專利名稱：蛙皮提取物及其提取方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，特別涉及蛙皮提取物及其提取方法。
背景技術：
膠原蛋白(collagen)是一種含糖蛋白質，在自然界廣泛分布，主要分布在動物的結締組織中，作為皮膚、骨骼、肌腱、韌帶、血管的構成材料；人體成分中有16%左右是蛋白質，膠原蛋白占體內蛋白質總量的30 40%，是人體內含量最多的蛋白質；膠原蛋白富含人體需要的甘氨酸、脯氨酸、羥脯氨酸等氨基酸。膠原蛋白是人體組織結構的主要成分之一，也是人體內含量最多的一種蛋白質，約占人體蛋白質總量的1/3，相當于人體體重的6%，它遍及全身的各個組織器官，如皮膚、骨骼、軟骨、韌帶、角膜、各種內膜、筋膜等，是維持皮膚與組織器官形態、結構的主要成分，也是修復各損傷組織的重要原料物質。當膠原蛋白不足時，不僅皮膚及骨骼會出現問題，對內臟器官也會產生不利影響。膠原蛋白是維持身體正常活動所不可缺少的重要成分，同時也是使身體保持年輕、防止老化的物質。另外，膠原蛋白還可以預防疾病，改善體質，對美容和健康都很有幫助。膠原蛋白是大分子蛋白質，分子量約為30 50萬道爾頓，而最適宜人體吸收的是分子量小于1500 1800D。并不能被人體直接吸收。食入含膠原蛋白的食物必須經消化道蛋白酶分解成單純的小分子氨基酸，才能被腸道吸收利用，再經過機體復雜的生物化學反應，合成人體需要的膠原蛋白，供給各組織器官的需要。人體吸收是以肽的方式進行，食用蛋白肽的吸收利用率可達100%。肽的分子量、氨基酸排列順序不同所表現的功能不同。蛙皮是蛙科動物蛙的干燥皮膚，該動物為野生或養殖動物，其富含膠原蛋白、大孔多肽因子、透明質酸等成分。其中的膠原蛋白能有效增強人體皮膚組織細胞的儲水功能，人體經常補充膠原蛋白可增加肌膚彈性，保持皮膚柔軟、細嫩，也能使體內的血管、骨骼和神經保持韌性和彈性，淡化黑斑，降低血壓等功效。蛙皮中的多肽具有廣譜抗菌作用，對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌尤其對耐藥菌株具有明顯的抑制作用，還可以用來治療胃痛、痢疾、腸炎等炎性疾病。目前提取蛙膠原蛋白的方法收率不高，獲得的蛙膠原蛋白含量較低。因此，提供蛙膠原蛋白含量較高的蛙皮提取物及提取方法，具有現實意義。

發明內容
有鑒于此，本發明提供蛙皮提取物及其提取方法。該提取方法通過生物酶解技術，能夠有效提取獲得蛙皮提取物，獲得的蛙皮提取物中蛙膠原蛋白的純度達54. 6 56. 2%0為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案本發明提供了一種蛙皮提取物的提取方法，包括如下步驟取蛙皮膚經-80 -75°C冷凍干燥4 6h，粉碎過20 40目篩、預處理后，在37 38°C，加醋酸或鹽酸酸化，調節pH值為2 3的條件下，加入酶活力為10萬IU/g的胃蛋白酶和酶活力為140萬IU/g的纖維酶進行酶解12 15h，獲得酶解液，60°C酶滅活后，3000r/min離心收集上清液，用碳酸鈉或氫氧化鈉調節pH值為6 7，加入中性鹽或強酸弱堿鹽經鹽析后收集沉淀，3 5°C透析20 24h后于60°C真空濃縮至相對密度為1. 15 1. 20，高壓滅菌后經-80 _75°C冷凍干燥10 12h，即得；所述蛙皮膚、所述胃蛋白酶、所述纖維酶的質量比為100 0.5 1.0 1. 0 1. 5 ；所述透析的截留分子量為500 1500Da。鹽析過程中，加入中性鹽或強酸弱堿鹽至沉淀不再析出為止。以蛙皮膚為原料，采用復合生物酶解技術，破壞生物細胞壁，破壞蛙皮中膠原蛋白的纖維網狀結構，解開肽鏈，使溶媒直接深入生物細胞膜內與有效活性成分充分接觸，有利于活性成分的溶出。采用緩沖液透析技術除去膠原蛋白液中的鹽性成分及一些夾雜其中的小分子蛋白。在本發明的一些實施例中，本發明提供的提取方法，所述預處理為加水在55 60°C保溫Ih ；以g/mL計，所述蛙皮膚與水的質量體積比為1 8 10。在本發明的一些實施例中，本發明提供的提取方法，所述酸化為于37 38°C保溫12 1釙。在本發明的一些實施例中，本發明提供的提取方法，所述高壓滅菌具體為在300 500MPa、15 35°C的條件下滅菌8 lOmin。本發明還提供了上述提取方法獲得的蛙皮提取物。本發明提供的蛙皮提取物可以制備革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌抑制劑。本發明提供的蛙皮提取物可以制備預防或/和治療炎癥藥物。本發明提供的蛙皮提取物可以制備預防或/和治療胃炎、痢疾、腸炎藥物。本發明提供的蛙皮提取物可以制備降血壓藥物。本發明提供的蛙皮提取物可以制備淡化色斑、減少皺紋、增加皮膚彈性、提亮膚色藥物、保健品。本發明提供蛙皮提取物及其提取方法。該提取方法通過生物酶解技術，破壞生物細胞壁，破壞蛙皮中膠原蛋白的纖維網狀結構，解開肽鏈，使溶媒直接深入生物細胞膜內與有效活性成分充分接觸，有利于活性成分的溶出。采用緩沖液透析技術除去膠原蛋白液中的鹽性成分及一些夾雜其中的小分子蛋白，采用冷凍干燥技術將膠原蛋白液低溫冷凍至海綿狀膠原蛋白，能夠有效提取獲得蛙皮提取物，獲得的蛙皮提取物中蛙膠原蛋白的純度達54. 6 56. 2%，獲得的蛙皮提取物能夠有效治療胃炎、腸炎、痢疾，對胃炎的治療有效率由69. 67%提高至83. 67%，對腸炎的治療有效率由74. 67%提高至90. 33%，對痢疾的治療有效率由74. 33%提高至88. 67%，差異均具有顯著性(P < 0. 05)。本發明提供的蛙皮提取物治療黃褐斑的有效率在95.0%，改善細紋的有效率在97. 5 %，改善皮膚暗黃的有效率在96. O %，能夠有效改善黃褐斑、細紋、皮膚暗黃。本發明提供的蛙皮提取物還能夠有效降低高血壓。
具體實施例方式本發明公開了蛙皮提取物及其提取方法，本領域技術人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的方法及應用已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本發明內容、精神和范圍內對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。本發明提供的蛙皮提取物中所用蛙皮膚、試劑均可由市場購得。下面結合實施例，進一步闡述本發明實施例1蛙皮提取物的制備取干燥的林蛙皮膚100g，浸漬于0.5%的氫氧化鈉堿溶液中，浸泡至軟化，于_75°C低溫冷凍干燥乩，粉碎成40目粗粉，加入8倍量水攪拌加熱至60°C，保溫1小時，冷卻至37°C，加入醋酸酸化，調節pH值為3，攪拌均勻，37°C保溫15小時，調節pH值為3，加入0. 5g胃蛋白酶(酶活力為10萬IU/g)與1. Og的纖維酶(酶活力為140萬IU/g)，攪拌均勻，進行生物酶解12小時，加熱至60°C，使酶滅活，3000轉/分鐘高速離心，取上清液，用10%的碳酸鈉溶液調PH值至6 7，加入飽和硫酸銨溶液進行鹽析直至無沉淀析出，過濾收集沉淀，向沉淀中加入純化水使之溶解，裝入半透膜透析袋(截留分子量為1500Da)中，置于盛有純化水的不銹鋼桶中，在5°C環境中透析22h，中間進行3 4次更換純化水，保留液60°C真空濃縮至相對密度1. 15 (60°C )，將濃縮液裝入藥用真空復合袋中，密封包裝，置入超高壓滅菌設備內膽中，在400MPa高壓、28°C的條件下滅菌9分鐘，取出濃縮液置冷凍干燥機中_80°C干燥10h，成海綿狀白色或淡黃色固體，在十萬級潔凈環境中粉碎成100目細粉，批混，包裝，入庫。對獲得的海綿狀白色或淡黃色固體，即蛙皮提取物進行檢測，結果如下膠原蛋白的鑒別氨基酸和聚丙烯酰胺凝膠電泳均符合膠原蛋白的特征，本發明提供的蛙皮提取物中含有蛙膠原蛋白。膠原蛋白含量54. 6% (請補充測定方法)膠原蛋白分子量測定3000Da(參考2010年藥典二部附錄VH)。實施例2蛙皮提取物的制備取干燥的林蛙皮100g，浸漬于0. 5%的氫氧化鈉堿溶液中，浸泡至軟化，于_78°C低溫干燥4h，粉碎成20目粗粉，加入10倍量水攪拌加熱至58°C，保溫1小時，冷卻至38°C，加入鹽酸酸化，調節PH值為2，攪拌均勻，38°C保溫12小時，調節pH值為2，加入l.Og胃蛋白酶(酶活力為10萬IU/g)與1. 2g的纖維酶(酶活力為140萬IU/g)，攪拌均勻，進行生物酶解15小時，加熱至60°C，使酶滅活，3000轉/分鐘高速離心，取上清液，用10 %的氫氧化鈉溶液調PH值至中性，加入飽和硫酸銨溶液進行鹽析直至無沉淀析出，過濾收集沉淀，向沉淀中加入純化水使之溶解，裝入半透膜透析袋(截留分子量為500Da)中，置于盛有純化水的不銹鋼桶中，在;TC環境中透析Mh，中間進行3 4次更換純化水，保留液60°C真空濃縮至相對密度1. 18(60°C )，將濃縮液裝入藥用真空復合袋中，密封包裝，置入超高壓滅菌設備內膽中，在500MPa高壓、20°C的條件下滅菌8分鐘，取出濃縮液置冷凍干燥機中_75°C干燥12h，成海綿狀白色或淡黃色固體，在十萬級潔凈環境中粉碎成100目細粉，批混，包裝，入庫。對獲得的海綿狀白色或淡黃色固體，即蛙皮提取物進行檢測，結果如下膠原蛋白的鑒別氨基酸和聚丙烯酰胺凝膠電泳均符合膠原蛋白的特征，本發明提供的蛙皮提取物中含有蛙膠原蛋白。膠原蛋白含量56. 2% (請補充測定方法)膠原蛋白分子量測定1500Da(參考2010年藥典二部附錄VH)。
實施例3蛙皮提取物的制備取干燥的林蛙皮膚100g，浸漬于0.5%的氫氧化鈉堿溶液中，浸泡至軟化，于_76°C低溫干燥釙，粉碎成30目粗粉，加入9倍量水攪拌加熱至55°C，保溫1小時，冷卻至37. 5°C，加入醋酸酸化，調節pH值為2，攪拌均勻，37. 5°C保溫14小時，調節pH值為2，加入0.8g胃蛋白酶(酶活力為10萬IU/g)與1.5g的纖維酶(酶活力為140萬IU/g)，攪拌均勻，進行生物酶解14小時，加熱至60°C，使酶滅活，3000轉/分鐘高速離心，取上清液，用10%的碳酸鈉溶液調PH值至中性，加入飽和硫酸銨溶液進行鹽析直至無沉淀析出，過濾收集沉淀，向沉淀中加入純化水使之溶解，裝入半透膜透析袋(截留分子量為IOOODa)中，置于盛有純化水的不銹鋼桶中，在4°C環境中透析20h，中間進行3 4次更換純化水，保留液60°C真空濃縮至相對密度1.20(60°C )，將濃縮液裝入藥用真空復合袋中，密封包裝，置入超高壓滅菌設備內膽中，在300MPa高壓、35°C的條件下滅菌10分鐘，取出濃縮液置冷凍干燥機中_78°C干燥llh，成海綿狀白色或淡黃色固體，在十萬級潔凈環境中粉碎成100目細粉，批混，包裝，入庫。對獲得的海綿狀白色或淡黃色固體，即蛙皮提取物進行檢測，結果如下膠原蛋白的鑒別氨基酸和聚丙烯酰胺凝膠電泳均符合膠原蛋白的特征，本發明提供的蛙皮提取物中含有蛙膠原蛋白。膠原蛋白含量55. 3% (請補充測定方法)膠原蛋白分子量測定2660Da(參考2010年藥典二部附錄VH)。實施例4抑菌效果評價對照組將本發明實施例1至3提供的蛙皮提取物5g，加入融化并冷至50°C左右的定量MH瓊脂中，制成含蛙皮提取物的平板，分別接種受試菌，孵育后觀察細菌生長情況；試驗組在50°C左右的定量MH瓊脂中，分別接種受試菌，孵育后觀察細菌生長情況。本發明實施例1至3提供的蛙皮提取物對大多數革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有抑制作用。特別是對革蘭氏陰性菌作用顯著(P <0.05)，如大腸桿菌、沙門氏菌、傷寒桿菌、產氣桿菌、克雷伯氏桿菌、巴氏桿菌、布氏桿菌、痢疾桿菌等作用較強，對革蘭氏陽性菌中如炭疽桿菌、葡萄球菌、棒狀桿菌、肺炎球菌、鏈球菌、腸球菌和放線菌的作用也較顯著(P ^ 0. 05)。實施例5微生物檢測結果本發明實施例1至3提供的蛙皮提取物中微生物檢測結果見表1。表1微生物檢測結果
權利要求
1.一種蛙皮提取物的提取方法，其特征在于，包括如下步驟取蛙皮膚經-80 -75 °C冷凍干燥4 6h，粉碎過20 40目篩、預處理后，在37 38°C，加醋酸或鹽酸酸化，調節pH值為2 3的條件下，加入酶活力為10萬IU/g的胃蛋白酶和酶活力為140萬IU/g的纖維酶進行酶解12 15h，獲得酶解液，60°C酶滅活后，3000r/min離心收集上清液，用碳酸鈉或氫氧化鈉調節pH值為6 7，加入中性鹽或強酸弱堿鹽經鹽析后收集沉淀，3 5°C透析20 24h后于60°C真空濃縮至相對密度為1. 15 1. 20，高壓滅菌后經-80 _75°C冷凍干燥10 12h，即得；所述蛙皮膚、所述胃蛋白酶、所述纖維酶的質量比為100 0.5 1.0 1. 0 1. 5 ；所述透析的截留分子量為500 1500Da。
2.根據權利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述預處理為加水在55 60°C保溫Ih;以g/mL計，所述蛙皮膚與水的質量體積比為1 8 10。
3.根據權利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述加酸酸化為于37 38°C保溫12 1釙。
4.根據權利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述高壓滅菌具體為在300 500MPa、20 的條件下滅菌8 IOmin。
5.根據權利要求1至4任一項所述提取方法獲得的蛙皮提取物。
6.根據權利要求5所述的蛙皮提取物在制備革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌抑制劑中的應用。
7.根據權利要求5所述的蛙皮提取物在制備預防或/和治療炎癥藥物中的應用。
8.根據權利要求5所述的蛙皮提取物在制備預防或/和治療胃炎、痢疾、腸炎藥物中的應用。
9.根據權利要求5所述的蛙皮提取物在制備降血壓藥物中的應用。
10.根據權利要求5所述的蛙皮提取物在制備淡化色斑、減少皺紋、增加皮膚彈性、提亮膚色藥物或保健品中的應用。
全文摘要
本發明涉及生物技術領域，特別涉及蛙皮提取物的提取方法。該提取方法通過生物酶解技術，能夠有效提取獲得蛙皮提取物，其中蛙膠原蛋白的純度達54.6～56.2％。獲得的蛙皮提取物或能夠有效治療胃炎、腸炎、痢疾，治療黃褐斑的有效率在95.0％，改善細紋的有效率在97.5％，改善皮膚暗黃的有效率在96.0％，還能夠有效降低高血壓。
文檔編號A61P1/00GK102559823SQ20121000375
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月6日 優先權日2012年1月6日
發明者馮濤, 白鳳英, 金愛玉 申請人:吉林省宏久生物科技股份有限公司