專利名稱：雷公藤甲素在抑制ra滑膜血管新生藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及醫藥領域，具體地說，涉及雷公藤甲素在制備抑制RA滑膜血管新生藥物中的應用。
背景技術：
雷公藤為衛矛科植物雷公藤的根，又叫黃藤、黃臘藤、菜蟲藥、紅藥、水莽草。雷公藤是中藥中治療RA療效肯定的藥物。雷公藤甲素是從雷公藤中分離出的含有3個環氧基的二帖內酯化合物，是雷公藤發揮抗炎和免疫抑制作用的主要成分之一。已有多家文獻報道，雷公藤甲素在體內外對RA具有較好的抗炎、免疫抑制和保護軟骨的作用，其抗炎和免疫抑制涉及的主要機制包括:①下調T細胞受體的信號傳道，抑制T細胞增殖，活化半胱氨酸蛋白酶，進而誘導T細胞凋亡；②調節細胞間粘附分子(ICAM)和血管細胞粘附分子(VCAM)表達，阻止白細胞穿過血管壁到達炎癥部位；③抑制誘導型一氧化氮合酶(iNOS)及其產物前列腺素(PG)E2和一氧化氮(NO)的產生；④抑制趨化因子調節正常T細胞表達和分泌蛋白(RANTES)、單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)和巨噬細胞炎癥蛋白-1(MIP-1)趨化淋巴細胞和單核細胞向炎癥部位遷移等；其發揮軟骨保護的作用機制包括抑制基質金屬蛋白酶(MMPs)的產生和基因表達，而對其內源性的特異性抑制劑HMPs則有增強作用。近年來研究表明，雷公藤能抑制(腫瘤)新生血管生成。研究發現，雷公藤甲素能抑制血管內皮細胞的遷移及血管內皮生長因子(VEGF)、尿激酶型纖溶酶原激活因子(uPA)等的表達與合成；雷公藤甲素體外抑制培養的臍靜脈內皮細胞的增殖和遷移活性及管腔形成能力，抑制雞胚尿囊膜的血管形成，其機制與抑制內皮細胞uPA和組織纖溶酶原激活物(t-ΡΑ)的蛋白和基因表達有關。RA是一種病因未明的以關節破壞為主的慢性、全身性的自身免疫系統疾病，其主要病理環節包括滑膜炎癥增生，血管翳形成，以及軟骨和骨組織的破壞等幾個方面。已經證明雷公藤甲素具有很好的抗炎、免疫抑制和軟骨保護作用，從而抑制RA的滑膜炎癥、軟骨破壞，但是對RA滑膜血管生成(血管翳)方面的抑制作用及機制尚未見報道。雖然，有文獻報道雷公藤甲素具有抗(腫瘤)血管新生的作用，但是這些研究所采用的載體是體外培養的內皮細胞、平滑肌細胞、腫瘤細胞和/或雞胚尿囊膜模型等，不具有RA滑膜血管新生的特異性，因此雷公藤甲素對RA滑膜血管新生方面的作用仍需要研究。VEGF/VEGF受體途徑和血管生成素(Ang)/Tie2信息通路是調控血管生成的兩條主要途徑，在RA發病過程中受多種細胞因子如腫瘤壞死因子(TNF) α、白介素(IL)-1 β的調節。從VEGF/VEGF受體途徑和Ang/Tie2信息通路切入探討雷公藤甲素抗RA滑膜血管新生(血管翳)的作用機理，尚未見相關報道。本發明從VEGF/VEGF受體途徑和Ang/Tie_2信息通路等血管生成調控通路切入，體內實驗選擇與人類RA臨床特征最為接近的膠原誘導型關節炎(CIA)大鼠模型、體外實驗采用RA病人滑膜成纖維細胞(RA-HFLS)和人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)，首次探討雷公藤甲素抗RA滑膜血管新生的作用及機理。

發明內容
本發明的目的是提供雷公藤甲素在制備抑制RA滑膜血管新生藥物中的應用。本發明提供的藥物被制成經胃腸道給藥劑型或非胃腸道給藥劑型。優選的藥物為雷公藤甲素水溶液的口服劑型。藥物的制備方法可按目前的常規方法制備。本發明的發明人采用DA大鼠構建膠原誘導性關節炎(CIA)模型，經雷公藤甲素低劑量(llug/kg)、中劑量(22^/1^)、高劑量(45^/1 )治療4w后，明顯抑制CIA大鼠炎癥關節滑膜細胞的增生，減少滑膜中毛細血管和未形成管腔結構的新生血管的數量。采用免疫組化技術對炎癥關節滑膜中血管內皮細胞標志物血小板-內皮細胞粘附分子(CD)31進行染色，結果顯示雷公藤甲素能量效依賴的抑制滑膜中CD31的累積光密度(10D)，且22 45ug/kg劑量的作用顯著，進一步的滑膜血管密度結果分析顯示，CIA模型大鼠關節滑膜血管大量增生，且以小血管為主，雷公藤甲素能抑制滑膜小血管的增生。采用在體小鼠基質膠栓子實驗研究發現50ng/ml劑量的雷公藤甲素可明顯抑制VEGF誘導的基質膠內血管內皮細胞的浸潤。采用體外實驗研究結果顯示，10 50ng/ml劑量的雷公藤甲素可顯著抑制HUVEC的增殖，抑制VEGF誘導的HUVEC遷移，I 50ng/ml劑量的雷公藤甲素可顯著降低HUVEC黏附能力，抑制VEGF誘導的HUVEC管腔形成能力，且呈現明顯的濃度依賴性；同時，10 50ng/ml劑量的雷公藤甲素可顯著抑制IL-1 β誘導的RA-HFLS的增殖活性和黏附能力，抑制VEGF誘導的RA-HFLS遷移，且呈現一定的劑量依賴性。以上體內外實驗研究結果提示雷公藤甲素能抑制RA滑膜血管新生的作用。進一步采用體外實驗探討雷公藤甲素抑制滑膜血管新生的作用機制。I 50ng/ml劑量的雷公藤甲素顯著抑制RA-HFLS分泌IL_17、VEGF、Angl，且對IL-17有劑量依賴性，10 50ng/ml雷公藤甲素的對TNF α和50ng/ml的雷公藤甲素對Ang2也有顯著的抑制作用。50ng/ml劑量的雷公藤 甲素可顯著上調HUVEC VEGFR2水平，10 50ng/ml劑量的雷公藤甲素能顯著上調HUVEC Tie2表達水平。這些結果顯示雷公藤甲素抑制RA滑膜血管新生的作用機制與其抑制血管新生相關因子TNFa、IL-17、VEGF、Angl、Ang2的蛋白表達，同時上調血管新生相關受體Tie2、VEGFR2的蛋白表達有關。本發明所述的雷公藤甲素可應用于抑制RA滑膜血管新生的藥物中，開拓了雷公藤的新用途，為抑制RA滑膜血管新生的藥物提供了新選擇。


圖1為本發明所述雷公藤甲素對CIA大鼠滑膜血管的作用；圖2為本發明所述雷公藤甲素對CIA大鼠關節滑膜中⑶31表達的作用；圖3為本發明雷公藤甲素對小鼠基質膠栓子中血管形成的作用(100X)；圖4為本發明雷公藤甲素對VEGF誘導的HUVEC遷移的影響；圖5為本發明雷公藤甲素對VEGF誘導的HUVEC管腔形成能力的影響；圖6為本發明雷公藤甲素對VEGF誘導的RA-HFLS遷移的作用。圖中:Con代表空白組；Mod代表模型組；TP代表雷公藤甲素處理組。
具體實施方式
下面結合實例，對本發明的具體實施方式
作進一步詳細描述。以下實例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。實例I雷公藤甲素對CIA大鼠關節滑膜血管生成、血管標志物⑶31表達、血管密度的作用本試驗所采用動物為健康、雄性DA大鼠(哈爾濱醫科大學第二臨床醫院實驗動物中心)，SPF級，60只，體重170±5g。恒溫、恒濕喂養3天。實驗期間自由飲水，飼固體飼料，喂養于中國中醫科學院基礎理論研究所實驗動物中心。本試驗所采用造模方法:按將0.lmol/L冰醋酸溶液加入牛II型膠原(購自Chondrex公司，批號:080280)中，4°C過夜,再加入等體積不完全弗氏佐劑(Chondrex公司，批號:090070)充分乳化，得到終濃度為lmg/ml的膠原乳化劑。給予除正常對照組外大鼠尾根部2 3cm處皮內注射膠原乳劑(100 μ I/只)，注射當日記為免疫第O天，第7天再次注射同等量膠原乳化劑，激活免疫。正常對照組以等量生理鹽水對照處理。本試驗取適量雷公藤甲素(福建醫學科學院林綏教授提供)，適量二甲基亞砜DMSO(含量< 0.05% )溶解過夜，再用生理鹽水配制成母液，4°C保存。給藥劑量分別為
11μ g/kg，22 μ g/k g和45 μ g/kg ;給藥途徑為腹腔灌胃給藥；給藥體積為lml/100g體重大鼠，給藥時間從第0-35天，每天一次。本試驗空白對照為等體積生理鹽水。本試驗數據均以SPSS軟件處理。實驗結果見圖1-2和表1-2所示。1.1雷公藤甲素對CIA大鼠關節滑膜血管生成的作用炎癥關節組織HE染色實驗結果顯示，CIA模型大鼠關節滑膜細胞排列紊亂，增生明顯，并呈絨毛狀、或乳頭狀伸向關節腔深處，可見明顯的新血管增生，新生血管多為毛細血管，由I到2層內皮細胞構成，無平滑肌細胞圍繞，還可見大量未形成管腔結構的新生血管呈點狀散在分布在滑膜當中。雷公藤甲素能明顯抑制滑膜細胞的增生，減少滑膜中毛細血管和未形成管腔結構的新生血管的數量。見圖1。1.2雷公藤甲素對CIA大鼠關節滑膜血管標志物⑶31表達和血管密度的作用⑶31是血小板源內皮細胞黏附分子，是血管內皮細胞標志物。炎癥關節⑶31免疫組化染色實驗結果顯示(圖2，表1)，正常大鼠滑膜血管中⑶31基本無表達，CIA模型大鼠關節滑膜中血管內皮細胞及滑膜細胞可見陽性表達，陽性細胞呈棕色。經雷公藤甲素治療后能明顯抑制滑膜組織中⑶31的陽性表達。圖像分析結果顯示CIA模型大鼠滑膜組織中⑶31陽性表達的IOD明顯升高，雷公藤甲素能量效依賴的抑制滑膜中⑶31的10D，且22 45ug/kg劑量的作用顯著。進一步從⑶31特異性染色得到的滑膜血管密度結果顯示(表2)，CIA模型成功后，關節滑膜血管大量增生，血管增生以小血管為主，雷公藤甲素能抑制滑膜小血管的增生。表I雷公藤甲素對CIA大鼠關節滑膜中⑶31表達的作用
權利要求
1.雷公藤甲素在制備抑制RA滑膜血管新生藥物中的應用。
2.一種抑制RA滑膜血管新生的藥物，其特征在于，該藥物的有效成分包括雷公藤甲素。
3.如權利要求2所述的藥物，其特征在于，所述藥物被制成經胃腸道給藥劑型或非胃腸道給藥劑型。
4.如權利要求2所述的藥物，其特征在于，所述藥物為口服劑。
5.如權利要求2-4任意一項所述的藥物，其特征在于，該藥物用于動物實驗的有效劑量為 11 45 μ g/kgo
6.如權利要求2-4任 意一項所述的藥物，其特征在于，該藥物用于細胞實驗的有效劑量為I 50ng/ml。
全文摘要
本發明提供了雷公藤甲素在制備抑制類風濕性關節炎(RA)滑膜血管新生藥物中的應用。本發明所述的雷公藤甲素可應用于抑制RA滑膜血管新生的藥物中，開拓了雷公藤的新用途，為抑制RA滑膜血管新生的藥物提供了新選擇。
文檔編號A61P37/02GK103156864SQ20111042115
公開日2013年6月19日 申請日期2011年12月15日 優先權日2011年12月15日
發明者林娜, 劉春芳, 孔祥英, 郭煒, 李香斌 申請人:中國中醫科學院中藥研究所