專利名稱：敬釗毒素-v在制備抗認知、學習記憶功能障礙藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及多肽物質在藥品制備中的用途，特別涉及一種敬釗纓毛蛛毒素-敬釗毒素-V在制備抗認知、學習記憶功能障礙藥物中的應用。
背景技術：
中國專利，ZL200610031864. 5申請公開了從蜘蛛敬釗纓毛蜘蛛(Chilobrachys jingzhao)粗毒中純化得到的一種新型肽類神經毒素，即敬釗毒素-V(JZ-V)。 JZ-V由四個氨基酸殘基組成，分子中6個半胱氨酸形成3對二硫鍵，一級結構為 YCQKWMWTCDSKRACCEGLRCKLWCRKII。CN101^8138A號專利公開了 JZ-V在制備鎮痛藥物中的應用；CN101543624A號專利公開了 JZ-V在制備戒毒藥物中的應用。至今未見敬釗毒素-V 在制備抗認知、學習記憶功能障礙藥物中的應用的相關報道。

發明內容
本發明實施例的目的是針對上述現有技術的缺陷，提供一種敬釗毒素-V在制備抗認知、學習記憶功能障礙藥物中的應用。為了實現上述目的本發明采取的技術方案是本發明的一個方面，涉及JZ-V提高哺乳動物神經突觸可塑性的用途。具體是指 JZ-V可顯著提高高頻刺激HFS (High frequency stimulation)所誘導的海馬長時程增強效應(long-term potentiation，LTP)，增強 LTP 的誘導相。本發明中，HFS(100HZ，10 串，5 組波寬為0.2ms的方波刺激)很接近動物海馬θ節律自發活動的方式，能有效誘導海馬齒狀回LTP的形成。增強LTP的誘導相是指在HFS施與之前20分鐘予以JZ-V，可大大增強群峰電位(population spike,PS)的幅度，并維持至少1. 5小時。JZ-V通過增強LTP的誘導相， 可顯著改善哺乳動物認知功能障礙和學習記憶功能障礙，提高癡呆模型動物的空間學習記憶能力和被動回避能力等學習記憶能力。避暗實驗的結果證明JZ-V可顯著延長癡呆動物錯誤潛伏期，減少錯誤次數；在Morriss水迷宮試驗中，結果表明JZ-V可縮短癡呆動物尋找到安全島的游泳時間和游泳路程，在定位航行測試結束后，撤除平臺進行空間探索實驗中， JZ-V可明顯改善癡呆動物對平臺的空間記憶，在原安全島所在象限游泳的路程比率和時間明顯升高。本發明的一個方面，涉及JZ-V在制備預防、緩解和/或治療阿爾茨海默氏病或癥狀以及能引發認知功能障礙和/或學習記憶功能障礙的疾病的藥物中的應用。本發明中，所述預防、緩解和/或治療中的預防是指在出現阿爾茨海默氏病之前， 抑制認知功能和學習記憶障礙病癥的發生；所述緩解是指在出現阿爾茨海默氏病發病過程中改善認知功能和學習記憶障礙；所述治療是指在出現阿爾茨海默氏病之后或發病過程中，實現臨床意義上的改善認知功能和學習記憶功能障礙。更具體的，本發明所述預防、緩解和/或治療阿爾茨海默氏病或癥狀是預防、緩解和/或治療針對疾病導致的認知功能和學習記憶障礙。本發明的另一方面，涉及一種用于預防、緩解和/或治療能引發認知功能障礙和/ 或學習記憶功能障礙的疾病，如阿爾茨海默氏病或癥狀的藥物組合物，所述藥物含有預防或治療有效量的JZ-V以及適量任選的藥學可接受的載體和/或輔料。在本發明中，根據施用途徑，所述藥物的劑型選自溶液劑、懸液劑、乳劑、丸劑、膠囊劑、粉末劑、控制釋放劑或持續釋放制劑。這些制劑將含有預防或治療有效量的JZ-V，優選為純化形式的JZ-ν，也可以是其藥學可接受的鹽，以及制備這些制劑所需適量的藥學可接受的載體和/或輔料。劑型的選擇應當適合于對患者給藥的形式。本發明的JZ-V藥物可以通過任何常規方法用一種或多種藥學可接受的載體和/ 或賦形劑來配制成各種劑型，使之適用于對受試者施用的幾種途徑，其中包括但不限于胃腸外、經口、局部、皮內、肌肉內、皮下、鼻內、中樞或外周神經直接給予途徑。因此，本發明所用的JZ-V或其藥學可接受的鹽可以特別配制為例如吸入或吹入 (通過口和鼻)或經口含化、胃腸外或直腸給藥、局部椎管給藥的劑型。JZ-V可采用帶電荷的、中性和/或其他藥學可接受的鹽的形式，包括鹽酸鹽，枸櫞酸鹽，檸檬酸鹽等一切藥學可接受的鹽的形式。藥學可接受的載體例子包括但不限于“Remington，s Pharmaceutical Sciences (A. R. Gennaro Ed.), 20th edition, Williams & Wilkins PA，USA OOOO) ” 中所述的內容。本發明中所用的JZ-V為白色粉末狀產品，可通過已知方法制備得到。已知方法制備參考以下文獻1.曾雄智，鄧梅春，孫正華，王賢純，梁宋平.敬釗毒素-V的合成、復性及其鉀通道活性鑒定，中國生物化學與分子生物學報，2008，M (5) =463-468 ；2.肖玉成，梁宋平.海南捕鳥蛛毒素-V分離純化及其抑制河豚毒敏感型鈉通道活性研究.動物學研究，2002，23 (3) :200-205。本發明的化學法制備的敬釗纓毛蜘蛛毒素提取物-JZ-V在改善學習記憶的行為學和提高神經可塑性作用的藥物中的應用，特別是在制備改善認知功能和/或學習記憶功能的藥物和/或藥物組合物中的應用，使該藥物和/或藥物組合物可用于預防、緩解和/或治療能引發認知功能和/或學習記憶功能障礙如阿爾茨海默氏病(Alzheimer's disease, AD)等疾病或癥狀。JZ-V能顯著提高大鼠海馬突觸傳遞效應，使其突觸傳遞通路LTP的誘導呈顯著性增強。在被動回避能力行為學試驗中，JZ-V可顯著延長癡呆動物錯誤潛伏期，減少錯誤次數。在Morriss水迷宮試驗中，JZ-V可顯著縮短癡呆動物尋找到安全島的游泳時間和游泳路程，在定位航行測試結束后，撤除平臺進行空間探索實驗，JZ-V可明顯改善癡呆動物對平臺的空間記憶，在原安全島所在象限游泳的路程比率和時間較Αβ 1-42模型組明顯升高。 臨床一線癡呆治療藥物多奈哌齊在本實驗中為陽性對照藥，研究結果顯示JZ-V對于學習記憶障礙的治療效果的多項指標優于或與多奈哌齊相齊平。


圖1為誘發電位的指標測定圖；圖2小鼠Morris水迷宮裝置示意圖3aJZ-V10nmOl Γ1)對基礎突觸傳遞的影響圖；圖!BbJZ-VIOOnmol L—1)對基礎突觸傳遞的影響圖；圖4a為JZ-V IOnmol L-1對LTP誘導相的作用圖；圖4b為JZ-V IOOnmol L—1對LTP誘導相的作用圖；圖如為圖如和圖4b的合并比較圖示。
具體實施例方式為使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將結合附圖對本發明實施方式作進一步地詳細描述。實施例1JZ-V提高LTP誘導形成的作用1.實驗材料實驗動物SD雄性大鼠，250士20g，由中國藥品生物制品檢定所提供，質量合格證 SCXK(京)2010-008。手術前將動物飼養于SPF級動物房，自然采光，室溫22士2°C，自由攝食飲水，適應環境7天后進行手術。實驗大鼠分成三組對照組，JZ-V IOnmol I^+HFS組和 JZ-V IOOnmol L_1+HFS 組，每組 6 只。實驗儀器=VC-Il記憶示波器(Nihon Koden,日本)；SEN-7203三道電子刺激器(Nihon Koden,日本)；SS-202J刺激隔離器(Nihon Koden,日本)；SR-6N立體定位儀 (Narishige,日本)2.實驗方法2. 1電極的埋植將SD大鼠手術前稱重，體重200 士 20g。以腹腔注射20%烏拉坦麻醉(1. Og/kg)，固定于SR-6N立體定位儀上使頭顱保持水平，用75%酒精消毒皮膚，剪去耳后及頭頂部毛后，沿顱骨正中線縱向切開皮膚，用脫脂棉推開皮下組織并用3% H2O2清除骨膜，充分暴露顱骨，使骨縫清晰。參照George I^axinos，ChariesWatson大鼠腦立體定位圖譜[92]，使用SR-6N立體定位儀定坐標為前囟后0. 8mm，矢狀縫旁1. 8mm，硬腦膜下3. 5mm, 以骨鉆打開顱骨，將脫脂棉清除骨屑后以針頭小心挑破硬腦膜。以此為腦室給藥進針位點。 以同樣的方法埋植刺激電極和記錄電極。刺激電極定位坐標為AP 7. 5-7. 8，L 4. 4-4. 6，H 3. 5-4. O ；記錄電極坐標為=AP 3. 7-4. 0，L 2. 4-2. 7，H 3. 0-3. 5。根據已定位坐標的位置， 先將給藥簍管及記錄電極放入所在腦區，然后以固定的強度進行刺激(SEN-7203三道電子刺激器，SS-202J刺激隔離器)，記錄誘導出的群峰電位，慢慢調整刺激電極和記錄電極的位置，直到誘導出最大群峰電位。然后給予不同強度的電刺激，記錄誘發的動作電位，得到輸入輸出曲線。以引起最大興奮性突觸后電位的1/2-1/3的刺激電流強度作為檢測刺激強度，之后將刺激電極固定。2. 2誘發電位的記錄和幅值的計算方法誘發電位的記錄實驗中計算出的PS幅度作為DG顆粒細胞群興奮性的指標。記錄PS是采用細胞外記錄法。測試刺激頻率為l/30HZ(SEN-7203三道電子刺激器，SS-202J 刺激隔離器)，采用引起最大PS幅度所需刺激強度的1/2-1/3的電流強度作為測試刺激強度，整個實驗過程中測試刺激強度參數恒定不變。記錄信號經多道生理信號采集處理系統進行采集、放大，并在多媒體計算機中顯示和儲存。
參見圖1，其中，a =PS的起始點(第一個正相峰的端點)，b =PS的點(第二個正相峰的端點)c :PS, d 經過c點的垂線與ab點連線的交點。dc =PS峰的幅度。PS幅度計算方法實驗中以PS幅度相對值(％ )為觀測指標，觀察其給藥后的增幅情況。其測定方法是，以HSF前30min的測定作為基線的測定，各測6個時間點(每隔 5min測一個時間點)，計算6個時間點幅度值PS幅度的平均值。將給藥前30min所記錄的 6個時間點PS幅度值的平均值作為自身基礎突觸傳遞水平(自身基礎幅值)，并以此PS均值為100%。用給藥后所測各時間點的PS幅度值除以基線的6個時間點的PS平均值，得到各時間點的PS幅度相對值。高頻刺激參數誘發LTP的高頻刺激為100HZ，由10串高頻電刺激所誘導，每串刺激由5個刺激方波組成，波寬為0. 1ms，每串刺激間隔為200ms。刺激強度與測試刺激相同。如果PS幅度較自身對照值增加20%以上并且持續時間超過60min，則表示LTP現象已形成。2. 3電生理實驗給藥方法與劑量JZ-V用生理鹽水配制，通過埋植在側腦室的導管進行給藥。將連接微量注射器的細塑料管導入簍管，穩定一段時間后，再記錄PS 30min, 代表給藥前的基礎傳遞突觸水平。將5μ 1藥物或溶劑于5min內緩慢注入側腦室，對照組注入 5 μ 1 生理鹽水，JZ-V IOnmol Ι^+HFS 組和 JZ-V IOOnmol Ι^+HFS 組分別注入 5 μ 1 IOnmol L—1和5 μ 1 IOOnmol L—1的JZ-V。為了防止對實驗的干擾，給藥結束后細塑管仍置留于簍管內至實驗結束。藥物在腦組織中濃度換算大鼠腦容積計量為ani，根據給藥體積、原藥液濃度以及在理論上應達到腦組織中的藥物濃度，計算出藥物在側腦室的終濃度 [93]。溶劑對照組給予相應體積的生理鹽水。2. 4數據處理所有實驗數據用均數士標準差(mean士SD)表示，采用SPSS統計軟件進行處理，組間比較采用t檢驗。P < 0. 05為差異有顯著性，P <0.01為差異有極顯著性。3 結果3. IJZ-V (10、IOOnmol L—1)對基礎突觸傳遞水平的影響JZ-V (10、IOOnmol L—1，icv)通過簍管給予，在給藥前記錄基礎突觸傳遞水平PS幅度值30min，每5min記錄一次，將此6個時間點的PS幅度值的平均值作為PS幅度基線值， 如圖3a和圖北所示，在溶劑對照組給藥后60min內的PS幅度沒有變化。3. 2JZ-V (IOUOOnmol Γ1)對 HFS 誘導 DG LTP 的影響在給予J-V IOnmol Γ1后30min，給予HFS (IOOHz)。在給藥前30min記錄基礎突觸傳遞水平PS幅度值，每5min記錄一次，將此6個時間點的PS幅度值的平均值作為PS 幅度基線值，給藥后觀察時間為90min。如圖4a、圖4b和圖如所示，對照組的PS幅度在 90min內沒有變化，單純高頻刺激組的PS值在10，30，60，90min分別為200% 士 20%，182% 士 19%，180% 士 19%禾Π 178% 士 17% (n = 6)。JZ-V IOnmol Γ1+HFS 組的 PS 幅度在給予 HFS 后 IOmin 為 297% 士 21%，30min 時為 290% 士 18%，60min 時 PS 幅度為 296% 士 20% (n = 6)，而 JZ-V IOOnmol Γ1 給藥組在給予 HFS 后 10，30，60min 其 PS 值為 348% 士 27%， 333% 士沘％，3；35% 士31% (n = 6)。研究結果說明JZ-V呈劑量依賴性加強100ΗΖ對LTP 的誘導，顯著提高突了海馬突觸傳遞效能。4、結論JZ-V可顯著提高HFS后的群峰電位幅度，大大增強LTP的誘導。具有增強神經突觸傳遞的作用。實施例2JZ-V對A β ( β -淀粉樣蛋白，β -Amyloid Protein)所致學習記憶障礙的改善作用1實驗材料1. 1實驗動物C57BL/6雄性小鼠，SPF級，體重(23士2)g，由中國醫學科學院實驗動物研究所提供，質量合格證號SCXK (京)2009-007。將動物飼養于SPF級動物房中，自然采光，室溫22士2°C，自由攝食飲水，動物在動物房中適應環境7天進行手術。1.2藥品與試劑4 3 1-42:美國5丨8111￡1公司，0981(4813。鹽酸多奈哌齊衛材醫藥有限公司，(國藥準字H200550978)，批號100223A。JZ-V通過現有方法直接提取得到。1. 3實驗儀器SR_6N立體定位儀(Narishige，日本)2實驗方法2. 1動物模型制備手術前，C57小鼠稱重，體重25 ^g，小鼠腹腔注射4%水合氯醛麻醉(lml/100g)后，固定于腦立體定位儀上使頭顱保持水平，用75%酒精消毒皮膚， 剪去耳后及頭頂部毛后，沿顱骨正中線縱向切開皮膚，用脫脂棉推開皮下組織及骨膜，充分暴露顱骨，使骨縫清晰。使用腦立體定位儀定坐標為前囟后0. 2mm，矢狀縫旁1mm，硬腦膜下0. 9mm,以骨鉆打開顱骨，將脫脂棉清除骨屑后以針頭小心挑破硬腦膜，用眼科鑷將裝有生理鹽水的PE管垂直插入小孔內，并用牙科水泥將其固定于顱骨上，待實驗時注射藥物使用。埋管結束后在小孔周圍顱骨上灑少量青霉素粉防止感染。手術后，動物需單籠飼養，恢復3天后進行給藥。手術后，將小鼠隨機分為4組，每組13只，分別為空白對照組、A β 1-42 模型組、陽性藥鹽酸多奈哌齊給藥組和JZ-V給藥組。單籠飼養，術后動物恢復3天后，第4 天開始每天給藥進行造模。A β 1-42模型組、陽性藥鹽酸多奈哌齊給藥組和JZ-V給藥組每天給與A β l-42400pmol即5 μ 1，連續給藥3天進行造模。造模后，Αβ 1-42模型組在末次給藥7天后進行Morris水迷宮試驗。陽性藥鹽酸多奈哌齊給藥組造模后，每天在固定時間灌胃給予鹽酸多奈哌齊(5mg/kg)。JZ-V給藥組造模后，每天側腦室注射5μ1 JZ-V (0.0 μ Μ，溶于生理鹽水)。陽性藥鹽酸多奈哌齊給藥組和JZ-V給藥組在末次給藥Ih后進行Morris水迷宮試驗。除陽性藥鹽酸多奈哌齊給藥組每天固定時間灌胃給予5mg/kg的陽性藥，其余各組灌胃給予等容量的雙蒸水(DDW)。JZ-V給藥組側腦室注射JZ-V5 μ 1，其余組別側腦室給與等容量的生理鹽水。2. 2Morris水迷宮實驗使用如圖2所示的Morris水迷宮實驗裝置。Morris水迷宮實驗包括定位航行試驗和空間探索試驗，Morris水迷宮實驗的前四天進行定位航行試驗。實驗第一天，不放置平臺，讓小鼠自由游泳anin，以適應周圍環境。第二天正式實驗時， 平臺固定在NW(按東南西北四個方向將水池平均劃分為4個象限NE、SE、SW、NW)中央，迷宮中含有白色素的液面高于平臺1.5cm，水溫穩定在(22士0.5) °C。小鼠首先被擱置于臺階上10s，使其了解平臺的位置后，選擇平臺的對角象限作為入水象限(SE)，將小鼠面向池壁放入水池，使其自由游泳，自動攝像系統記錄小鼠尋找平臺的時間(逃避潛伏期，escape latency)，設定60s為最長逃避潛伏期，60s后自動停止記錄。如果小鼠在60s內未找到平臺，需將其引至平臺，這時潛伏期記為60s。檢測指標為潛伏期、總游程、終止類型(終止類型為至測試終止成功尋找到平臺的百分比)。定位航行試驗結束第二天為空間探索試驗(spatial probe test)，撤除平臺，通過動物在60s內穿過原平臺位置的次數、原平臺象限游程比率及時間比率(即動物在原平臺象限的游程及時間占總游程及總時間的比率)來評價動物的空間記憶能力。試驗期間環境安靜，迷宮外參照物不變。Morris水迷宮實驗期間，陽性藥鹽酸多奈哌齊給藥組和JZ-V給藥組仍繼續每天給藥，陽性藥鹽酸多奈哌齊給藥組和JZ-V給藥組末次給藥Ih后進行Morris水迷宮實驗。2. 3避暗實驗=Morris水迷宮試驗結束后，動物休息1天后進行避暗試驗。在此期間，陽性藥鹽酸多奈哌齊給藥組和JZ-V給藥組仍繼續每天給藥，末次給藥Ih后進行避暗試驗測試。首次試驗前，讓動物在試驗箱中適應;3min。訓練時，將小鼠面部背向洞口放置明室，同時啟動自動記錄裝置，計時器開始計時。動物通過洞口進入暗室受到電擊后即可取出。24h后正式測試，記錄小鼠第1次進入暗箱前，在明箱停留的時間(即避暗潛伏期)，以及5min中內小鼠進入暗箱，受到電擊的次數(即小鼠進入暗箱的錯誤次數)。3 結果3. IMorris 水迷宮試驗中 JZ-V 對 Αβ 1_42(β-淀粉肽，beta-amyloidp印tide， Αβ )(1-42)引起的小鼠學習記憶障礙的改善作用側腦室內注射Αβ 1-42造模一周后，小鼠出現明顯的空間學習記憶障礙，表現為潛伏期較空白對照組顯著延長，小鼠尋找平臺的成功率(百分比表示)顯著降低(結果如表2所示)，在平臺所在象限內游泳路程也明顯減少。與模型組相比，JZ-V組小鼠潛伏期明顯縮短，尋找平臺的成功率顯著增加，在平臺所在象限內游泳路程也明顯增多。隨著訓練次數的增加，各組小鼠尋找到平臺的游泳時間、游泳路程(潛伏期)不斷減少，與模型組相比，其余各組小鼠潛伏期均明顯縮短(P <0.01)，成功尋找平臺的幾率不斷增加(P <0.01)，總游路程縮短。結果如表1、2、3所示。在定位航行測試結束后，撤除平臺進行空間探索實驗以測試小鼠是否已形成對平臺的空間記憶，結果見表4所示。結果表明，Αβ模型與空白對照組小鼠相比，在原平臺所在象限游泳的路程比率明顯下降(P < 0. 01)，在原平臺所在象限游泳的時間比率明顯降低 (P < 0. 05)。與模型組相比，各組小鼠在原平臺所在象限游程明顯升高(P < 0. 05)。說明在Morris水迷宮實驗中，Αβ 1-42明顯損傷了小鼠的空間記憶能力，提示 JZ-V能明顯對抗由Αβ 1-42引起的小鼠空間學習記憶功能的損傷，改善學習記憶能力。表1. JZ-V對安全島探尋潛伏期的影響
權利要求
1.敬釗毒素-V在制備抗認知、學習記憶功能障礙藥物中的應用。
2.敬釗毒素-V在制備用于預防、緩解和/或治療阿爾茨海默氏病引發的認知功能障礙和/或學習記憶功能障礙的藥物中的應用。
3.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述藥物含有預防或治療有效量的敬釗毒素-ν以及任選的藥學可接受的載體和/或輔料。
4.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述藥物的劑型選自溶液劑、懸液劑、乳劑、丸劑、膠囊劑、粉末劑、控制釋放劑或持續釋放制劑。
5.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述藥物通過吸入或吹入口和鼻給藥、經口含化給藥、胃腸外或直腸給藥、局部椎管給藥。
全文摘要
本發明公開了敬釗毒素-V在制備抗認知、學習記憶功能障礙藥物中的應用。本發明將化學法制備的敬釗纓毛蜘蛛毒素提取物-JZ-V用于制備預防、緩解和/或治療能引發認知功能和/或學習記憶功能障礙的疾病，如阿爾茨海默氏病等疾病或癥狀，特別是改善認知功能和/或學習記憶功能的藥物和/或藥物組合物。實驗證實JZ-V能顯著提高大鼠海馬突觸傳遞效應，使其突觸傳遞通路LTP的誘導呈顯著性增強，從而可顯著延長癡呆動物錯誤潛伏期；可顯著縮短癡呆動物尋找到安全島的游泳時間和游泳路程；可明顯改善癡呆動物對平臺的空間記憶。臨床一線癡呆治療藥物多奈哌齊在本實驗中為陽性對照藥，研究結果顯示JZ-V對于學習記憶障礙的治療效果的多項指標優于或與多奈哌齊相齊平。
文檔編號A61K38/17GK102397526SQ20111036961
公開日2012年4月4日 申請日期2011年11月18日 優先權日2011年11月18日
發明者王曉英, 謝奇辰, 陳曦 申請人:中國醫學科學院藥用植物研究所