專利名稱：一種砷化合物溶液及其制備的包載砷化合物的白蛋白納米粒和凍干制劑的制作方法
技術領域：
本發明屬醫藥技術領域，涉及一種砷化合物溶液及其制備的包載砷化合物的白蛋白納米粒和包載砷化合物的白蛋白納米粒凍干制劑。
背景技術：
系統性紅斑狼瘡(SLE)是一種自身免疫性疾病，可累及全身各個系統和臟器的自身免疫病，發病機制未明，但在眾多病因中，認為是一種體內B細胞多克隆激活和針對自身抗原產生自身抗體的自身免疫性風濕性疾病。目前對SLE的西醫治療仍以糖皮質激素及細胞毒藥物或免疫抑制劑為主，雖然能夠延長存活期限，但長期或大劑量使用激素，可導致消化道出血、骨質疏松、感染等并發癥，給治療帶來很多困難。因此，研究一種療效可靠、副作用小且經濟的藥物治療方法，滿足不同患者的需要，仍為當務之急。As2O3俗稱砒霜，為一種劇毒藥，又是一種作用廣泛的藥物。在我國有悠久的用藥史，古代中醫曾用于治療牛皮癬、梅毒、風濕病及一些惡性腫瘤。傳統中藥砒霜，最早是中國人在新藥開發與治療白血病領域的重大發明和貢獻，并取得舉世公認的成就。近年來由于As2O3在急性早幼粒白血病治療中的顯著療效。許多學者對該藥進行深入研究表明，As2O3具有極為廣泛的抗瘤譜，不僅對白血病細胞具有極好的抑制作用，同時對于眾多的實體腫瘤也有很好的抑瘤作用，其中包括肺癌、胰腺癌、食管癌、卵巢癌、胃癌和結腸癌等。國內外許多學者從現代醫學科學的角度，對其作用機制進行深入細致的研究。研究表明，砷在體內以三價砷起作用，三價砷是巰基(-SH)的絡合劑，與酶分子內的巰基作用后可抑制其活性，然后通過多條途徑誘導細胞凋亡，證實了 As2O3是目前非常有效的抗腫瘤藥物。魏亞明等(西北國防醫學雜志，2002，23 (5) =324-326.)報道了三氧化二砷對白血病細胞凋亡和分化的 雙向誘導作用。研究發現As2O3在高濃度時以誘導細胞凋亡為主，低濃度時誘導細胞分化為主，As2O3可以誘導白血病細胞凋亡和部分分化。同時，As2O3對細胞因子和免疫調節方面的作用機制也日益受到關注，一些研究:朱小春等(中華內科雜志，2001，40(11): (764-765);(中華風濕病學雜志，2002，6 (5) =343-346)推測As2O3誘導自身反應性淋巴細胞的凋亡而控制或減輕自身免疫反應，或抑制SLE發病機制中起重要作用。但是，傳統As2O3的臨床應用目前仍存在不少問題，如毒副作用大、生物利用度較低等。目前臨床上所用的制劑是As2O3制成的亞砷酸注射液，靜脈給藥后由于血漿砷濃度很快升高并迅速彌散至周圍組織，可使病人出現消化道癥狀、末梢神經炎、皮膚干燥、色素沉著，甚至出現腎功能損害或胸腹水等毒副作用。鑒于As2O3全身給藥的安全劑量非常有限，安全劑量與中毒劑量相差很小，體內過量積蓄的毒性，更限制了其作為化療藥物的應用。因此，我們在看到As2O3中藥臨床應用價值的同時，若能通過改進傳統制劑工藝，采用現代技術制備新型As2O3納米粒，從而提高生物利用度、減少藥物用量、降低毒副作用并提高療效將具有重要的臨床意義?，F有的包載As2O3納米粒制劑的制備方法:
1、周潔等(中國新藥雜志2005 14(1)54)公開了乳化-戊二醛固化法制備三氧化二砷白蛋白微球的方法；該方法不僅使用大量有機溶劑與油，而且使用較多的化學交聯劑——戊二醛，其殘留將給制劑的使用帶來安全隱患。2、陳華江(第二軍醫大學學報2007.28(6)644)公開了乳化-熱固化法制備三氧化二砷白蛋白微球的方法；3、楊志文等(中華中醫藥學刊2007 25(8) 115)公開了乳化-加熱固化法制備三氧化二砷白蛋白微球方法，需使用蓖麻油，棉籽油，且需使用大量有機溶劑洗除油性殘余物。以上兩種方法，無論是乳化-戊二醛固化法還是乳化-加熱固化法都存在工藝流程繁瑣，不能擴大操作等缺陷。我們在制備包載砷化合物的納米粒的初期經過諸多試驗研究發現，用蓖麻油進行乳化-熱固化法所制得的納米粒粒徑大小相差懸殊，且工藝流程繁瑣；后改用去溶劑-戊二醛化學固化法，但由于納米粒的比表面積大，尚未固化的納米粒在攪拌中易合并呈大粒，又容易發生納米粒之間的交聯，所制得粒徑偏大、釋放時間也比較短，且有戊二醛化學試劑殘留，工藝流程繁瑣、不利于工業化生產。綜上，現有技術存在工藝流程繁瑣；毒性試劑戊二醛殘留的隱患；緩釋時間短，穩定性差不利于穩定貯存等缺陷，亟需開發一種新的制備包載As2O3納米粒制劑的新方法。

發明內容
本發明要解決的第一個技術問題是提供一種砷化合物溶液，該砷化合物溶液中砷化合物分子結構明確，并且具有良好的藥物療效。為解決上述技術問題，本發明采用下列技術方案:一種砷化合物溶液，按照如下方法配制:取As2O3粉末加入到無菌去離子水中得到懸浮液，其中每HiL無菌去離子水中加入6 `25mg As2O3粉末；所得懸浮液滴加NaOH溶液直至粉末完全溶解并調節溶液PH為7.5 9，并使所得砷化合物溶液的濃度以投料的As2O3計為5 20mg/mL。本發明使用的As2O3粉末的純度為95% 99.9%。本發明用氫氧化鈉溶液溶解As2O3,并且通過控制氫氧化鈉的濃度和加入量調節溶液的pH值，而非如目前的常規做法般通過加入鹽酸調節溶液的pH值。本發明推薦溶解As2O3的NaOH溶液的濃度為I 6mol/L，優選為I 2mol/L。在As2O3完全溶解后，再用0.1 0.5mol/L(優選0.1 0.2mol/L)的氫氧化鈉溶液調節溶液pH到7.5 9。本發明上述配制過程中，可在室溫或在加熱條件下滴加NaOH溶液，本領域技術人員可以根據實際需要自行選擇滴加條件。進一步,優選所得砷化合物溶液的濃度以投料的As2O3計為6 10mg/mL,更優選為 8mg/mL。本發明配制得到的砷化合物溶液，溶質組成主要包括偏亞砷酸鈉(NaAsO2)和As2O3，可用于制備粒徑小、分散無粘結、穩定性好的包載砷化合物的白蛋白納米粒。本發明要解決的第二個技術問題是提供一種由所述的砷化合物溶液制得的包載砷化合物的白蛋白納米粒，所述的包載砷化合物的白蛋白納米粒以緩釋性良好的HAS和BSA為骨架材料包載砷化合物，其中砷化合物分子結構明確、具有良好的藥物療效，故是一種能提高藥物療效和生物相容性以及降低毒副作用的控釋制劑。為解決上述技術問題，本發明采用去溶劑化-物理固化法制備所述的包載砷化合物的白蛋白納米粒，該方法具有快速簡便、可操作性強、粒徑均勻并分布較窄等特點。一種由所述的砷化合物溶液制備的包載砷化合物的白蛋白納米粒，其制備方法包括下列步驟:(1)配制白蛋白溶液:將白蛋白用去離子水配制成濃度為0.01 0.02g/mL的白蛋白溶液；所述的白蛋白為人白蛋白(HSA)或牛白蛋白(BSA)；(2)將砷化合物溶液與白蛋白溶液按照砷化合物溶液的投料As2O3與白蛋白的質量比為1: 5 20的比例混合，然后用NaOH溶液調節pH至7.5 9，攪拌下滴入脫水劑，得到乳濁液；所述脫水劑選自下列一種或兩種任意比例的混合:乙醇、丙酮，所述脫水劑與白蛋白溶液的投料體積比為2.0 3.5: I ；(3)將所得乳濁液置于水浴中通過物理交聯法固化，固化溫度為40 90°C，固化時間為10 240min，得到納米粒乳濁液；(4)所得納米粒乳濁液經蒸發去除脫水劑、離心分離得到包載砷化合物的白蛋白納米粒。進一步，所述步驟(2)中，優選在用氫氧化鈉溶液調節pH值至7.5 9后，加入NaCl溶液使NaCl終濃度為5 10禮，然后再滴入脫水劑。進一步，所述步驟(2)中，優選所述的砷化合物溶液與白蛋白溶液按照砷化合物溶液的投料As2O3與白蛋白的質量比為1: 10 20的比例混合；所述的脫水劑優選為體積比為1: 0.05 20的乙醇和丙酮的混合液。進一步，所述步驟(3)中，固化溫度優選為40 80°C，固化時間優選為10 120min。進一步，所述步驟(4)中，所述納米粒乳濁液通過下列方法蒸發去除脫水劑:將納米粒乳濁液置于30 50°C水浴旋轉蒸發蒸餾去除脫水劑；所述的離心分離具體可采用下列步驟:在去除脫水劑的納米粒乳濁液中加入等體積的無菌去離子水，置于高速離心機中于5°C, 14000 17000rpm/min的條件下離心25min,洗漆2 3次得到包載砷化合物的白蛋白納米粒。本發明要解決的第三個技術問題是提供一種由所述的砷化合物溶液制備的包載砷化合物的白蛋白納米粒凍干制劑，所述的包載砷化合物的白蛋白納米粒以緩釋性良好的HAS和BSA為骨架材料包載砷化合物，其中砷化合物分子結構明確、具有良好的藥物療效，故是一種能提高藥物療效和生物相容性以及降低毒副作用的控釋制劑。所述的包載砷化合物的白蛋白凍干制劑的制備方法包括下列步驟:(a)配制白蛋白溶液:將白蛋白用去離子水配制成濃度為0.01 0.02g/mL的白蛋白溶液；所述的白蛋白為人白蛋白或牛白蛋白；(b)將砷化合物溶液與白蛋白溶液按照砷化合物溶液的投料As2O3與白蛋白的質量比為1: 5 20的比例混合，然后用NaOH溶液調節pH至7.5 9，攪拌下滴入脫水劑，得到乳濁液；所述脫水劑選自下列一種或兩種任意比例的混合:乙醇、丙酮，所述脫水劑與白蛋白溶液的投料體積比為2.0 3.5: I ；(c)將所得乳濁液置于水浴中通過物理交聯法固化，固化溫度為40 90°C，固化時間為10 240min，得到納米粒乳濁液；(d)所得納米粒乳濁液經蒸發去除脫水劑、離心分離得到包載砷化合物的白蛋白納米粒；
(e)在所述的包載砷化合物的白蛋白納米粒中加入凍干保護劑，經冷凍干燥獲得包載砷化合物的白蛋白納米粒凍干制劑；所述包載砷化合物的白蛋白納米粒與凍干保護劑的投料質量比為1: 3 5。上述步驟(a) (d)分別與制備包載砷化合物的白蛋白納米粒的步驟⑴ (4)相同，在此不再贅述。進一步，所述步驟(e)中，所述的凍干保護劑選自下列一種或兩種的組合:甘露醇、葡萄糖、蔗糖、甘氨酸、海藻糖、麥芽糖、乳糖；所述的冷凍干燥在-40 _80°C的條件下進行。本發明所述的包載砷化合物的白蛋白納米粒凍干制劑，可按照藥品生產常規工藝制成注射液，并且因載體材料來源廣、容易得到且經濟實惠，適宜制備口服劑型，如膠囊、片齊U、懸浮液等。本發明所述的包載砷化合物的白蛋白納米粒和凍干制劑由于包載攜帶偏亞砷酸鈉(NaAsO2)和As2O3，可廣泛用于治療系統性紅斑狼瘡(SLE)、自身免疫性類風濕性關節炎(RA)、干燥綜合征，重癥肌無力(MG)、自身免疫性甲狀腺疾病、免疫性肺疾病(諸如哮喘)等自身免疫性疾病，胰島素依賴性糖尿病(IDDM ；1型糖尿病)，以及腫瘤化療。與現有技術相比，本發明具有如下優點:1)、本發明在配制砷化合物溶液過程中不加入鹽酸，制得的砷化合物溶液分子結構明確，而且藥物療效顯著，其不僅對于人B淋巴瘤細胞具有抑制作用，而且對人T淋巴瘤細胞也具有明顯的抑制作用。2)本 發明采用去溶劑-物理固化法制備砷化合物HAS或BHA納米粒，不用表面活性劑，不用化學交聯劑，與乳化-熱固化法、去溶劑法=化學交聯固化制備的納米粒相比，快速簡便，易于擴大操作；所得納米粒粒徑小于200nm，粒子光滑、外形圓形、分散無粘結、具有彈性，易于穩定貯存；3)、包載砷化合物藥物的納米粒和凍干粉，能恒速釋放藥物，能使血藥濃度比緩釋制劑更加平穩，且能顯著增加患者的順應性，從而能提高藥物療效、生物相容性和降低毒副作用；與乳化-化學交聯法、去溶劑-化學交聯法制備的緩釋劑相比，本發明制備的包載砷化合物的HAS或BHA納米粒緩釋時間長，將有可能成為新型的控釋納米粒制劑。4)本發明所制備納米粒的粒徑分布較窄，能滿足作為靶向給藥系統的藥物尺寸范圍。并且由于采用物理-去溶劑法制備納米粒，熱變性溫度和時間只會影響穩定性，卻不影響粒徑和表面氨基數[Weber C, Coester C, Kreuter J, et al.Desolvation process andSurface characteristics of protein nanoparticles[J].1nt J Pharm.2000.194(I):91.]，故所得納米粒的表面氨基數較多。故本發明的納米粒是提供制備偶聯各種疾病相對應抗體的主動靶向給藥系統的良好載體，可通過偶聯方法將具有主動尋靶作用的單抗與納米粒表面的氨基相結合，從而獲得具有定位傳輸功能的主動靶向制劑。


圖1為實施例3所制得的包載砷化合物的HSA納米粒的透射電鏡圖(4萬倍)。圖2A1 圖2A3均為實施例3同一批次所制得的包載砷化合物的HSA納米粒乳濁液的原子力圖(掃描探針電鏡)，由圖中可見納米粒形態球形、圓形分散，表面光滑，粒徑分布較為均勻。圖3為實施例5所制得的包載砷化合物的HSA納米粒乳濁液的原子力圖。圖4A1為實施例4所制得的包載砷化合物的HSA納米粒乳濁液的原子力圖；圖4A2是與圖4A1同一個位置的原子力圖；圖4A3是圖4A1原子力測定的同一個稀釋樣品恢復后的原子力圖。圖5A為實施例3所制得的去除脫水劑的包載砷化合物的HSA納米粒乳濁液室溫放置6個月后的原子力圖，圖5B是與圖5A同一批次樣品的凍干粉在4°C冰箱放置6個月后的原子力圖。圖6為實施例3制備的包載砷化合物的HSA納米粒的粒徑分布圖。圖7為實施例4制得的包載砷化合物的HSA納米粒的體外藥物釋放曲線圖。圖8為實施例2所制得的包載砷化合物的BSA納米粒乳濁液的原子力圖。圖9為實施例3所制得的包載砷化合物的BSA納米粒凍干粉樣品在4°C冰箱放置6個月后的原子力圖。圖10為流式細胞術檢測細胞凋亡的細胞計數圖，A為對照組，圖10B1-圖10B4分別對應砷化合物濃度[以As2O3濃度計算]為0.2.μ g/ml、0.4μ g/ml、0.8μ g/ml、l.6μ g/ml的處理組。圖11為流式細胞術檢測細胞凋亡的柱狀圖。圖12A為對照組的人T淋巴 瘤細胞株jurkat細胞的細胞凋亡小體圖，圖12B為人T淋巴瘤細胞株jurkat細胞經砷化合物(As2O30.8 μ g/mg)作用后的細胞凋亡小體圖。圖13A、B、C為正常對照組的細胞線粒體圖，A、B、C分別對應同一視野下拍的常規濾光、紅色熒光、綠色熒光照片。圖14A、B、C為砷化合物(As2O30.4 μ g/mg)處理組的細胞線粒體圖，A、B、C分別對應同一視野下拍的常規濾光、紅色熒光、綠色熒光照片。圖15A、B、C為砷化合物(As2O30.8 μ g/mg)處理組的細胞線粒體圖，A、B、C分別對
應同一視野下拍的常規濾光、紅色熒光、綠色熒光照片。
具體實施例方式下面通過具體實施方式
對本發明作詳細說明，具體實施方式
的作用僅僅是解釋，而不以任何方式限定本發明的范圍。實施例1:砷化合物溶液配制精確稱質量120mg純度為99.9%的As2O3粉末倒入裝有8ml無菌去離子水的燒瓶中，As2O3呈懸浮液，通過加熱、滴加lmol/L NaOH至粉末完全溶解后，再用0.lmol/L NaOH調節溶液至pH至8.4，并用無菌去離子水補足體積至最終為15ml的砷化合物溶液，濃度以投料As2O3計為8mg/ml。實施例2:制備包載砷化合物的HAS或BSA納米粒①根據實施例1中配制的砷化合物溶液，吸取砷化合物溶液0.45ml ；②稱取HAS或BSA60mg，溶劑選自無菌去離子水，配制濃度為1.2% (g/ml)的白蛋白溶液，將白蛋白溶液用0.22 μ膜過濾于無菌容器中；③將砷化合物溶液和白蛋白溶液二者混合后，用0.lmol/L NaOH溶液調節pH至7.6，然后加入50mmol/L NaCl溶液使得NaCl終濃度為10mmol/L，常溫(25_30°C )下，在1000rpm/min攪拌下，以lmL/min的速度滴入脫水劑,脫水劑為乙醇與丙酮混合液,其體積比為3: 1，脫水劑體積約為12ml，出現乳濁液停止滴入，繼續攪拌30min，得到乳色乳濁液；④將乳色乳池液置于水浴，在1000rpm/min攪拌下,物理固化溫度為65°C,固化時間60min,得到納米粒乳池液；⑤然后置于40°C水浴減壓蒸發去除脫水劑，得到去除脫水劑的納米粒乳濁液；⑥在除去脫水劑的納米粒乳濁液中加入等體積無菌去離子水，置于高速離心機5°C, 14000rpm/min離心25min,洗漆2 3次,得到包載砷化合物的HAS或BSA納米粒；⑦用無菌去離子水將納米粒懸浮并加入乳糖溶液，白蛋白納米粒與乳糖的質量比為1: 3 5，使乳糖終濃度為4%，-51°C低溫條件下冷凍干燥，即得包載砷化合物的HSA、BSA納米粒凍干粉制劑。實施例3本實施例與實施例2不同點是，用0.lmol/L NaOH溶液調節pH至8.0 ;脫水劑體積約為14ml ;物理固化溫度為70°C，固化時間60min.;其它與實施例2相同。實施例4本實施例與實施例2不同點是，用0.lmol/L NaOH溶液調節pH至8.4 ;脫水劑約為16ml ;物理固化溫度為70°C，固化時間40min ;其它與實施例2相同。實施例5
本實施例與實施例2不同點是，稱取HAS或BSA50mg，溶劑選自無菌去離子水，配制濃度為1.0% (g/ml)的白蛋白溶液，將白蛋白溶液用0.22μ膜過濾于無菌容器中；將砷化合物溶液和白蛋白溶液二者混合后，用0.lmol/L NaOH溶液調節pH至8.8 ;脫水劑體積約為17.5ml ;物理固化溫度為75°C，固化時間25min ;其它與實施例2相同。包載砷化合物的HAS、BSA納米粒的檢測指標如下:1、透射電鏡觀察納米粒的形貌利用透射電子顯微鏡檢測納米粒的形態:將樣品分散液滴在銅網上，經2%磷鎢酸染色，室溫下自然干燥，在透射電鏡上觀察納米粒的形貌并拍照。圖1為實施例3所制得的包載砷化合物的HSA納米粒的透射電鏡圖(4萬倍)，由圖1可見納米粒形態球形，邊緣光滑，彼此之間分散良好，粒徑分布較為均勻。2、原子力(掃描探針顯微鏡)觀察納米粒的形貌取適當稀釋的納米粒乳濁液滴入新剝云母片的檢測臺上，室溫下自然干燥，采用島津SPM-9600掃描探針顯微鏡檢測。圖2A1 圖2A3為實施例3同一批次所制得的包載砷化合物的HSA納米粒乳濁液的原子力圖，由圖中可見納米粒形態球形、圓形分散，表面光滑，粒徑分布較為均勻。圖3為實施例5制得的包載砷化合物的HSA納米粒乳濁液的原子力圖，由圖中可見，實施例5所制備的納米粒圓形、均勻分散,但粒徑更小,粒徑小于90nm。圖4A1為實施例4所制得的包載砷化合物的HSA納米粒乳濁液的原子力圖。同時處理四個包載砷化合物的HSA納米粒乳濁液樣品，在同樣條件洗滌、離心后，經稀釋制備原子力樣品進行測定，由圖4A1所示均為三個粒子有規律的互疊成一個大粒子，為了能更清晰觀察該圖，設置特殊模式測定與圖4A1同一個位置的原子力圖，由圖4A2清晰顯示，三個粒子有規律的互疊成一個大粒子。圖4A3是圖4A1原子力測定的同一個稀釋樣品恢復后的原子力圖。由圖4A1-圖4A2的形態變化可知:1)由于本發明制備的納米粒粒徑在200nm以下，洗滌、分離須經高速離心，引起納米粒形態受壓縮變形，容易引起藥物從受擠壓變形增大的蛋白網孔中滲漏出來，因此，推測易導致游離砷化合物濃度增加而降低載藥量與包封率。2)圖4A3顯示，受擠壓變形的納米粒在同一個水稀釋樣品中過一段時間再取樣測定即恢復球形，說明本發明制備的包載砷化合物的白蛋白納米粒富有彈性，有很強的可塑性，與戊二醛化學交聯的納米微球、微粒，經高速離心受擠壓破裂導致藥物游離出來而降低載藥量與包封率相比較，具有性質上的區別。圖8為實施例2所制得的包載砷化合物的BSA納米粒乳濁液的原子力圖。3、粒徑測定采用原子力粒徑測定軟件進行粒徑測定分析。圖6為實施例3制備的包載砷化合物的HSA納米粒粒徑分布圖，采用原子力粒徑測定軟件進行粒徑測定，對824個納米粒的結果分析繪制粒徑分布圖，所示納米粒平均粒徑為117nm，將其10 %、50 %與90 %的粒徑均小于該值的粒徑，分別以D10、D50、D90表示、計算跨距(Span) = (D90-D10)/D50 = 0.596，可見本發明所制備納米粒的粒徑分布較窄。平均粒徑在200nm以下可通過毛細血管的尺寸，能滿足作為靶向給藥系統的藥物尺寸范圍。4、制作標準曲線及藥物載藥量、包封率的測量4-1、制作標準曲線精確稀釋不同濃度的As2O3 溶液，分別為 0、0.05,0.2,1.0,2.0,4.0,6.0,8.0、
10mg/Lo采用Thermo Scientific電感稱合等離子發射光譜ICP-OES icap-6000測定不同濃度As2O3溶液的數據得出標準曲線，結果得到相關系數為0.999937。通過不同濃度As2O3標準曲線即可得到 各樣品中As2O3濃度，以求藥物載藥量和包封率；4-2、藥物載藥量、包封率的測量取納米粒乳池液適量,加入等體積去離子水,置于高速離心機5°C, 14000rpm/min離心25min，沉淀再用去離子水洗2次，合并上清液，混勻，分別定量吸取乳濁液、合并上清液置于四氟乙烯管中，加入一定體積的濃硝酸高溫消化，用去離子水將消化后樣品液移入容量瓶中，并定容至50ml，采用Thermo Scientific電感耦合等離子發射光譜ICP-OESicap-6000分別測定乳濁液和合并液的數據，根據標準曲線獲得乳濁液中As2O3的量和合并液中游離As2O3的量，并計算載藥量和包封率。實施例3制得的HSA納米粒的載藥量和包封率以及實施例2制得的BSA納米粒的載藥量、包封率和Zeta電位(mv)結果見下表I。表1.包載砷化合物的白蛋白納米粒的部分表征參數
白蛋白I平均粒徑粒徑范圍包封率(％) I載藥量(％)~ Zeta電位(mv)
HSAIYhm58-202nm56.87^75
BSAIiinm92-205nm48 7ill-38 + 0.3
5、納米粒的體外釋藥采用動態透析考察包載砷化合物的白蛋白納米粒的體外釋藥。精確吸取納米粒乳池液Iml,置于高速離心5°C、14000rpm/min 25min,經去離子水洗漆二次的納米粒,用3ml滅菌去離子水分次懸浮、洗滌納米粒沉淀物，并將其吸進已經處理好的透析袋中，扎緊兩端，置于裝有27ml滅菌去離子水的瓶子中，置于37°C、振蕩頻率為60r/min恒溫搖床進行溶出，分別于2h、4.5h、ld、2d、3d、4d、5d、6d、7d、8d、9d、10d時間取樣2ml，同時補充相應體積的滅菌去離子水；將緩釋液稀釋，置于同上的電感耦合等離子發射光譜icap-6000儀進行測定As2O3釋放量，計算累積釋放百分率，以時間為橫坐標，As2O3累積釋放率為縱坐標，繪制體外釋放圖。圖7為實施例4制得的包載砷化合物的HSA納米粒的體外藥物釋放曲線圖，圖7結果顯示:在2h的藥物釋放率為11.58%，沒有出現As2O3突釋，整個過程是緩慢而持續釋放；10天達到91.7%的累積釋放率，因此認為該藥物緩釋時間在10天左右。圖7的結果，是根據中國藥典2005年，二部，附錄180頁，《控釋制劑的釋放藥物數據可用零級方程擬合》，即Mt/M-=Rt(零級方程)，與謝秀瓊主編的《中藥新制劑開發與應用》第3版第488-499頁表6-161不同分子量、各時間段累積釋藥的數學方程公式計算，計算結果為:R2 = 0.9802，R=0.990 (Y = 7.2454x+10.721)，結果說明，本發明包載砷化合物白蛋白納米粒的體外釋放符合零級釋放，因此為控釋制劑。6、體外穩定性考察選擇實施例3制備的包載砷化合物的HSA納米粒乳濁液在室溫放置6個月后，取樣品用去離子水洗滌制備納米粒乳濁液檢測樣品，同時選擇實施例2制備的包載砷化合物的BSA納米粒凍干粉和實施例3制備的包載砷化合物的HSA納米粒凍干粉于4°C冰箱放置6個月后，取樣品用去離子水洗滌制備納米粒凍干粉檢測樣品，分別考察納米粒乳濁液和納米粒凍干粉的穩定性，觀察項目為外觀、再分散性、原子力形態:6-1、外觀觀察納米粒乳濁液的外觀為乳色膠體懸浮液。納米粒凍干粉外觀均維持原體積，未見納米粒凍干粉塌陷、皺縮，表面光潔，色澤均勻，質地細膩。6-2、納米粒凍干粉的再分散性評價包載砷化合物的白蛋白納米粒凍干粉于4°C下放置6個月后，仍呈白色蓬松狀，將納米粒凍干粉加入去離子水或生理鹽水振搖20秒即呈均勻分散的懸浮狀乳濁液。6-3、原子力形態包載砷化合物的HSA納米粒乳濁液于室溫下放置6個月后，原子力檢測未見納米粒發生聚集、粘連現象，平均粒徑未見增大，見圖5A。圖5B是實施例3制得的包載砷化合物的HSA納米粒凍干粉樣品在4°C冰箱放置6個月后的原子力圖，圖中顯示納米粒形態圓整，大小較均勻，無聚集、粘連現象，粒徑基本無變化。圖5A與圖5B相比較，圖5B顯示仍與納米粒乳濁液圖5A形貌基本一致，說明本發明的制備工藝制得的包載砷化合物的HSA納米粒凍干粉具有較好的穩定性。

圖9為實施例2制得的包載砷化合物的BSA納米粒凍干粉樣品在4°C冰箱放置6個月后的原子力圖，圖中可見，與圖8 —樣，圖9顯示納米粒形態球形、邊緣光滑，彼此之間分散良好。說明本發明的制備工藝制得的包載砷化合物的BSA的納米粒凍干粉具有較好的
穩定性。藥效學實驗:下面進一步說明本發明制備的包載砷化合物HAS、BSA納米粒的藥效作用，但本發明制備的包載砷化合物的HAS、BSA納米粒緩釋時間長，不適用于體外細胞培養的短期藥效實驗，因此，選用制備包載砷化合物HAS、BSA納米粒配制的同一個砷化合物溶液進行體外抗T淋巴細胞、B淋巴細胞藥效實驗研究:1、細胞培養人淋巴瘤細胞株細胞用含10%新生牛血清的RPMI 1640培養基培養，置于5% CO2培養箱、37°C飽和濕度培養，每I 2天更換I次培養液。待細胞生長良好，細胞數達到相應數目后進行藥物干預。2、實驗分組2.1、將生長良好的人B淋巴瘤細胞株Daudi細胞于24孔板培養，每孔接種為1ml，細胞密度為1.5x 105/ml，分為實驗組與對照組，實驗組分為0.1,0.2,0.4,0.8 μ g/ml As2O3組(各組先由實施例1制得的砷化合物溶液先用去離子水稀釋到80 μ g/ml，再用1640培養液稀釋到所需濃度)；對照組加入等體積的培養液。置于5% CO2培養箱、37°C飽和濕度培養至預定時間后進行相應檢測。分別取細胞懸液經0.3%臺盼藍生理鹽水液染色作存活、死亡細胞計數，結果如表2所示:表2不同濃度的三氧化二砷對Daudi細胞增殖的抑制作用
權利要求
1.一種砷化合物溶液，其特征在于:所述的砷化合物溶液按照如下方法配制:取As2O3粉末加入到無菌去離子水中得到懸浮液，其中每HiL無菌去離子水中加入6 25mg As2O3粉末；所得懸浮液滴加NaOH溶液直至粉末完全溶解并調節溶液pH為7.5 9，并使所得砷化合物溶液的濃度以投料的As2O3計為5 20mg/mL。
2.如權利要求1所述的砷化合物溶液，其特征在于:用于溶解As2O3粉末的NaOH溶液的濃度為I 6mol/L，用于調節溶液pH值的NaOH溶液的濃度為0.1 0.5mol/L。
3.如權利要求1所述的砷化合物溶液，其特征在于:用于溶解As2O3粉末的NaOH溶液的濃度為I 2mol/L，用于調節溶液pH值的NaOH溶液的濃度為0.1 0.2mol/L，使所得砷化合物溶液的濃度以投料的As2O3計為6 10mg/mL。
4.一種由權利要求1 3之一所述的砷化合物溶液制備的包載砷化合物的白蛋白納米粒，其特征在于所述的包載砷化合物的白蛋白納米粒的制備方法包括下列步驟: (1)配制白蛋白溶液:將白蛋白用去離子水配制成濃度為0.01 0.02g/mL的白蛋白溶液；所述的白蛋白為人白蛋白或牛白蛋白； (2)將砷化合物溶液與白蛋白溶液按照砷化合物溶液的投料As2O3與白蛋白的質量比為1: 5 20的比例混合，然后用NaOH溶液調節pH至7.5 9，攪拌下滴入脫水劑，得到乳濁液；所述脫水劑選自下列一種或兩種任意比例的混合:乙醇、丙酮，所述脫水劑與白蛋白溶液的體積比為2.0 3.5: I ； (3)將所得乳濁液置于水浴中通過物理交聯法固化，固化溫度為40 90°C，固化時間為10 240min,得到納米粒乳池液； (4)所得納米粒乳濁液經蒸發去除脫水劑、離心分離得到包載砷化合物的白蛋白納米粒。
5.如權利要求4所述的包載砷化合物的白蛋白納米粒，其特征在于:所述步驟(2)中，在用氫氧化鈉溶液調節pH值至7.5 9后，加入NaCl溶液使NaCl終濃度為5 10mM，然后再滴入脫水劑。
6.如權利要求4所述的包載砷化合物的白蛋白納米粒，其特征在于:所述的步驟(2)中，所述的砷化合物溶液與白蛋白溶液按照砷化合物溶液的投料As2O3與白蛋白的質量比為1: 10 20的比例混合；所述脫水劑為體積比為1: 0.05 20的乙醇與丙酮的混合溶液。
7.一種由權利要求1 3之一所述的砷化合物溶液制備的包載砷化合物的白蛋白納米粒凍干制劑，其特征在于:所述的包載砷化合物的白蛋白納米粒凍干制劑的制備方法包括下列步驟: (a)配制白蛋白溶液:將白蛋白用去離子水配制成濃度為0.01 0.02g/mL的白蛋白溶液；所述的白蛋白為人白蛋白或牛白蛋白； (b)將砷化合物溶液與白蛋白溶液按照砷化合物溶液的投料As2O3與白蛋白的質量比為1: 5 20的比例混合，然后用NaOH溶液調節pH至7.5 9，攪拌下滴入脫水劑，得到乳濁液；所述脫水劑選自下列一種或兩種任意比例的混合液:乙醇、丙酮，所述脫水劑與白蛋白溶液的投料體 積比為2.0 3.5: I ； (c)將所得乳濁液置于水浴中通過物理交聯法固化，固化溫度為40 90°C，固化時間為10 240min,得到納米粒乳池液；(d)所得納米粒乳濁液經蒸發去除脫水劑、離心分離得到包載砷化合物的白蛋白納米粒; (e)在所述的包載砷化合物的白蛋白納米粒中加入凍干保護劑，經冷凍干燥獲得包載砷化合物的白蛋白納米粒凍干制劑；所述包載砷化合物的白蛋白納米粒與凍干保護劑的投料質量比為1: 3 5，所述的凍干保護劑選自下列一種或兩種的組合:甘露醇、葡萄糖、蔗糖、甘氨酸、海藻糖、麥芽糖、乳糖。
8.如權利要求7所述的包載砷化合物的白蛋白納米粒凍干制劑，其特征在于:所述的步驟(b)中，在用氫氧化鈉溶液調節pH值至7.5 9后，加入NaCl溶液使NaCl終濃度為5 10mM，然后再滴入脫水劑。
9.如權利要求7所述的包載砷化合物的白蛋白納米粒凍干制劑,其特征在于:所述步驟(b)中，所述的砷化合物溶液與白蛋白溶液按照砷化合物溶液的投料As2O3與白蛋白的質量比為1: 10 20的比例混合；所述脫水劑為體積比為1: 0.05 20的乙醇與丙酮的混合溶液。
10.如權利要求7所述的包載砷化合物的白蛋白納米粒凍干制劑，其特征在于:所述的冷凍干燥在-40 -80°C的條 件下進行。
全文摘要
本發明公開了一種砷化合物溶液及其制備的包載砷化合物的白蛋白納米粒和凍干制劑，所述的砷化合物溶液按照如下方法配制取As2O3粉末加入到無菌去離子水中得到懸浮液，其中每mL無菌去離子水中加入6～25mg As2O3粉末；所得懸浮液滴加NaOH溶液直至粉末完全溶解并調節溶液pH為7.5～9，并使所得砷化合物溶液的濃度以投料的As2O3計為5～20mg/mL。本發明所述的砷化合物溶液中砷化合物分子結構明確且具有良好的藥物療效，所述的包載砷化合物的白蛋白納米粒和凍干制劑是能提高藥物療效和生物相容性以及降低毒副作用的控釋制劑，具有廣闊的應用前景。
文檔編號A61K33/36GK103142648SQ201110403008
公開日2013年6月12日 申請日期2011年12月7日 優先權日2011年12月7日
發明者樓蘭花, 范永升, 溫成平 申請人:浙江中醫藥大學