專利名稱：survivin基因葉酸受體靶向的新型脂質體的制作方法
技術領域：
本發明涉及新型脂質體及其用途。基于急性髓細胞白血病細胞表面葉酸受體的高表達性與RNA干擾的用途，本發明公開了ー種葉酸受體靶向的新型脂質體。并利用細胞生物學技術與免疫學實驗對所述脂質體進行了功能驗證。
背景技術：
急性髓細胞白血病(acute myelocytic leukemia,AML)是多能干細胞或已輕度分化的前體細胞核型發生突變所形成的ー類疾病是造血系統的克隆性惡性疾病。人群接受大劑量放射線或長期接觸苯可增加這類疾病的發病率。AML是ー個具有高度異質性的疾病群，它可以由正常髓系細胞分化發育過程中不同階段的造血祖細胞惡性變轉化而來，起源于不同階段祖細胞的AML具有不同的生物學特征。對于AML的治療主要有三種誘導緩解化療、 緩解后治療和造血干細胞移植等，效果不是很明顯而且成本極高。AML患者總的完全緩解率僅50% 70%，長期無病生存率為25% 30%。伴隨著AML致病機制被逐漸的解密，分子靶向治療的發展成為了一種發展和趨勢。如正對髓系相關的CD33抗原使用的單克隆抗體已經成為了ー種新的治療方法，其他正對靶分子的方法還在不斷發展中[Blood，2010，115 453-474]。細胞凋亡(Apoptosis)是細胞生命周期中的重要組成部分。它是ー種不同于壞死而是由基因調控的細胞主動性死亡過程。凋亡可清除DNA受損細胞，在腫瘤形成中發揮重要作用，如果細胞凋亡受到抑制，可使不穩定的細胞繼續生存且進一歩突變而導致腫瘤發生。惡性血液病是嚴重危害人類健康的常見惡性腫瘤之一，同其他實體瘤一祥，細胞過度增殖和凋亡受阻是其發生的基礎。細胞內與凋亡有關的基因分為兩大類一是誘導凋亡基因；另一類是抑制凋亡基因家族(inhibitor of apoptosis proteins, IAPs)。survivin (生存素)基因就屬于IAPs家族的重要成員之一。通常IAPs家族蛋白結構包含2-3個串聯含有半胱氨酸/組氨酸的桿狀病毒TAP重復區序列(baculovins TAP repeat,BIR),其羧基末端有一保守的鋅結合區域，亦稱鋅指結構。survivin是IAPs家族成員中最簡單的蛋白分子，只有ー個部分保守的BIR結構域，其羧基端缺少鋅指結構，survivin基因定位于17q25，，全長共編碼142個氨基酸，生存素蛋白分子量為16500kD的胞漿蛋白[Ambrosini G7Adida C，A novel antiapoptosis gene survivin expressed incancer and phoma. NatMed,199(,3(8) 917]survivin的分布。免疫組化等研究表明，survivin除了在胎盤和胸腺組織中有微弱的表達外，在其他正常的組織中都檢測不到[Altieri DC，Marchisio PC. survivinapoptosis an interloper Detween cell death and cellproliferation in cancer. LabInvest，1999，79 :1327-33]。但同時研究表明survivin基因的mRNA和蛋白在近乎所有的常見癌組織都有過量表達，這ー普遍分布現象顯示基因在癌癥中可能處于失控的表達狀態[Ambrosini G，Adida C，A novel antiapoptosis gene survivin expressedincancer and phoma. NatMed，1997，3 (8) :917]。survivin 基因分布于胚胎、發育的胎兒組織，絕大多數腫瘤組織內，50% 80%的急性髓細胞白血病表達，但在分化成熟的正常組織中未見表達，為理想的基因治療靶點。survivin抑制細胞凋亡的機制，主要是通過抑制caspase活性而發揮抗凋亡作用。它作用于各個凋亡途徑的匯交點，即直接抑制終末效應蛋I=I caspase-J,caspase-9 矛ロ caspase—/[Tamm 丄，Wang Y, bausvilie E, et al. IAP-familyprotein survivin inhioits caspase activity and apotosis induced byFas(しl)95),Bax, caspases, and anticancer drugs. Cancer Res, 1998, 58 :5315-20] 另外也有研究認為survivin可能還通過與周期蛋白激酶cdk4等相互作用阻斷凋亡信號轉導通路從而抑制細胞凋亡。可以說survivin基因具有抑制細胞凋亡和調節細胞有絲分裂的雙重功能，是聯系細胞周期和細胞凋亡界面的重要因子。總之，survivin基因在腫瘤細胞，本例中涉及的是急性髓細胞白血病細胞表達的普遍性及相對于正常組織的特異性，使得應用靶向生存素survivin的抗腫瘤療法具有較好的祀向性和可能性。
RNA 干擾(RNA interference, RNAi)是 Andrew 和 Craig 等在 1998 年研究Caenorhabditis elegans相關基因功能時，發現并命名的新技術，隨后此技術在全球得以廣泛的開展和應用，特別是Elbashir等在《自然》上載文證實在哺乳動物細胞中可以應用RNAi技術后，揭開了 RNAi應用于哺乳細胞研究的新篇章。RNAi是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA(double-stranded RNA, dsRNA)誘發的、同源mRNA高效特異性降解的現象。其機制是雙鏈RNA被特異的核酸酶降解，產生干擾小RNA(siRNA)，這些siRNA與同源的靶RNA互補結合，特異性酶降解靶RNA，從而抑制、下調基因表達。在此基礎上發展的RNA干擾技術，是指體外人工合成的或體內的雙鏈RNA(dsRNA)在細胞內特異性的將與之同源的mRNA降解成小片段,使相應的基因沉默的技術[Fire A, Xu S, MontgomeryMK, et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNAinCaenorhabditis elegans. Nature. 1998 ；391 :806-811]。RNAi 是現代基因治療重要手段之一，具有高度特異性，21nt干擾性小RNA在哺乳動物細胞中可以誘導強有力的特異性RNAi作用。RNAi基因抑制的有效性很大程度取決于siRNA靶序列的選擇。通常ー個基因需要設計3 4個靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。葉酸是維生素B復合體之一,相當于蝶酰谷氨酸(pteroylglutamic acid, PGA),是米切爾從菠菜葉中提取純化的，故而命名為葉酸。有促進骨髓中幼細胞成熟的作用，人類如缺乏葉酸可引起巨紅細胞性貧血以及白細胞減少癥，對孕婦尤其重要。葉酸受體(folatereceptor, FR)是ー種可以介導細胞內化,將葉酸攝取入真核細胞胞楽;的一種高親和カ受體。FR是由ー個基因家族的三個基因編碼的一類單鏈糖蛋白家族，分子量38-40kD，對葉酸及5-甲基四氫葉酸具有高度親和力。現已鑒定出三種FR受體FR-α、FR_i3和FR-Y。其中FR- a和FR- β通過糖基化磷脂酰肌醇定位在細胞膜上，而FR- Y則是ー種分泌性蛋白，1ΑΑ于胞夕卜[Hilgenbrink, A. R. ；Low, P. S. Folate Receptor-Mediated Drug Targeting From. Therapeutics toDiagnostics. J. Pharm. Sci. 2005,94, 2135-2146]。FR 是一種在腫瘤細胞膜表面高表達的細胞因子，在包括急性髓細胞白血病在內的惡性腫瘤細胞膜表面其活性和數量顯著高于正常細胞，而FR在正常組織中幾乎不表達。而在腫瘤組織中高表達并且具有高度親合力，這種特性使FR可以成為腫瘤靶向治療中的通路[Leamon CP and LowPb(2001)Folate-mediatedtarget mg from diagnost ics to drug and gene delivery.Drug DiscovToday 6 :44-51]。祀向治療是指針對腫瘤細胞惡性表型的分子祀點,通過特異性細胞受體信號(本例中涉及survivin的抑制表達)等調節其功能，實現抑制腫瘤細胞生長或促進細胞凋亡的抗腫瘤作用。在體內靶向投遞siRNA擁有重要的臨床應用前景，但目前可用的方法缺乏靶向性，并且存在毒性問題。長期循環的葉酸受體靶向的脂質體可能是ー個傳遞寡核苷酸的新載體。本發明目的_在探討葉酸受體靶向的脂質體在K562細胞(瘤細胞作為小鼠白血病皮下種植瘤模型)中傳遞包被siRNA的效率，在K562細胞中survivin基因呈現高表達水平。因此，我們研究葉酸受體祀向的脂質體包被的能特異性抑制survivin表達的siRNA能否在體內外下調survivin基因的表達，從而實現抑制腫瘤細胞生長或促進細胞凋亡的抗腫瘤作用。

發明內容
本發明公開了ー種新型的葉酸受體靶向的脂質體，具有抑制急性髓細胞白血病細 胞(K562細胞)生長的作用。本發明所述的脂質體為葉酸受體靶向的脂質體，由ニ硬脂酰磷脂酰膽堿(Di stearoy lphosphat idyl choline, DSPC)、膽固醇、離子化的氨基脂 1，2 ニ 油酸 _3_ ニ甲基酸銨丙燒(1, 2-dioleoyl-3-(dimethylammonio)propane, DODAP)、N-掠櫚酸鞘氨Il- -I-玻怕四先聚こニ酉！· (N_palmitoylsphingosine_l_[succinyl—methoxypoly (ethyleneGlycol) 2000]，PEG-CerC16)、葉酸以及針對survivin基因的siRNA片段組成。所述siRNA的正義鏈選自SEQ ID NO :1，反義鏈選自SEQ ID NO :2。本發明公開了所述的脂質體在制備急性髓細胞白血病藥物的用途。本發明還公開了所述脂質體的制備方法，包括以下步驟I)脂溶液的制備將ニ硬脂酰磷脂酰膽堿、膽固醇、1，2_ ニ油酸-3-ニ甲基酰胺丙烷、聚こニ醇溶于無水こ醇中，再加入不同劑量的葉酸-聚こニ醇-ニ硬脂酰磷脂酰こ醇胺(通過聚こニ醇將ニ硬脂酰磷脂酰こ醇胺與葉酸連接)，調溶液的PH到PH4. 0，然后，將300mM的檸檬酸溶液和40% (v/v)こ醇加入到該溶液中，形成脂溶液。2) siRNA 的制備在另ー個管中在ρΗ4· O的300mM的檸檬酸溶液和40% (v/v)こ醇溶液中制備SiRNA03)溶液混合65°C加熱上述兩種溶液，然后邊輕輕渦旋邊將脂溶液加入到siRNA溶液中，加入的比例為150 μ g siRNA/ μ mol液體。4)葉酸-PEG-脂質體-survivin siRNA 的純化該混合物通過三層IOOnm聚碳酸酯過濾器過濾10次。該混合物在300mM pH 4. O的檸檬酸溶液中透析，除去多余的こ醇，并進ー步在HBS (20mM HEPES, 145mM NaCl，pH 7.6)中透析12h-18h，除去檸檬酸緩沖液，中和D0DAP，并釋放任何與小泡膜表面相關的siRNA。最后，包含siRNA的葉酸受體靶向脂質體通過瓊脂糖凝膠柱CL-4B從自由siRNA中被分離出來。


圖 I 是 survivin 的表達情況。米用 survivin siRAN 20pmol、30pmol、40pmol、50pmol、60pmol分別組合，制備成相應的轉染混合物，轉染K562細胞，于轉染48h采用RT-PCR 測定 survivin 表達水平(survivin mRNA/GAPDHmRNA Copies)。圖2是半定量法測定各實驗組survivin基因的相對表達量。I. 00E+00group Survivin-siRNA轉染組；2. 00E+00group :無關干擾組轉染組；3. 00E+00group :空脂質體組；4. 00E+00group :空白對照組。*Error Bars show 95. O % Cl of Mean Bars showsMeans. 圖3是體內實驗。RT-PCR定量分析脂質體注射治療k562細胞復制小鼠皮下種植瘤模型后腫瘤細胞中survivin基因的表達抑制(RT-PCR測定survivinmRNA/GAPDH mRNAしopies)。圖4(A，B, C)是流式細胞術監測基因治療后腫瘤細胞凋亡情況。37天瘤體積21 X 15mm,有分葉,給予瘤周皮下注射葉酸-PEG-脂質體-siRNA 0. 2ml/只 天,連續4天。處死動物，取瘤體組織，用膠原酶IV溶解形成細胞懸液200目尼龍網過篩，調整細胞濃度I X 106，采用流式細胞術監測細胞凋亡情況。細胞凋亡結果如圖4B。FITC為Annexin V(早期凋亡)，PE為PI (壞死細胞標記)。
具體實施例方式I.材料和方法I)細胞系K562細胞系用含10%胎牛血清的1640培養基培養；2mmol/L的L-谷氨酸；100IU/ml青霉素G ;100mg/mL鏈霉素；37°C，5% CO2孵箱孵育。培養基每3天更換一次。2) siRNA 的構建siRNA的寡核苷酸針對人survivin基因，survivin-siRNA序列如下正義鏈5，2GGATCCGACTTGGCCCAGTGTTTCTTTCAAGAGA AGAAACACTGGGCCAAGTC TTTTTT ATCGATA-3’ (SEQ ID 1)反義鏈3，-ACCTAGGCTGAACCGGGTCACAAAGAAAGTTCTCTTCTTTGTGACCCGGTTCAG AAAAAA TAGCTA-5，(SEQ ID 2)3)構建了葉酸-PEG-脂質體-survivin siRNA確立了 survivin基因RNAi的序列后,合成了葉酸-新脂質體-survivinRNAi轉染系統，進行了小鼠的體內試驗。以K562細胞為瘤細胞，復制了小鼠白血病皮下種植瘤模型，研究了葉酸-新脂質體-survivin RNAi轉染系統對小鼠種植瘤survivin基因的抑制效果及其生物效應。制備葉酸-PEG-脂質體-survivin RNAi轉染系統(I)制備ー種全新的脂質體，成分為ニ硬脂酰磷脂酰膽堿(Di stearoy lphosphat idyl choline, DSPC)、膽固醇、離子化的氨基脂 I，2 ニ 油酸-3- ニ甲基酸銨丙燒(1, 2-dioleoyl-3-(dimethylammonio)propane, D0DAP)及 N-掠櫚酸鞘氨Il- —I—玻怕酉先深こ ニ 酉！· (N-palmitoylsphingosine-l-[succinyl-methoxypoly (ethylene Glycol) 2000]，PEG-CerC16)。DODAP在脂類雙層膜系統中是一種陽離子脂質體，等電點6. 6，在酸性環境中(如PH4. O)，這種脂類帶有正電荷，可以與帶負電荷的寡核苷酸結合，所形成的DODAP/寡核苷酸復合物在含こ醇的緩沖液中可以與其它脂類反應，在通過透析去除こ醇后形成含寡核苷酸的脂質體，其體積為100-200nm，包裹寡核苷酸的效率為60-80 %，而脂類/寡核苷酸比率低至O. 15-0. 25，全身注射后它可以在血液中循環很長時間，副作用小，在體內具有廣泛的應用潛能。(2)用新脂質體包裹survivin基因siRNA。(3)脂質體與葉酸連接將上述脂質體包裹的survivin基因RNAi與葉酸連接。其目的是通過白血病細胞膜高表達的葉酸受體，進ー步提高脂質體的靶向性，其轉運效率可提高8-10倍。正常組織細胞基本不表達葉酸受體。4) K562細胞對葉酸-PEG-脂質體-survivin siRNA的吸收實驗K562細胞被接種到24孔板，每孔5 X IO4個細胞，培養過夜。向細胞中加入以下濃度的包含有FR-靶向脂質體的siRNA 16. 7、50、100和150nmol/L。37°C下孵育I小時，然后用磷酸鹽緩沖液(PBS) (3X3min)洗滌細胞。用細胞裂解液裂解緩沖液(含O. I %的Triton X-100的Tris-HCl，EDTA, pH值7. 6)裂解細胞，細胞裂解液HOOOrpm離心IOmin0熒光顯微鏡下檢測上清中Cy3標記寡核苷酸。上清中蛋白的含量通過考馬斯亮藍G-250染色法檢測。siRNA的吸收的結果表示為pg Cy3標記的siRNA/ug蛋白。LA-N-5對照組FR-靶向的脂質體siRNA的吸收的鑒定方法相同。5)K562細胞的轉染實驗Κ562細胞被接種到24孔板，每孔5Χ IO4個細胞，培養過夜。為四組，分別如下FR革巴向的survivin siRNA脂質體(siRNA濃度50pmol/L), FR革巴向的對照siRNA脂質體(對照 siRNA 濃度為 50pmol/L), survivin siRNA 無脂質體(survivin 基因 siRNA 濃度為50pmol/L)和空白對照組(同體積的脂質體)。在48h和72h后，survivin mRNA基因的表達及LA-N-5細胞的増殖根據下面方法進行檢測。6)實時定量RT-PCR檢測定量逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)技術SYBR Green I被用于survivin基因mRNA表達的檢測。總RNA在25ul的反應體系中用第一鏈cDNA合成試劑盒合成。用Oligo-dT進行反轉錄。該混合物在30°C孵育60分鐘，95°C，5min退火，然后儲存在_20°C。我們用人類甘油三磷酸脫氫酶(hGAPDH)作為內參。I μ L(20 μ L)合成的cDNA在25 μ L的體系中擴增，包括2. 5 μ m dNTPs, 10 μ m的survivin基因(或hGAPDH)引物，1.25U的Taq DNA聚合酶。MYCN基因PCR擴增條件為95°C，45s ；64°C,45s ；72°C,45s ;40個循環，然后 72°C延伸 lOmin。hGAPDH PCR條件為95°C,25s ；58. 5°C, 25s ；72°C,25s ；40 個循環，然后 72°C延伸 IOmin0 survivin 基因 mRNA 的表達的計算survivin基因拷貝數/GAPDH的拷貝。7)體外K562細胞survivin基因mRNA定量檢測接下來，37°C孵育Ih，每組用PBS洗兩次(每次2min)。經過48h和72h培養后，收獲的細胞進行總RNA提取。survivin基因mRNA的表達水平用熒光定量RT-PCR使用熒光染料 SYBR GREEN I。8) MTT法分析K562細胞的增殖K562細胞的生長情況通過MTT法進行檢測。簡單地說，5X IO3個細胞每孔接種于96孔板和培養過夜。然后于不同孔中分別加入以下試劑100nmol/L的包含FR靶向脂質體的survivin siRNA,或相同體積包埋脂質體的對照siRNA。接著37°C下孵育Ih后,用PBS洗(2X2分鐘)。經過48し7211孵育后，每孔加2(^しMTT(5g/L)，培養。吸取含有MTT的培養基，甲臜晶體溶解在200 μ L ニ甲基亞砜(DMSO)中。490nm處測定其吸光度值。9)皮下移植瘤模型和基因治療并采用流式細胞術監測細胞凋亡實驗(I)移植瘤模型實驗用K562細胞復制小鼠皮下種植瘤模型研究葉酸-新脂質體-survivin RNAi局部注射對白血病細胞的抑制作用。關于腫瘤模型的建立最佳年齡4周齡裸鼠,體重20g ；皮下成瘤注射細胞懸液濃度5xl07，O. 2ml/20g,成瘤時間10 14天；腹腔成瘤注 射細胞懸液濃度5x IO5,0. 5ml/20g,成瘤時間30 60天；皮下成瘤率高于腹腔成瘤，且易觀察，容易測量，但皮下成瘤者易缺血壞死，平時活動易造成局部損傷；注射劑量SurvivinsiRNA 3mg/kg ；注射時間皮下成瘤注射細胞懸液濃度5xl0Vml，0. 2ml/20g，成瘤時間10 14天。然后開始注射survivin siRNA脂質體載體進行基因治療,3mg/kg, I次/天,連續5天,第5次注射后24小時處死動物，取瘤組織用RT-PCR進行survivin基因表達研究。(2)基因治療及流式細胞術檢測細胞凋亡實驗37天瘤體積21mmX 15mm，有分葉，給予瘤周皮下注射葉酸-PEG-脂質體-siRNA O. 2ml/只 天，連續4天。處死動物，取瘤體組織，用膠原酶IV溶解形成細胞懸液200目尼龍網過篩，調整細胞濃度I X IO6,采用流式細胞術監測細胞凋亡情況。10)統計分析所有的實驗進行了至少一式三份并記錄了結果。SPSS 10. O統計軟件包被用來進行統計分析。數據的顯示是平均值加上標準差(SD)。單向方差分析(ANOVA)及X 2檢驗分析來分析各組之間的意義。統計學意義，確定在P < O. 05水平。2.實驗結果I) survivin siRNA 的定量米用survivin siRAN 20pmol、30pmol、40pmol、50pmol、60pmol 分別組合，制備成相應的轉染混合物，轉染K562細胞，于轉染48h測定survivin表達水平。濃度為50pmol吋，survivin抑制率達到最高(90. 44% )，再增加濃度，抑制率不再增加。這表明轉染的最佳濃度為50pmol/L(圖I)。2) survivin-siRNA 基因敲除的定量葉酸受體靶向脂質體導致的survivin基因沉默結果如表I和圖2。結果表明，第一組中K562細胞被轉染48h后，survivin mRNA表達水平明顯降低，80. 83%的抑制率。Survivin-siRNA組與空脂質體組P值為O. 002 (p < O. 01)，有統計學差異，而無關干擾組及空脂質體組與空白對照組的P值分別為O. 908和O. 996 (P > O. 05)，無統計學差異。但是，在其他組survivin mRNA表達水平沒有受到抑制,表明了 survivin基因被敲除的特異性。表I不同組脂質體轉染K562細胞對其survivin基因表達的抑制
權利要求
1.ー種survivin基因的siRNA，其特征在于所述siRNA的正義鏈為SEQID NO :1，反義鏈為 SEQ ID NO 2o
2.survivin基因葉酸受體靶向的新型脂質體，其特征在于該脂質體包裹如權利要求I所述的survivin基因的siRNA。
3.權利要求2所述的脂質體的制備方法，包括以下步驟(1)將ニ硬脂酰磷脂酰膽堿、膽固醇、I，2-ニ油酸-3-ニ甲基酰胺丙烷、聚こニ醇溶于無水こ醇中，再加入不同劑量的葉酸-聚こニ醇-ニ硬脂酰磷脂酰こ醇胺，調溶液的pH，然后，將檸檬酸溶液和こ醇加入到該溶液中，形成脂溶液；⑵在檸檬酸溶液和こ醇溶液中制備siRNA ； (3)加熱上述(I)、⑵得到的兩種溶液混合，得到葉酸-PEG-脂質體-survivin siRNA混合物；(4)將(2)中的混合物過濾，然后在檸檬酸溶液中透析，除去多余的こ醇，并進ー步在HBS中透析，除去檸檬酸緩沖液，中和D0DAP，并釋放任何與小泡膜表面相關的siRNA。最后，包含siRNA的脂質體通過瓊脂糖凝膠柱從自由siRNA中被分離出來。
4.權利要求3所述的脂質體的制備方法，其特征在于所述的pH為4。
5.權利要求3所述的脂質體的制備方法，其特征在于所述的檸檬酸溶液的濃度為.300mM，こ醇溶液的濃度為40% (v/v)。
6.權利要求3所述的脂質體的制備方法，其特征在于所述的加熱溫度為65°C。
7.權利要求3所述的脂質體的制備方法，其特征在于所述的混合比例為150ygsiRNA/ μ mo I 液體。
8.權利要求I所述的siRNA或權利要求2所述的脂質體在制備用于治療急性髓細胞白血病的藥物中的用途。
全文摘要
本發明公開了survivin基因葉酸受體靶向的新型脂質體一種葉酸受體靶向的新型脂質體，是可以專一抑制急性髓細胞白血病細胞增殖分化的脂質體，由二硬脂酰磷脂酰膽堿、膽固醇、1，2-二油酸-3-二甲基酰胺丙烷、聚乙二醇-CerC16、葉酸以及針對survivin基因的siRNA組成。這種脂質體是在K562細胞中投遞siRNA的良好載體，更加有意義的是siRNA對特異性基因的抑制率非常理想。瘤周皮下注射葉酸-PEG-脂質體-siRNA治療方案的荷瘤小鼠，腫瘤細胞的凋亡比例明顯增加，確實能夠對腫瘤細胞的生長起到抑制效果，且主要通過誘導腫瘤細胞凋亡的方式來進行。本發明產品可以作為潛在靶向治療急性髓細胞白血病的藥物。
文檔編號A61K48/00GK102676517SQ20121001524
公開日2012年9月19日 申請日期2012年1月17日 優先權日2012年1月17日
發明者唐鎖勤, 王天有 申請人:中國人民解放軍總醫院, 首都兒科研究所