專利名稱：共刺激因子及融合蛋白的新用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及共刺激因子B7. I及B7. I融合蛋白的新用途。
背景技術：
宮頸癌是女性常見惡性腫瘤之一，它是由人類乳頭瘤病毒(Human Papillomavirus,簡稱HPV)引起的，HPV病毒可直接通過皮膚接觸傳播,有十幾年的潛伏期，故初期沒有任何癥狀。在全球范圍內，全球每年大約有50萬女性罹患宮頸惡性腫瘤，死于宮頸惡性腫瘤的超過25萬人。在發展中國家，宮頸癌則屬于常見多發的婦科腫瘤，排行榜首。當宮頸癌的癥狀出現三個月后就診者已有2/3為癌癥晚期，因此宮頸瘤成為了威脅女生生命的頭號殺手。
盡管宮頸瘤是迄今為止唯一找出治病原因的癌癥，但是對于其治療目前仍與一般腫瘤治療方案一致，均采用化療放療，常規放化療基本不具備針對腫瘤的特異性，放化療在破壞癌細胞的同時對正常細胞也產生殺傷作用，從而對人體產生很大的毒副作用，同時還會導致宿主免疫系統的破壞，放化療后易引起多種并發癥而且腫瘤易復發，常規放化療的特點造成腫瘤治療的療效和預后都不是很理想，目前腫瘤免疫治療成為一種較為安全有效的方式。
腫瘤免疫治療是直接或間接利用自身的免疫系統，抑制腫瘤細胞生長、轉移、清除腫瘤細胞的方法，腫瘤免疫治療機理與其它治療手段相比，具有作用特異性高、范圍廣泛、 毒副作用小等特點。B7. I-Fc是免疫刺激因子融合蛋白(Aihong Liu, Peisheng Hu ；Clin Cancer Res 2005 ； 11 (23) December 1，2005，8492-8502)，它是由 CD80 胞外部分融合在人 Ig抗體恒定區的Fe片段N-端構成的融合蛋白，目前已經報道的B7. I-Fc中，Fe來自于免疫球蛋白IgG，特別是IgGl。B7. I-Fc融合蛋白在宿主的APC細胞將腫瘤抗原信息遞呈給體內腫瘤免疫殺傷細胞的同時，共刺激因子B7. I與CD28結合激活T細胞，從而對腫瘤細胞產生系列免疫攻擊，達到殺滅腫瘤細胞的作用。同時B7. I-Fc融合蛋白不僅能與CD28結合， 激活T細胞，也可與CTLA-4結合，終止T細胞的激活途徑，從而避免出現T-細胞的過度激活。B7. I-Fc融合蛋白的這種雙重作用，大大增強了以B7. I-Fc融合蛋白開發的抗腫瘤藥物的安全可控性。據有關研究報道免疫共刺激因子融合蛋白B7. I-Fc作為一種腫瘤免疫治療藥物，其在結腸癌、乳腺癌、纖維肉瘤癌具有一定的治療效果(CN200580042109. 0)。
目前，還未見將共刺激因子B7.I及B7. I融合蛋白用于治療宮頸癌的相關報道。發明內容
本發明的目的在于提供共刺激因子B7. I及B7. I融合蛋白的新用途。
本發明提供了共刺激因子B7. I及B7. I融合蛋白在制備治療宮頸癌、肉瘤或黑色素瘤的藥物中的用途。
其中，所述的B7. I融合蛋白是B7. 1-Fc。
進一步地，B7. I-Fc是融合到IgG Fe上的B7. I。
進一步優選地，所述IgG為IgGl。
進一步地,所述的藥物是治療宮頸癌、肉瘤的藥物。
進一步地，所述的藥物是治療宮頸癌的藥物。
其中，所述的藥物是以共刺激因子B7. I或B7. I融合蛋白為有效成分，加上藥學上常用的輔料制備而成的制劑。
進一步地，所述的B7. I融合蛋白是B7. I-Fc0
更進一步地，所述B7. I-Fc由B7. I與IgG Fe連接而成。
進一步優選地，所述IgG為IgGl。
其中，所述的制劑為注射劑。
根據藥理實驗換算可知，所述的制劑中，每日用單位制劑中B7. I-Fc的含量為192_384ug。
免疫共刺激因子融合蛋白B7. 1-Fc，特別是B7. 1/IgGlFc，能夠有效抑制宮頸癌或肉瘤的生長，特別是針對宮頸癌具有顯著的治療活性，其治療作用與陽性藥物相當，為臨床用藥提供了一種新的選擇。


圖1SDS-PAGE確認表達的B7. I-Fc的分子量譜圖，其中，I為非還原的B7. I-Fc圖譜、2為還原的B7. I-Fc圖譜、3為標準分子量標記物；
圖2HPLC純度測定圖譜
圖3B7. I-Fc給藥后U14荷瘤鼠體重變化
圖4B7. I-Fc對小鼠宮頸癌(U14)腫瘤抑制作用
圖5B7. I-Fc給藥后S180荷瘤鼠體重變化
圖6B7. I-Fc對小鼠肉瘤(S180)腫瘤抑制作用
圖7B7. I-Fc給藥后B16-F10荷瘤鼠體重變化
圖8B7. I-Fc對小鼠黑色素瘤(B16-F10)腫瘤抑制作用具體實施方式
實施例I本發明中B7. I-Fc的制備
利用基因重組技術制備B7. I-Fc融合蛋白，按照生物領域技術人員熟知方法，通過PCR技術獲得構建B7. I-Fc表達載體，轉入小鼠骨髓瘤NSO細胞篩選獲得長期穩定表達融合蛋白B7. I-Fc的工程細胞，然后通過流加培養獲得高表達的B7. I-Fc培養上清，然后再通過蛋白A親和層析和離子交換層析依次純化獲得高純度融合蛋白，4°C保存。
本發明中B7. I-Fc的制備方法可以參照CN200580042109. 0中的制備方法，所述 B7. I-Fc是指B7. 1/IgGlFc，即B7. I和IgGlFc的融合蛋白，其序列表參見Aihong Liu, Peisheng Hu ；Clin Cancer Res 2005 ；11 (23)December 1,2005,8492-8502。
將制備得到的B7. I-Fc測定分子量，測定圖譜見圖I ;并通過HPLC測定其純度，測定圖譜參見圖2。
實施例2免疫共刺激因子融合蛋白B7. I-Fc藥效學實驗
I、受試樣品及劑量設計
名稱免疫共刺激因子融合蛋白B7. 1/IgGlFc (簡稱B7. I-Fc)按實施例I制備
提供者軍事醫學科學院微生物流行病學研究所
性狀無色、澄清液體
保存條件4°C保存
給藥途徑尾靜脈注射
溶劑生理鹽水
2、陽性對照
注射用環磷酰胺；紫杉醇
3、腫瘤細胞株
小鼠宮頸癌U14、小鼠肉瘤S180、小鼠黑色素瘤B16-F10，均可通過購買市售商品得到
4、動物
BALB/c小鼠，SPF/VAF級由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，合格證號 SCXK (京)2009-0004
5、飼養設施條件
中國醫學科學院藥物研究所動物實驗中心屏障設施，許可證號 SYXK (京)2009-0004
6、實驗方法
(I)腫瘤細胞培養及接種
小鼠宮頸癌U14、小鼠肉瘤S180、小鼠黑色素瘤B16-F10細胞體外培養至相當數量。消化、洗滌、離心，計數細胞，配制細胞密度為5xl06/ml細胞懸液。小鼠局部消毒后側背部接種，注射體積0. Iml/只。
(2)給藥劑量及給藥方式
每日觀察腫瘤生長變化，于接種后4天確認腫瘤生長時，將荷瘤鼠按瘤體積大小隨機分組。設陰性對照組，腫瘤自然生長；陽性對照組為注射用環磷酰胺、紫杉醇給藥組， 按人用劑量折算，小鼠以lOOmg/kg—1劑量，視腫瘤生長情況間斷腹腔注射給藥；融合蛋白 B7. I-Fc按照SOdOJOug/kg—1三個劑量尾靜脈給藥，每天I次，連續5天。每組小鼠15只， 并與當日全部給藥。
(3)觀察指標
實驗過程中，每2-3日監測實驗動物腫瘤長、寬徑及體重。觀察至接種后第30天左右頸椎處死小鼠，結束實驗。實驗結束時，剝離腫瘤，稱瘤重，拍腫瘤對比照片，分別參見圖4、6、8。本發明中采用相對腫瘤增殖率T/C(%)作為試驗評價指標，用以評價藥物的抗腫瘤活性，計算方法參見《細胞毒類抗腫瘤藥物非臨床研究技術指導原則》。同時，還為各種荷瘤小鼠稱重，以便確認B7. I-Fc對機體的不良反應，參見圖3、5、7。
實驗結果
(1)B7. I-FC對小鼠腫瘤宮頸癌U14腫瘤生長抑制作用
表1B7. I-Fc對U14腫瘤生長抑制作用
權利要求
1.共刺激因子B7.I及B7. I融合蛋白在制備治療宮頸癌、肉瘤或黑色素瘤的藥物中的用途。
2.根據權利要求I所述的用途，其特征在于所述的B7.I融合蛋白是B7. I-Fc0
3.根據權利要求2所述的用途，其特征在于所述B7.I-Fc由B7. I與IgG Fe連接而成。
4.根據權利要求3所述的用途，其特征在于所述IgG為IgGl。
5.根據權利要求1-4任意一項所述的用途，其特征在于所述的藥物是治療宮頸癌、肉瘤的藥物。
6.根據權利要求5所述的用途，其特征在于所述的藥物是治療宮頸癌的藥物。
7.根據權利要求1-6任意一項所述的用途，其特征在于所述的藥物是以共刺激因子 B7. I或B7. I融合蛋白為有效成分，加上藥學上常用的輔料制備而成的制劑。
8.根據權利要求7所述的用途，其特征在于所述的B7.I融合蛋白是B7. I-Fc0
9.根據權利要求8所述的用途，其特征在于所述B7.I-Fc由B7. I與IgG Fe連接而成。
10.根據權利要求7-9任意一項所述的用途，其特征在于所述的制劑為注射劑。
全文摘要
本發明公開了B7.1及B7.1融合蛋白在制備治療宮頸癌、肉瘤或黑色素瘤的藥物中的用途。免疫共刺激因子融合蛋白B7.1-Fc，特別是B7.1/IgG1Fc，能夠有效抑制宮頸癌或肉瘤的生長，特別是針對宮頸癌具有顯著的治療活性，其治療作用與陽性藥物相當，為臨床用藥提供了一種新的選擇。
文檔編號A61K39/395GK102526707SQ201210011148
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月13日 優先權日2012年1月13日
發明者彭紅衛, 徐小萍, 曹路君, 楊偉, 羅天學, 趙斌, 陳春會, 陳知航, 雒蓬軼 申請人:天津博發生物技術有限公司, 成都博發生物技術有限公司, 西藏天行生物藥業有限公司