一種蠶蛹蛋白源血管緊張素轉換酶抑制多肽及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種蠶蛹蛋白源血管緊張素轉換酶抑制 多肽及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002] 血管緊張素轉換酶(Angotensin Converting Enzyme，ACE)是一種存在于不同組 織里的多功能胞外含鋅二羧肽酶，能被氯離子激活并具有較寬的底物特異性。它在腎素-血 管緊張素系統（Renial Angiotensin System，RAS)和激肽酶-激肽系統（Kallikrein-Kinin，KKS)具有重要和關鍵的生理功能。它的主要作用是把血管緊張素 I (Angiotensin I Converting Enzyme)車專化成血管緊張素 II(Angiotensin II Converting Enzyme)，同時還 會使血管舒緩激肽失活，最終導致人體血壓升高。
[0003] 血管緊張素轉換酶抑制多肽是由數個氨基酸組成具有生物活性的多肽，并且對 ACE活性區域具有較強親和力的抑制劑，它們與ACE的親和力比血管緊張素 I或舒緩激肽更 強，而且也較不容易從ACE結合區釋放，降低ACE活性或使其失去活性，從而阻礙ACE催化血 管緊張素 I轉化成血管緊張素 II，以及阻礙ACE水解舒緩激肽成為失活片段，從而達到降低 血壓的作用。
[0004]公開于該【背景技術】部分的信息僅僅旨在增加對本發明的總體背景的理解，而不應 當被視為承認或以任何形式暗示該信息構成已為本領域一般技術人員所公知的現有技術。

【發明內容】

[0005] 本發明的目的是提供一種蠶蛹蛋白源血管緊張素轉換酶抑制多肽，其從蠶蛹蛋白 的水解產物中提取得到，其具有明顯的ACE抑制活性，為制備降血壓藥物提供理論指導。
[0006] 本發明提供了一種蠶蛹蛋白源血管緊張素轉換酶抑制多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0007] 本發明還提供了所述的蠶蛹蛋白源血管緊張素轉換酶抑制多肽的制備方法，包括 如下步驟：
[0008] (1)將冷凍蠶蛹按照1:3的比例加入到蒸餾水中，勻漿攪拌lh后過濾，重復3次;合 并濾液，濾液在l〇〇°C水浴條件下加熱30min至蛋白變性，再調節pH為3.0使蛋白沉降，蛋白 溶液在4°C條件下靜置12h，使蛋白充分沉淀與溶液分層，隨后高速冷凍離心4°C、8000r/min 離心45min去除上清液，收集沉淀，干燥，即得到蠶蛹粗蛋白粉；
[0009] (2)將蠶蛹粗蛋白粉按照質量比1: 50加入到蒸餾水中，完全溶解，然后加入1.5 % 的中性蛋白酶，在pH為7.0,溫度為50°C條件下進行酶解，酶解時間為3h;酶解完成后在90°C 水浴滅活l〇min，水解液離心后取上清液；用截留分子量為5KDa超濾膜過濾，將超濾透過液 冷凍干燥，得到凍干粉末；
[0010] (3)將步驟⑵中得到的凍干粉末溶解在濃度為〇. 〇 lmo 1/L，pH為8.5的磷酸鹽緩沖 液中；以1 .OmL/min的速度上樣于平衡好的陰離子交換樹脂色譜柱，用磷酸鹽緩沖液洗柱至 在220nm處吸收峰回到基線，洗脫流速為1. OmL/min;用NaCl溶液對樣品進行梯度洗脫，洗脫 流速為1. OmL/min，洗脫梯度為0-1. Omg/mL;按照時間段收集各個組分進行冷凍干燥并檢測 活性，在-20°C條件下保存；
[0011] (4)將步驟（3)中活性最好的凍干粉末上樣于平衡好的Sephadex G-15凝膠色譜 柱，以水為流動相進行洗脫，洗脫流速為1.OmL/min;檢測波長為280nm;按照時間段收集各 個組分進行冷凍干燥并檢測活性，在_20°C條件下保存；
[0012] (5)將步驟(4)中活性最好的凍干粉末溶解在超純水中，進行反相高效液相色譜分 離，流動相，A相:含0.1 %三氟乙酸的純水;B相：乙腈;檢測波長為220nm，分段收集各個組分 進行冷凍干燥并檢測活性，在_20°C條件下保存；
[0013] (6)將步驟(5)得到的活性最好的凍干粉末再次經過反相高效液相色譜分離，流動 相，A相：含0.1 %三氟乙酸的純水；B相：乙腈；檢測波長為220nm，收集保留時間為19.0-21.5min的組分進行冷凍干燥，即得血管緊張素轉換酶抑制多肽。
[00?4]作為優選，步驟(5)中所述的乙腈進行梯度洗脫，其濃度在0-60min時間內從5 %上 升為30%。
[0015]作為優選，步驟(6)中所述的乙腈的濃度為7%。
[0016] 本發明還提供了所述的蠶蛹蛋白源血管緊張素轉換酶抑制多肽在制備降血壓藥 物中的應用。
[0017] 本發明還提供了所述的蠶蛹蛋白源血管緊張素轉換酶抑制多肽在制備食品中的 應用。
[0018] 本發明還提供了所述的蠶蛹蛋白源血管緊張素轉換酶抑制多肽在制備保健品中 的應用。
[0019] 與現有技術相比，本發明具有如下有益效果：
[0020] (1)本發明從蠶蛹蛋白的水解產物中分離得到了一種具有ACE抑制活性的血管緊 張素轉換酶抑制多肽，為治療高血壓的食品、藥物或保健品的開發利用提供了一種全新的 途徑。
[0021] (2)本發明的原料來源于絲綢工業的副產物蠶蛹，其資源豐富、價格低廉，具有非 常廣泛的應用前景。
【附圖說明】
[0022] 圖1為本發明的蠶蛹蛋白源血管緊張素轉換酶抑制多肽的制備方法中的離子交換 色譜圖及各組分抑制率圖。
[0023] 圖2為本發明的蠶蛹蛋白源血管緊張素轉換酶抑制多肽的制備方法中的凝膠色譜 圖及各組分抑制率圖。
[0024] 圖3為本發明的蠶蛹蛋白源血管緊張素轉換酶抑制多肽的制備方法中的第一次反 相高效液相色譜圖。
[0025] 圖4為本發明蠶蛹蛋白源血管緊張素轉換酶抑制多肽的制備方法中的第二次反相 高效液相色譜圖。
[0026] 圖5為本發明制備的蠶蛹蛋白源血管緊張素轉換酶抑制多肽在不同的貯藏溫度下 含量變化圖。
[0027] 圖6為本發明制備的蠶蛹蛋白源血管緊張素轉換酶抑制多肽在不同的貯藏溫度下 對ACE抑制率的變化圖。
[0028] 圖7為本發明制備的蠶蛹蛋白源血管緊張素轉換酶抑制多肽在人工模擬消化后含 量變化圖。
[0029] 圖8為本發明制備的蠶蛹蛋白源血管緊張素轉換酶抑制多肽在人工模擬消化后對 ACE抑制率的變化圖。
【具體實施方式】
[0030] 下面結合具體實施例，對本發明作進一步詳細的闡述，但本發明的實施方式并不 局限于實施例表示的范圍。這些實施例僅用于說明本發明，而非用于限制本發明的范圍。此 外，在閱讀本發明的內容后，本領域的技術人員可以對本發明作各種修改，這些等價變化同 樣落于本發明所附權利要求書所限定的范圍。
[0031 ]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0032]下述實施例中所以用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0033]實施例1:血管緊張素轉換酶抑制多肽的制備
[0034] (1)將冷凍蠶蛹按照1: 3的比例加入到蒸餾水中，勻漿攪拌lh后過濾，重復3次;合 并濾液，濾液在100°c水浴條件下加熱30min至蛋白變性，再調節pH為3.0使蛋白沉降，蛋白 溶液在4°C條件下靜置12h，使蛋白充分沉淀與溶液分層，隨后高速冷凍離心4°C、8000r/min 離心45min去除上清液，收集沉淀，干燥，即得到蠶蛹粗蛋白粉；
[0035] (2)將蠶蛹粗蛋白粉按照質量比1:50加入到蒸餾水中，然后往溶液中加入1.5 %的 中性蛋白酶，在pH為7.0、溫度為50°C條件下進行酶解，酶解時間為3h;酶解完成后在90°C水 浴滅活lOmin，水解液離心后取上清液；用截留分子量為5kDa超濾膜過濾，將超濾透過液冷 凍干燥，得到凍干粉末；
[0036] (3)將步驟(2)中得到的粉末溶解在濃度為0.0 lmo 1 /L、pH為8.5的磷酸鹽緩沖液 中；以1 .Omg/mL的速度上樣于平衡好的的D201陰離子交換樹脂色譜柱（10X300mm)，用磷酸 鹽緩沖液洗柱至在220nm處吸收峰回到基線，洗脫流速為1.0mg/mL;用NaCl溶液對樣品進行 梯度洗脫，洗脫流速為1. Omg/mL，洗脫梯度為0-1. Omg/mL;收集各個組分進行冷凍干燥并檢 測活性(見圖1)，在_20°C條件下保存；
[0037] (4)將步驟(3)得到的活性最好的凍干粉末（即組分IE1)上樣于平衡好的Sephadex G-15凝膠色譜柱（20 X 500mm)，以水為流動相進行洗脫，洗脫流速為1 .Omg/mL;檢測波長為 280nm;收集各個組分進行冷凍干燥并檢測活性(見圖2)，在-20°C條件下保存；
[0038] (5)將步驟(4)得到的活性最好的凍干粉末（即組分GF2)溶解在超純水中，進行反 相高效液相色譜進行分離。流動相，A相：純水(含0.1 %三氟乙酸）；B相：乙腈，在0-60min時 間內進行梯度洗脫，乙腈濃度為5-30%;檢測波長為220nm，收集各個組分(見圖3、表1)進行 冷凍干燥并檢測活性，在_20°C條件下保存。
[0039]表1第一次高效反相液相色譜分離各組分抑制活性(樣品濃度0.006mg/mL)
[0040]

[0041 ]表2第二次高效反相液相色譜分離各組分抑制活性(樣品