥物組合物包含醫學有效劑量的重組羧肽酶G2蛋白、穩定劑、賦型劑及調節制劑pH值使其保持最佳生理活性的不揮發性緩沖劑。每ml重組羧肽酶G2藥物組合物溶液含500-2000U重組羧肽酶G2，按重量體積比計3％～6％的賦型劑和按重量體積比計1％～3％的穩定劑，調節pH范圍6.8～7.8的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩沖劑及0.1-0.5mM氯化鋅。本所述的重組羧肽酶G2凍干粉針制劑的有益效果體現在在2-8℃保存條件下，活性保持可達24個月，并保持天然二聚體活性結構。本制劑為無菌，可通過靜脈注射發揮藥理作用。
文檔編號A61P39/02GK102552890SQ20111036368
公開日2012年7月11日 申請日期2011年11月16日 優先權日2011年11月16日
發明者于廷和, 但國平, 張偉, 張勇, 曹莉君, 李曉麗, 李樹剛, 柴新娟, 辛渝, 龔會英 申請人:重慶科潤生物醫藥研發有限公司