專利名稱：氫氧化鋁凝膠-多糖復(fù)合免疫佐劑及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種氫氧化鋁-多糖復(fù)合免疫佐劑及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
佐劑作為改善機(jī)體對(duì)疫苗抗原的免疫應(yīng)答已經(jīng)有幾十年應(yīng)用的歷史了。疫苗中加入佐劑目的是為了加強(qiáng)抗原的免疫原性和免疫保護(hù)效果，表現(xiàn)為增強(qiáng)特異性抗原的特異性體液免疫和/或細(xì)胞免疫反應(yīng)，從而可以提高特異性抗體的產(chǎn)生或/和特異性細(xì)胞免疫功能，減少有效免疫接種所需的抗原量，減少需要加強(qiáng)免疫接種的頻率，提高早期免疫應(yīng)答和免疫功能不全者的應(yīng)答成功率等等。以氫氧化鋁和磷酸鋁為代表的鋁佐劑至今仍然是我國(guó)被批準(zhǔn)合法使用的人用疫苗佐劑。其主要功能為緩釋，但同時(shí)具有對(duì)免疫細(xì)胞的激活作用。將蛋白質(zhì)和氫氧化鋁或磷酸鋁混合注射，能夠使抗原保存在注射部位，即“庫(kù)存效應(yīng)”，具有抗原緩釋和非特異免疫刺激作用。氫氧化鋁或磷酸鋁對(duì)促進(jìn)抗原的吸收具有重要作用，但鋁鹽佐劑的作用機(jī)理目前尚不完全清楚。一般認(rèn)為鋁膠體對(duì)蛋白質(zhì)分子具有很好的吸附作用。大量的臨床免疫試驗(yàn)認(rèn)為氫氧化鋁膠體佐劑對(duì)Th2介導(dǎo)的體液免疫反應(yīng)具有很強(qiáng)的激發(fā)作用，而對(duì)Thl介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)的作用較弱。如何提高鋁佐劑的Thl介導(dǎo)的細(xì)胞免疫，既能有效地誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫，又能有效地誘導(dǎo)細(xì)胞免疫則是目前免疫佐劑研究的重點(diǎn)與難點(diǎn)。本領(lǐng)域目前需要提供新的、性能良好的免疫佐劑，為疫苗的制備提供新的有效選擇。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種新的、性能良好的復(fù)合免疫佐劑，為本領(lǐng)域提供一種新的有效選擇。解決該技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案是提供一種復(fù)合免疫佐劑。該復(fù)合免疫佐劑主要含有氫氧化鋁凝膠和細(xì)菌來(lái)源的多糖。其中，上述復(fù)合免疫佐劑所述細(xì)菌來(lái)源的多糖為大腸桿菌來(lái)源的多糖和傷寒桿菌來(lái)源的多糖。其中，上述復(fù)合免疫佐劑中所述細(xì)菌來(lái)源的多糖和氫氧化鋁凝膠的重量配比為 1 0.5 100。優(yōu)選的，上述復(fù)合免疫佐劑中所述細(xì)菌來(lái)源的多糖和氫氧化鋁凝膠的重量配比為1 1 25。其中，上述復(fù)合免疫佐劑中所述氫氧化鋁凝膠為粒徑為2 μ m 4 μ m的氫氧化鋁顆粒。粒徑3μπ 左右為佳。本發(fā)明另外還提供了上述復(fù)合免疫佐添加抗原形成的免疫佐劑-抗原復(fù)合物。免疫佐劑-抗原復(fù)合物在本領(lǐng)域也可稱為疫苗。其中，上述免疫佐劑-抗原復(fù)合物中所述抗原的含量為復(fù)合免疫佐劑中細(xì)菌來(lái)源的多糖的重量配比為1 0.02 500。進(jìn)一步的，上述免疫佐劑-抗原復(fù)合物中所述抗原的含量為復(fù)合免疫佐劑中細(xì)菌來(lái)源的多糖的重量配比為1 1 200。其中，上述免疫佐劑-抗原復(fù)合物中所述抗原為乙型肝炎表面抗原HBsAg蛋白或血管生成因子bFGF蛋白。本發(fā)明另外還提供了制備上述的免疫佐劑-抗原復(fù)合物的方法。該方法包括以下步驟a、取所需量的氫氧化鋁凝膠用水稀釋；b、加入所需的多糖，混勻；C、加入所需抗原，混勻。進(jìn)一步的，上述的所需抗原為HBsAg或bFGF。本發(fā)明同時(shí)提供了上述免疫佐劑-抗原復(fù)合物在制備疫苗中的用途。所述疫苗為預(yù)防和/或治療性疫苗。比如當(dāng)抗原為HBsAg等肝炎抗原時(shí)，可以制備成為肝炎疫苗，比如當(dāng)抗原為血管生成因子(如bFGF)或者腫瘤特異性抗原時(shí)，可以制備預(yù)防和/或治療性腫
瘤疫苗。根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面，為了開(kāi)發(fā)更優(yōu)秀的免疫佐劑。本發(fā)明前期研究了氫氧化鋁凝膠、水凝膠(Hydrogel)、脂質(zhì)體、Lipid Α、甘露聚糖、多糖(細(xì)菌來(lái)源)等佐劑。偶然發(fā)現(xiàn)氫氧化鋁凝膠/細(xì)菌多糖(A1-PQ組合作為佐劑，既能有效地誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫，又能有效地誘導(dǎo)細(xì)胞免疫。為了構(gòu)建好的可用于免疫佐劑的氫氧化鋁多糖考察了多種氫氧化鋁多糖配方。本發(fā)明進(jìn)一步對(duì)不同種類的多糖進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)使用大腸桿菌來(lái)源的多糖和傷寒桿菌來(lái)源的多糖與氫氧化鋁的復(fù)合物作為佐劑制成的疫苗，在肝炎疫苗模型中，體內(nèi)產(chǎn)生了針對(duì)HBsAg 的高滴度的抗體；在腫瘤疫苗模型中，體內(nèi)產(chǎn)生了針對(duì)bFGF的抗體，且能有效抑制腫瘤生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移。同時(shí)，為了取得更好的效果，對(duì)氫氧化鋁和多糖使用劑量進(jìn)行了篩選，完成了對(duì)氫氧化鋁和多糖配方的優(yōu)化。免疫試驗(yàn)中通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)佐劑——弗氏佐劑比較，本發(fā)明氫氧化鋁多糖作為佐劑產(chǎn)生的抗體滴度也令人滿意。在以bFGF作為抗原的動(dòng)物腫瘤模型實(shí)驗(yàn)中， 用氫氧化鋁多糖包裹bFGF制備得到的bFGF氫氧化鋁多糖疫苗也能得到該免疫效果，甚至更好。同時(shí)，bFGF氫氧化鋁多糖疫苗的抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的效果也不低于弗氏佐劑。本發(fā)明得到了新型的疫苗佐劑-氫氧化鋁凝膠/多糖復(fù)合免疫佐劑，可適用于肝炎等傳染病疫苗和腫瘤疫苗的研發(fā)。其作用機(jī)制初步分析可能為氫氧化鋁凝膠中鋁鹽與抗原結(jié)合形成抗原貯存庫(kù)，使抗原得以緩慢穩(wěn)定地釋放，鋁鹽佐劑能誘導(dǎo)、激發(fā)體液免疫，多糖則能激活1\8^0、離、01、1^1(等免疫細(xì)胞活性，這樣既可以激發(fā)體液免疫，又能夠激發(fā)細(xì)胞免疫。本發(fā)明的有益效果為本發(fā)明創(chuàng)造性地開(kāi)發(fā)出了氫氧化鋁-多糖復(fù)合佐劑，具有免疫活性強(qiáng)、臨床安全性高等優(yōu)點(diǎn)，和單獨(dú)的氫氧化鋁或細(xì)菌多糖作為佐劑時(shí)具有協(xié)同效果，是一種優(yōu)秀的針對(duì)各種抗原的氫氧化鋁-多糖復(fù)合免疫佐劑。試驗(yàn)表明，使用本發(fā)明的氫氧化鋁多糖作為佐劑制備疫苗，可具有更高的免疫效果和抗腫瘤效果，為疫苗的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供了新的選擇。


圖1為HBsAg蛋白與氫氧化鋁凝膠/E. coli.多糖復(fù)合物免疫后，各組小鼠的抗體滴度產(chǎn)生情況。圖2為HBsAg蛋白與氫氧化鋁凝膠/E. coli.多糖復(fù)合物免疫后，ELISP0T檢測(cè)淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IL-4和IFN- γ的情況。圖3為HBsAg蛋白與氫氧化鋁凝膠/傷寒桿菌多糖復(fù)合物免疫后，各組小鼠的抗體滴度產(chǎn)生情況。圖4為HBsAg蛋白與氫氧化鋁凝膠/傷寒桿菌多糖復(fù)合物免疫后，ELISP0T檢測(cè)淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IL-4和IFN- γ的情況。圖5為bFGF-氫氧化鋁凝膠/E. coli.多糖復(fù)合物免疫后，各組小鼠的抗體滴度產(chǎn)生情況。圖6為bFGF-氫氧化鋁凝膠/E. coli.多糖復(fù)合物免疫后，各組小鼠的IFN- γ表達(dá)水平測(cè)定結(jié)果。圖7為bFGF-氫氧化鋁凝膠/傷寒桿菌多糖復(fù)合物免疫后，各組小鼠的抗體滴度產(chǎn)生情況。圖8為bFGF-氫氧化鋁凝膠/傷寒桿菌多糖復(fù)合物免疫后，各組小鼠的IFN- γ表達(dá)水平測(cè)定結(jié)果。

圖9為bFGF-氫氧化鋁/E. coli.多糖復(fù)合物免疫后，各組小鼠的腫瘤生長(zhǎng)曲線比 較。圖10為bFGF-氫氧化鋁/E. coli.多糖復(fù)合物免疫后，小鼠肺部腫瘤結(jié)節(jié)比較結(jié)
yK o圖11為bFGF-氫氧化鋁/E. coli.多糖復(fù)合物免疫后，小鼠肺部重量比較結(jié)果。圖12為bFGF-氫氧化鋁/傷寒桿菌多糖復(fù)合物免疫后，各組小鼠的腫瘤生長(zhǎng)曲線 比較。圖13為bFGF-氫氧化鋁/傷寒桿菌多糖復(fù)合物免疫后，小鼠肺部腫瘤結(jié)節(jié)比較結(jié)
yK o圖14為bFGF-氫氧化鋁/傷寒桿菌多糖復(fù)合物免疫后，小鼠肺部重量比較結(jié)果。以上各圖中，1多”為大腸桿菌多糖，“傷多”為傷寒桿菌多糖，‘1じ，為氫氧化鋁凝膠。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明方法進(jìn)行進(jìn)ー步說(shuō)明。以下實(shí)施例使用的材料鋁佐劑ひ11^(^^61，氫氧化鋁凝膠)購(gòu)自丹麥肚一皿セ叫 Biosector(白色懸濁液，78.08加01，粒徑31^)，HBsム8(乙型肝炎表面抗原)購(gòu)自美國(guó) 八尺卩公司(American Rearch Products)，E.coli多糖、傷寒桿菌多糖購(gòu)自美國(guó)Sigma公司， bFGF (堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子)購(gòu)自美國(guó)R&D公司，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG購(gòu)自 SouthernBiotech &g,C57BL/6小鼠購(gòu)自重慶騰鑫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)施例ー復(fù)合佐劑的篩選及制備
本發(fā)明對(duì)脂質(zhì)體、氫氧化鋁凝膠、水凝膠、甘露聚糖、多糖(大腸桿菌來(lái)源或傷寒桿菌來(lái)源)等單獨(dú)或聯(lián)合作為佐劑加入抗原進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)氫氧化鋁凝膠/細(xì)菌多糖 (Al-PS)組合作為復(fù)合佐劑，既能有效地誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫，又能有效地誘導(dǎo)細(xì)胞免疫。這種復(fù)合佐劑采用了兩種成分其中氫氧化鋁凝膠佐劑，是一類含Al3+的無(wú)機(jī)鹽， 具有良好的吸附作用，能將可溶性抗原吸附于鋁膠分子表面；也是良好的沉淀劑，可以濃縮抗原，減少注射劑量。氫氧化鋁凝膠成本低廉、使用方便、無(wú)毒，是應(yīng)用最廣的一種佐劑，也是至今唯一被FDA批準(zhǔn)可用于人類疫苗的佐劑。而多糖，尤其是細(xì)菌來(lái)源的多糖作為一種天然來(lái)源的佐劑，也受到越來(lái)越多的關(guān)注，多糖不但能激活T、B、ΜΦ、NK、CTL、LAK等免疫細(xì)胞活性，激活網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)吞噬、清除老化細(xì)胞、異物及病原體，還能促進(jìn)IL-1， IL-2，TNF-α，INF-7等生成，調(diào)節(jié)抗體和補(bǔ)體形成，提高抗腫瘤免疫力能力。細(xì)菌來(lái)源的多糖作為免疫增強(qiáng)劑已經(jīng)應(yīng)用于臨床，并顯示出良好的安全性。本發(fā)明在氫氧化鋁型乙型肝炎疫苗的基礎(chǔ)上添加多糖佐劑，使得抗體的轉(zhuǎn)陽(yáng)率提高，轉(zhuǎn)陽(yáng)時(shí)間提前，并獲得了滴度更高的抗體；還采用氫氧化鋁凝膠/多糖(A1-PQ新型佐劑制備了一種新型bFGF疫苗(Al-PS-bFGF)，并證實(shí)了這一新型佐劑疫苗抗LL2肺癌的有效性。制備上述的免疫佐劑-抗原復(fù)合物的方法包括以下步驟a、取所需量的氫氧化鋁用水稀釋；b、加入所需量的多糖，混勻；C、加入所需量的抗原，如HBsAg或bFGF，混勻。經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的篩選試驗(yàn)，細(xì)菌來(lái)源多糖和氫氧化鋁凝膠的重量配比可為 1 0.5 1 100。優(yōu)選為1 1 1 25，均能有好的免疫佐劑的效果，本發(fā)明中多糖和氫氧化鋁凝膠重量配比是指固體物質(zhì)間的重量配比。氫氧化鋁凝膠一般使用為粒徑為2 μ m 4 μ m的氫氧化鋁顆粒。優(yōu)選為粒徑3 μ m 左右的氫氧化鋁顆粒。而經(jīng)過(guò)篩選，上述免疫佐劑-抗原復(fù)合物中所述抗原的含量與復(fù)合免疫佐劑中細(xì)菌來(lái)源的多糖的重量配比為1 0.02 1 500，優(yōu)選為1 1 1 200。顯然，本領(lǐng)域技術(shù)人員在使用不同抗原制備疫苗時(shí)，可以在上述范圍內(nèi)合理調(diào)整抗原和免疫佐劑中細(xì)菌來(lái)源的多糖的比例。也可以根據(jù)需要合理調(diào)整復(fù)合免疫佐劑中氫氧化鋁凝膠和細(xì)菌來(lái)源多糖的重量配比。比如，本發(fā)明中實(shí)例中，當(dāng)使用HBsAg作為抗原時(shí)免疫佐劑-抗原復(fù)合物中HBsiVg含量與復(fù)合免疫佐劑中細(xì)菌來(lái)源的多糖的重量配比可為1 1 500，優(yōu)選為1 10 200。而此時(shí)細(xì)菌來(lái)源多糖和氫氧化鋁凝膠的重量配比可為1 0.5 5，優(yōu)選為 1 1 1. 25。使用breF 時(shí)免疫佐劑-抗原復(fù)合物中bFGF含量與復(fù)合免疫佐劑中細(xì)菌來(lái)源的多糖的重量配比可為1 0.02 50(50 1 1 50)，優(yōu)選為1 0. 1 10。最優(yōu)選的比例為1 1。而此時(shí)細(xì)菌來(lái)源多糖和氫氧化鋁凝膠的重量配比可為1 5 1 100，優(yōu)選為1 10 1 50。最優(yōu)選為1 25。實(shí)施例二本發(fā)明使用E. coli多糖或傷寒多糖作為乙肝疫苗佐劑的動(dòng)物免疫試驗(yàn)一、分組1.單獨(dú)蛋白組=HBsAg蛋白0. 1 μ g/小鼠/次；2. Al (OH) 3 組=HBsAg 蛋白 0. 1 μ g+Al (OH) 3 25 μ g/ 小鼠 / 次；3. E. coli 多糖組=HBsAg 蛋白 0. 1 μ g+E. coli 多糖 20 μ g/ 小鼠 / 次；4. Al (OH) 3+E. coli 多糖組=HBsAg 蛋白 0. 1 μ g+Al (OH) 3 25 μ g+E. coli 多糖 20 μ g/小鼠/次；5. PBS 組:PBS+A1 (OH) 325 μ g+E. coli 多糖 20 μ g/ 小鼠 / 次。按上述分組分別免疫6周齡C57BL/6小鼠(每組五只)，兩周免疫一次，共三次。 分別在免疫后0、1、3、5、7、9、13、17周尾靜脈采血，分離血清，置于-20V保存待測(cè)。二、陽(yáng)轉(zhuǎn)率的測(cè)定通過(guò)ELISA法檢測(cè)各組小鼠血清中的抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率。檢測(cè)方法如下將HBsiVg蛋白用包被緩沖液(0. 05M碳酸鹽緩沖液，pH9. 6)稀釋至5 μ g/ml，在96孔板中每孔加入100 μ 1， 4°C過(guò)夜。PBST(PBS+0. 5% Tween20)洗滌3次。5%脫脂奶粉37°C封閉1小時(shí)，PBST洗滌 3次。1、3、5周的血清樣品用5%脫脂奶粉1 100稀釋，每孔加100 μ 1稀釋的血清樣品， 37°C孵育1小時(shí)。PBST洗滌5次。其后，每孔加入IOOyL HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG (1 3000 稀釋)，37°C孵育1小時(shí)。PBST洗滌5次。各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB溶液(KPL公司)100 μ 1，室溫顯色20分鐘后，加入0.5M H2SO4 100 μ 1終止反應(yīng)，450nm波長(zhǎng)讀數(shù)。各組的抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率見(jiàn)表1，結(jié)果表明單獨(dú)免疫HBsAg蛋白效果不佳，三次免疫后陽(yáng)轉(zhuǎn)率只有20 % ；以Al (OH) 3為佐劑可以提高抗體的陽(yáng)轉(zhuǎn)，三次免疫后的陽(yáng)轉(zhuǎn)率可達(dá)到100 % ； E. coli多糖作為佐劑可以使陽(yáng)轉(zhuǎn)率提高，兩次免疫后的陽(yáng)轉(zhuǎn)率從20%提高到80%，三次后達(dá)到100%;以Al (OH) 3+E. coli多糖復(fù)合佐劑效果更好，兩次免疫后即可使100%的小鼠陽(yáng)轉(zhuǎn)。表1各組的抗HBsAg的陽(yáng)轉(zhuǎn)率(％ )
權(quán)利要求
1.復(fù)合免疫佐劑，其特征在于含有氫氧化鋁凝膠和細(xì)菌來(lái)源的多糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)合免疫佐劑，其特征在于所述細(xì)菌來(lái)源的多糖為大腸桿菌來(lái)源的多糖或傷寒桿菌來(lái)源的多糖中的至少一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1 2任一項(xiàng)所述的復(fù)合免疫佐劑，其特征在于所述細(xì)菌來(lái)源的多糖和氫氧化鋁凝膠的重量配比為1 0.5 100。
4.根據(jù)權(quán)利要求13所述的復(fù)合免疫佐劑，其特征在于所述細(xì)菌來(lái)源的多糖和氫氧化鋁凝膠的重量配比為1 1 25。
5.根據(jù)權(quán)利要求1 4任一項(xiàng)所述的復(fù)合免疫佐劑，其特征在于所述氫氧化鋁凝膠為粒徑為2 μ m 4 μ m的氫氧化鋁顆粒。
6.免疫佐劑-抗原復(fù)合物，其特征在于含有抗原和權(quán)利要求1 5任一項(xiàng)所述的復(fù)合免疫佐劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的免疫佐劑-抗原復(fù)合物，其特征在于所述抗原與復(fù)合免疫佐劑中細(xì)菌來(lái)源的多糖的重量配比為1 0.02 500。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的免疫佐劑-抗原復(fù)合物，其特征在于所述抗原與復(fù)合免疫佐劑中細(xì)菌來(lái)源的多糖的重量配比為1 1 200。
9.根據(jù)權(quán)利要求6 8任一項(xiàng)所述的免疫佐劑-抗原復(fù)合物，其特征在于所述的抗原為HBsAg蛋白或bFGF蛋白。
10.制備權(quán)利要求6 9任一項(xiàng)所述的免疫佐劑-抗原復(fù)合物的方法，其特征在于包括以下步驟a、取所需量的氫氧化鋁用水稀釋；b、加入所需的多糖，混勻；C、加入所需抗原，混勻。
11.權(quán)利要求1 5任一項(xiàng)所述的復(fù)合免疫佐劑在制備疫苗中的用途。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種氫氧化鋁凝膠-多糖復(fù)合免疫佐劑及其制備方法和用途。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種性能良好的、新的免疫佐劑。解決該技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案是提供一種復(fù)合免疫佐劑。該復(fù)合免疫佐劑主要含有氫氧化鋁凝膠和細(xì)菌來(lái)源的多糖。本發(fā)明氫氧化鋁凝膠-多糖免疫佐劑具有免疫活性強(qiáng)、臨床安全性高等優(yōu)點(diǎn)，是一種優(yōu)秀的針對(duì)各種抗原的復(fù)合免疫佐劑。本發(fā)明的氫氧化鋁凝膠/多糖復(fù)合物作為佐劑制備的肝炎疫苗和腫瘤疫苗具有更強(qiáng)的免疫效果和抗腫瘤效果，為疫苗的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供了新的選擇。
文檔編號(hào)A61P1/16GK102526724SQ20121001121
公開(kāi)日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2012年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月14日
發(fā)明者楊莉, 王永生, 石華山, 魏于全 申請(qǐng)人:四川大學(xué)