專利名稱：穿心蓮內酯的醫藥新用途的制作方法
技術領域：
本發明屬于醫藥技術領域，涉及穿心蓮內酯的醫藥新用途，具體涉及其在制備治療膠質瘤藥物中的新用途。
背景技術：
惡性膠質瘤是顱內最常見的惡性腫瘤，手術治療以及放射治療效果都不理想。目前化學治療是臨床治療惡性膠質瘤的主要手段。惡性膠質瘤發病涉及多種原癌基因和抑癌基因結構與功能的異常，本質上是一種多基因異常性疾病。表現為正常生長調控異常，出現無限增殖和凋亡抑制，從而導致細胞異常蓄積，乃至腫瘤形成，有文獻表明， PI3K/Akt信號通路在惡性膠質瘤細胞中過度激活。PI3K/Akt信號通路一直以來被廣泛關注，目前我國PII/Akt信號活性抑制劑專利有14項。PI3K/Akt信號可以調節細胞的許多生理功能細胞周期、細胞遷移和侵襲、 細胞生存，據報道70%的膠質瘤中存在PII/Akt信號的超常激活，因此PII/Akt信號抑制劑可以成為治療膠質瘤的一個突破口。2006年禮來公司的Enzastaurin獲準在歐美等地作為治療膠質瘤的孤兒藥開展三期臨床試驗。這種名為“Enzastaurin”的新藥是一種口服 PI!3K/Akt信號抑制劑，它通過降低細胞增殖能力、加速腫瘤細胞凋亡以及抑制腫瘤誘發的血管生成等多種機制抑制腫瘤生長。穿心蓮是爵床科植物的地上部分，它是一種常用中藥，味苦性寒，歸心肺大腸膀胱經。《泉州本草》記載其能“清熱解毒、消炎退腫、治咽喉炎癥、痢疾、高熱”，屬清熱解毒藥。 穿心蓮內酯是穿心蓮的主要成分之一，它分子量是350. 44，呈方菱形或片狀結晶。穿心蓮內酯有廣泛的藥理作用，它不僅具有解熱抗炎、抗病毒和調節免疫的作用，而且具有抗腫瘤作用，在體內、體外均有抑制多種腫瘤增殖和誘導分化的作用。作用機理涉及①誘導腫瘤細胞凋亡；②阻滯細胞周期于G0/G1期；③抑制腫瘤血管生成等。然而目前對于穿心蓮內酯在惡性膠質瘤治療中的應用及作用機制均未見報道。

發明內容
本發明首次發現穿心蓮內酯可通過全新的機制產生抗惡性膠質瘤作用，從而可制備用于治療人惡性膠質瘤的藥物。
本發明的目的是通過以下技術方案實現的 穿心蓮內酯可誘導惡性膠質瘤U251、U87細胞周期阻滯于&/M期從而抑制細胞生長； 能夠在體外對惡性膠質瘤U251、U87細胞生長具有抑制作用；穿心蓮內酯體內對荷膠質瘤動物模型腫瘤生長具有抑制作用；穿心蓮內酯誘導&/M周期阻滯與下調Cdkl和Cdc25C蛋白表達有關；還可以作為PII/Akt信號抑制劑通過抑制PII/Akt信號產生周期阻滯及增殖抑制作用。 穿心蓮內酯可與臨床上接受的賦形劑混合制成組合物，用于制備治療惡性腫瘤的藥物。


圖1為穿心蓮內酯體外對惡性膠質瘤U251、U87細胞生長的抑制作用； 圖2為穿心蓮內酯對荷膠質瘤動物模型腫瘤生長的抑制作用； 圖3為穿心蓮內酯可誘導惡性膠質瘤U251、U87細胞周期阻滯于&/M期； 圖4為穿心蓮內酯對惡性膠質瘤細胞&/M周期調控蛋白表達的影響； 圖5為穿心蓮內酯可抑制惡性膠質瘤細胞PII/Akt信號活性； 圖6為PII/Akt信號抑制劑LY^4002可增強穿心蓮內酯誘導的增殖抑制、G2/M周期阻滯以及Cdkl和Cdc25C蛋白下調作用。
具體實施例方式實施例1、穿心蓮內酯體外對惡性膠質瘤U251、U87細胞生長的抑制作用 1實驗方法
U251、U87細胞貼壁生長于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、ΙΟΟμ g/ml鏈霉素、 0. 2%NaHC03的RPMI-1640培養液中，置于含5% CO2、飽和濕度、37°C培養箱里培養，隔天換培養液傳代培養。取對數生長期的貼壁腫瘤細胞配制成6X IO4個/mL濃度，每孔ΙΟΟμΙ接種于96 孔板中培養過夜，待細胞充分貼壁后，除去原有的培養液，加入不同濃度穿心蓮內酯(沈陽藥科大學天然藥物研究室提供)、PI3K/Akt信號特異抑制劑LY^4002 (5μΜ、10μΜ、20μΜ，陽性對照)或DMSO (終濃度0. 1%，陰性對照)，每孔ΙΟΟμΙ。37 °C分別培養48小時、72小時， 培養結束后每孔加入5mg/ml MTT 15μ1繼續37°C培養4小時后小心棄去上清液，加DMSO 150μ1 /well，振蕩10分鐘以充分溶解結晶物。在酶標儀下測定OD值，按公式計算藥物對腫瘤細胞體外增殖的抑制率(Inhibition Rate, IR)0
r π ΤΤ Α , OD mntr&l - GD s卿k . ΛΛΓ /
IRYo = =-__ χ 100%
OD CGSIIQI - OD biirii
2實驗結果
由圖1可見，穿心蓮內酯(Andro)在10_100μΜ濃度范圍內作用48或72小時對體外培養的人惡性膠質瘤細胞U251、U87的增殖有抑制作用，且其增殖抑制作用呈時間及濃度依賴性。作用72h的IC50為45 μ M。陽性對照藥LY^4002對人惡性膠質瘤細胞U251也呈現劑量依賴性的增殖抑制作用。 實施例2、穿心蓮內酯體內對荷膠質瘤動物模型腫瘤生長的抑制作用 1實驗方法
六周齡雌性裸鼠15只，購于中國軍事醫學科學院，恒溫恒濕飼養于無菌系統。分為三組，空白對照組，DMSO組和穿心蓮內酯(Andro)給藥組，每組8只。取U251細胞，調至細胞濃度為3X107ml，細胞活力用臺盼藍檢測，細胞存活率>90%，用注射器吸取上述懸液， 右后肢外側皮下注射100 μ 1單細胞懸液。三組裸鼠接種后5日后，用游標卡尺測量腫瘤長徑和短徑，然后每日分別灌胃給藥相應劑量藥物，空白對照組裸鼠不予處理，DMSO組裸鼠每日灌胃含0. 2% DMSO的羧甲基纖維素鈉溶液，穿心蓮內酯(Andro)給藥組裸鼠每日灌胃50mg/kg穿心蓮內酯(溶于含0. DMSO的羧甲基纖維素鈉溶液)。給藥后每5日游標卡尺測量腫瘤長徑和短徑，按“腫瘤大小=腫瘤長徑X短徑2XO. 5”計算瘤體積。取每組的平均值，繪制藥物對腫瘤生長的抑制曲線。 2實驗結果
由圖2可見，與DMS0、空白對照組相比，50mg/kg穿心蓮內酯灌胃給藥可顯著抑制人惡性膠質瘤模型腫瘤的生長。實施例3、穿心蓮內酯可誘導惡性膠質瘤U251、U87細胞周期阻滯于&/M期從而抑制細胞生長；
1實驗方法
為了確認穿心蓮內酯抑制人惡性膠質瘤U251、U87細胞增殖作用的機制，采用流式細胞術考察了不同濃度穿心蓮內酯作用后細胞周期分布的變化。U251、U87細胞以IX IO6個 /ml的密度種在培養瓶中，加入不同濃度穿心蓮內酯后72小時收集細胞，1000 rpm/分離心5分鐘，小心棄盡上清，分別加入500 μ 1PBS,混懸細胞，逐滴加入10 ml 70%的冰冷乙醇，-20°C固定過夜。檢測前樣品1000 rpm/分離心5分鐘，小心棄盡上清，每份樣品中加入 10 μ 1 的 RNAase(200 μ g/ml)，混勻，37°C 作用 30 分鐘后，加入 50 μ 1 的 PI (1 mg/ml)， 4°C避光作用30分鐘，流式細胞儀檢測。實驗結果
結果表明，穿心蓮內酯作用72小時，可呈劑量依賴性的誘導人惡性膠質瘤U251、U87細胞周期阻滯于G2/M期。說明穿心蓮內酯對惡性膠質瘤細胞的增殖抑制作用與誘導細胞周期阻滯于G2/M期相關。實施例4、穿心蓮內酯誘導惡性膠質瘤細胞發生&/M周期阻滯與下調Cdkl和 Cdc25C蛋白表達有關；
1實驗方法
為考察穿心蓮內酯誘導惡性膠質瘤細胞&/M周期阻滯作用的機制，采用Western blotting方法檢測穿心蓮內酯對(；2/^周期調控蛋白表達的影響。收集經穿心蓮內酯處理 60小時細胞1 X IO6個，蛋白裂解液冰浴裂解30分鐘后，收集樣品，上樣前用Bradford法測定樣品蛋白濃度。按10 μ g/孔上樣，70V電泳后將蛋白轉移至PVDF膜。一抗雜交后的膜在TBST溶液中漂洗3次，每次室溫輕搖10分鐘。加入二抗，室溫輕搖孵育1小時后ECL發光底物顯色，暗室中放入醫用X射線膠片曝光。實驗結果
如圖4所示，50 μΜ、70 μΜ的穿心蓮內酯作用60 h可下調惡性膠質瘤U251、U87細胞 Cdkl和Cdc25C蛋白的表達，而對Cyclin AXyclin Bl的表達沒有影響。表明穿心蓮內酯誘導的G2/M阻滯與下調Cdkl和Cdc25C蛋白有關。實施例5、穿心蓮內酯可抑制惡性膠質瘤細胞PII/Akt信號活性
1.實驗方法
Western blotting法(同實施例4方法)
2.實驗結果
由圖5可見，30、50、70 μΜ的穿心蓮內酯作用60 h，可劑量依賴性的下調U251、U87細胞PI Ι/Akt信號中磷酸化Akt、磷酸化mTOR及磷酸化p70油k蛋白的表達，磷酸化Akt、磷酸化mTOR及磷酸化p70油k蛋白水平的下降表明應用穿心蓮內酯后，惡性膠質瘤細胞中PII/ Akt信號的活性被抑制。實施例6、PI3K/Akt信號抑制劑LY^4002可增強穿心蓮內酯誘導的增殖抑制、 G2/M周期阻滯以及Cdkl和Cdc25C蛋白下調作用
1.實驗方法
惡性膠質瘤U251、U87細胞預先用LY^4002處置30分鐘，再用不同濃度穿心蓮內酯處置，分別考察PII/Akt信號抑制劑LY^4002對穿心蓮內酯誘導的增殖抑制、G2/M周期阻滯以及Cyclin AXyclin Bl蛋白下調作用的影響。增殖抑制采用MTT法(同實施例1 方法)，G2/M周期阻滯采用流式細胞術(同實施例2方法，蛋白表達采用Western blotting 法(同實施例4方法)。實驗結果
如圖6所示，單獨使用LY^4002 (5 μ Μ)能夠抑制惡性膠質瘤U251細胞中Akt的活化(圖6G)，但不能產生明顯細胞增殖抑制和G2/M周期阻滯作用(圖6A-F)。當LY^4002(5 μΜ)與穿心蓮內酯(30 μΜ)合用后，可見PII/Akt信號抑制作用明顯增強。同時，與各自單獨應用比較，二者合用后對惡性膠質瘤細胞的增殖抑制和G2/M周期阻滯作用明顯增強(P<0. 01)(圖6A-F)，說明進一步抑制PII/Akt信號可增強穿心蓮內酯誘導的增殖抑制和G2/M周期阻滯作用，也表明抑制PII/Akt信號確實參與了穿心蓮內酯誘導的增殖抑制和G2/M周期阻滯作用。LY^4002 (5 μ Μ)也可增強穿心蓮內酯(30 μ Μ)誘導的Cdkl和 Cdc25C蛋白下調作用(圖6G)，說明穿心蓮內酯抑制PII/Akt信號可直接也可間接通過下調Cdkl和Cdc25C蛋白而誘導G2/M周期阻滯作用。
權利要求
1.穿心蓮內酯在制備治療人惡性膠質瘤藥物中的應用。
2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于穿心蓮內酯作為PI!3K/Akt信號抑制劑而使細胞周期阻滯于G2/M期。
3.根據權利要求1或2所述的應用，其特征在于，穿心蓮內酯與臨床上接受的賦形劑混合制成腸道或非腸道給藥制劑。
全文摘要
本發明屬于醫藥技術領域，涉及穿心蓮內酯的醫藥新用途，具體涉及穿心蓮內酯在制備用于治療惡性膠質瘤藥物中的新用途。穿心蓮內酯體內及體外可抑制人惡性膠質瘤細胞的生長，其機制涉及下調PI3K/Akt信號活性，進而誘導人惡性膠質瘤細胞周期阻滯于G2/M期。穿心蓮內酯可制備腸道及非腸道給藥劑型，用于人惡性膠質瘤的的治療。
文檔編號A61K31/365GK102397273SQ201110402728
公開日2012年4月4日 申請日期2011年12月7日 優先權日2011年12月7日
發明者張鵬飛, 李艷春, 楊星剛, 肖偉, 邱峰, 馬恩龍 申請人:沈陽藥科大學