專利名稱：用于防止線粒體通透性改變的方法
技術領域：
本發明提供了一種用于防止線粒體通透性改變的方法。具體地，本發明提供了一種如以下分子式的妝2’，6’ -Dmt-D-Arg-Phe-Lys-NH2 或 Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2。此夕卜，本發明提供了一種組合物，包括如以下分子式的肽2’，6’ -Dmt-D-Arg-Phe-Lys-NH2或Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2,以及藥用載體。
背景技術：
線粒體幾乎存在于所有的真核細胞中，并且通過氧化磷酸化作用產生三磷酸腺苷(ATP)，因而對于細胞生存是必需的。阻斷這一重要的功能可以導致細胞死亡。線粒體還通過積聚鈣(Ca2+)而在細胞內的鈣調節方面扮演重要的角色。通過膜電位驅動的單向轉運體在線粒體基質內產生鈣的積聚。鈣的攝入激活了線粒體脫氫酶，而這在維持能量生成和氧化磷酸化方面可能是重要的。另外，線粒體可以作為過量胞漿Ca2+的儲槽，從而保護細胞免受Ca2+過載和壞死。局部缺血或低血糖癥可以導致線粒體功能失常，包括ATP水解和Ca2+過載。該功能失常引起線粒體通透性改變(線粒體滲透性轉變，MPT)。MPT的特征有氧化磷酸化解偶聯，線粒體膜電位喪失，內膜通透性增加以及腫脹。另外，線粒體膜間間隙是凋亡基因蛋白(apoptogenic proteins)的儲庫。因此，線粒體電位的喪失和MPT可以導致將凋亡基因蛋白釋放到細胞質內。越來越多的證據表明MPT與壞死性和細胞凋亡性細胞死亡有關(Crompton，Biochem J. 341 =233-249,1999)，這并不令人奇怪。細胞的輕微損傷可能導致凋亡而不是壞死。環胞菌素可以抑制MPT。由環胞菌素A所致的MPT阻斷可以抑制多種細胞類型的凋亡，包括經歷局部缺血，缺氧，Ca2+過載和氧化應激的細胞(Kroemer et al. , Annu RevPhysiol. 60 :619-642,1998)。然而，環胞菌素A作為抗壞死性和凋亡性細胞死亡的治療藥物不是最好的。例如，環胞菌素A不能特異性地靶向線粒體。另外，它很難被遞送到腦部。而且，由于它的免疫抑制活性減少了環胞菌素A的應用范圍。
四肽[Dmt1]DALDA(2’，6’ _ 二甲基酪氨酸-D-精氨酸-苯丙氨酸-賴氨酸-NH2 ；SS-02)分子量為640，并且在生理pH下帶有3個凈正電荷。[Dmt1=DALDA以非能量依賴的方式很容易穿過許多哺乳動物細胞類型的質膜(Zhao et al. ,J Pharmacol Exp. Ther. 304 :425-432,2003)并且穿過血腦屏障(Zhao et al.，J Pharmacol Exp. Ther. 302 :188-196，2002)。盡管[Dmt1]DALDA已經顯示出是一種潛在的U -阿片樣物質(y -類鴉片，opioid)受體激動劑，但它的應用還沒有擴展到包括抑制MPT的方面。因此，在如局部缺血-再灌注、缺氧癥、低血糖癥以及由于線粒體膜通透性改變(線粒體滲透性轉變)所導致的病理改變的其它的疾病和病癥的情況下，需要抑制MPT。這樣的疾病和病癥包括多種常見的神經退行性疾病或病癥。

發明內容
本發明提供一種用于在有需要的任何哺乳動物中減少經歷線粒體通透性改變(MPT)的線粒體數量或防止線粒體通透性改變的方法，這些目的和其它目的可以通過本發明來實現。該方法包括給予該哺乳動物有效量的具有以下特征的芳香族陽離子肽(a)至少一個凈正電荷；(b)最少3個氨基酸；(c)最多約20個氨基酸；(d)凈正電荷的最小數目(Pm)和氨基酸殘基的總數(r)之間的關系為其中3pm是小于或等于r+1的最大數；以及(e)芳香基的最小數目(a)和凈正電荷的總數(Pt)之間的關系為其中2a是小于或等于Pt+1的最大數，除非當a是I時，pt也可以是I。在另一具體實施例中，本發明提供一種在哺乳動物的離體器官中減少經歷線粒體通透性改變(MPT)的線粒體數量或防止線粒體通透性改變的方法。該方法包括給予該離體器官有效量的具有以下特征的芳香族陽離子肽(a)至少一個凈正電荷；(b)最少3個氨基酸；(c)最多約20個氨基酸；(d)凈正電荷最小數目(Pm)和氨基酸殘基總數(r)之間的關系為其中3pm是小于或等于r+1的最大數；以及(e)芳香基的最小數目(a)和凈正電荷的總數(Pt)之間的關系為其中，2a是小于或等于Pt+1的最大數，除非當a是I時，pt也可以是I。在又一具體實施例中，本發明提供一種在有需要的哺乳動物中減少經歷線粒體通透性改變(MPT)的線粒體數量或防止線粒體通透性改變的方法。該方法包括給予該哺乳動物有效量的具有以下特征的芳香族陽離子肽(a)至少一個凈正電荷；(b)最少3個氨基酸；(c)最多約20個氨基酸；(d)凈正電荷的最小數目(Pm)和氨基酸殘基的總數(r)之間的關系為其中3pm是小于或等于r+1的最大數；以及(e)芳香基的最小數目(a)和凈正電荷的總數(Pt)之間的關系為其中3a是小于或等于Pt+1的最大數，除非當a是I時，pt也可以是I。在更進一步的具體實施例中，本發明提供一種在哺乳動物的離體器官中減少經歷線粒體通透性改變(MPT)的線粒體數量或防止線粒體通透性改變的方法。該方法包括給予該離體器官有效量的具有以下特征的芳香族陽離子肽(a)至少一個凈正電荷；(b)最少3個氨基酸；(C)最多約20個氨基酸；(d)凈正電荷的最小數目(Pm)和氨基酸殘基的總數(r)之間的關系為其中3pm 是小于或等于r+1的最大數；以及(e)芳香基的最小數目(a)和凈正電荷的總數(Pt)之間的關系為其中，3a是小于或等于Pt+1的最大數，除非當a是I時，pt也可以是I。在又一具體實施例中，本發明提供了一種如以下分子式的肽2’，6’-Dmt-D-Arg-Phe-Lys-NH2 (Dmt1-DALDA)或 Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2 (SS-20)。在另外的實施例中，本發明提供了一種組合物，包括如以下分子式的肽2’，6’-Dmt-D-Arg-Phe-Lys-NH2 (Dmt1-DALDA)或 Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2 (SS-20),以及藥用載體。


圖I :線粒體中[Dmt1]DALDA(SS-02)的細胞內化和聚集。(A)用熒光分光光度計測量SS-19的線粒體攝入(ex/em = 320/420)。加入經分離的小鼠肝臟線粒體(0. 35mg/ml)導致SS-19熒光強度快速淬滅(灰線)。用FCCP(1. 5iiM)預處理的線粒體減少淬滅< 20% (黑線)。(B)經分離的線粒體用[3H]SS-02于37°C孵育(溫育)2分鐘。于4°C離心(16000Xg)5分鐘中止攝入，測定沉淀中的放射性。用FCCP預處理的線粒體抑制[3H]SS-02攝入 20%。數據用平均值土標準誤差表示；n = 3,*,采用Student’s t_檢驗的P <0.05。(C)由丙甲甘肽誘導的線粒體腫脹使經分離的線粒體攝入的TMRM丟失，而攝入的SS-19則保持在高濃度。黑線為TMRM ;紅線為SS-19。(D)如通過TMRM熒光測定的，在經分離的線粒體中加入SS-02(200iiM)不改變線粒體電位。加入FCCP(1. 5iiM)引起快速去極化，而Ca2+(150 u M)導致去極化和MPT漸進開始。圖2. [Dmt1] DALDA (SS-02)保護線粒體免受Ca2+過載和3-硝基丙酸(3NP)誘導的線粒體通透性改變(MPT)。(A)經分離的線粒體用10 ii M的SS-02預處理(用下箭頭表示加A )阻止了由Ca2+過載誘導的MPT的發生(上箭頭)。黑線為緩沖液；紅線為SS-02。(B)經分離的線粒體用SS-02預處理增加了在MPT發生前成倍加入Ca2+的線粒體耐受性。箭頭指示加入緩沖液或SS-02。線I為緩沖液；線2為50 ii M的SS-02 ;線3為100 y M的SS-02。(C) SS-02劑量依賴性地延緩由ImM 3NP誘導的MPT的發生。箭頭表示加入緩沖液或SS-02。線I為緩沖液，線2為0. 5 ii M的SS-02 ;線3為5 ii M的SS-02 ;線4為50 y M的SS-02。圖3. [Dmt1]DALDA (SS-02)抑制線粒體腫脹和細胞色素C釋放。(A)將經分離的線粒體用SS-02預處理，其劑量依賴性地抑制了由200 y M的Ca2+以劑量依賴方式誘導的線粒體腫脹。通過在540nm處的吸光度來測量腫脹。(B) SS-02抑制經分離的線粒體中由Ca2+誘導的細胞色素C的釋放。細胞色素C的釋放量用線粒體中總細胞色素C的百分數表示。數據用平均值土標準誤差表示，n = 3。(C) SS-02也能抑制由MPP+(300 u M)誘導的線粒體腫脹。圖4. D-精氨酸-Dmt-賴氨酸-苯丙氨酸-NH2 (SS-31)抑制線粒體腫脹和細胞色素C釋放。(A)經分離的線粒體用SS-31 (10 u M)預處理阻止了由Ca2+誘導的MPT的發生。灰線為緩沖液；紅線為SS-31。(B)線粒體用SS-31 (50 u M)預處理抑制了由200mM的Ca2+誘導的線粒體腫脹。通過測量在570nm處的光散射來測量腫脹。(C) SS-02和SS-31與環胞菌素(CsA)在抑制由Ca2+誘導的線粒體腫脹和細胞色素C釋放的比較。細胞色素C釋放量用線粒體中總細胞色素C的百分數表示。數據 用平均值土標準誤差表示，n = 3。圖5. [Dmt1] DALDA (SS-02)和 D-精氨酸-Dmt-賴氨酸-苯丙氨酸 _NH2(SS_31)在經灌注的離體豚鼠心臟的局部缺血-再灌注過程中保護心肌收縮力。心臟用緩沖液或含有SS-02 (IOOnM)或SS-31 (InM)的緩沖液灌注30分鐘，然后經受30分鐘的全心(global)缺血。用同樣的灌注溶液進行再灌注。發現在3個治療組中存在顯著的差異(雙因素方差分析，P < 0. 001)。圖6.向心臟停搏液中加入[Dmt^DALDA顯著增強了經灌注的離體豚鼠心臟在延長的缺血之后的收縮功能。穩定30分鐘后，心臟用St. Thomas心臟停搏液(CPS)或含有IOOnM的[Dmt1=DALDA的CPS灌注3分鐘。通過完全阻斷冠狀動脈灌注90分鐘來引發全心失血。隨后用氧化的Krebs-Henseleit溶液進行60分鐘再灌注。在接受[Dmt1]DALDA的組中缺血后收縮力被顯著提高(P < 0. 001)。
具體實施例方式本發明是基于發明人的驚人發現某些芳香族陽離子肽顯著地減少了經歷線粒體通透性改變(MPT)的線粒體數量，甚至完全阻止了 MPT。減少經歷MPT的線粒體數量以及阻止MPT是很重要的，因為MPT與哺乳動物中多種常見的疾病和病癥相關。另外，哺乳動物的離體器官容易發生MPT。這些疾病和病癥具有特殊的臨床意義，因為在生命的某些階段它們影響很大比例的人群。肽本發明中有用的芳香族陽離子肽是水溶性和高極性的。盡管有這些性質，但這些肽能夠很容易穿過細胞膜。本發明中有用的芳香族陽離子肽包括最少3個通過肽鍵共價連接的氨基酸，并且優選包括最少4個通過肽鍵共價連接的氨基酸。本發明的芳香族陽離子肽中的氨基酸最大數目為通過肽鍵共價連接的約20個氨基酸。優選的氨基酸的最大數目為約12個，更優選為約9個，并且最優選為約6個。最佳的狀況是，存在于該肽中的氨基酸數目為4。本發明中有用的芳香族陽離子肽中的氨基酸可以是任何氨基酸。術語“氨基酸”在本文中是指含有至少一個氨基和至少一個羧基的任何有機分子。優選地，至少一個氨基位于相對于羧基的a位。這些氨基酸可以是天然存在的。天然存在的氨基酸包括，例如在哺乳動物蛋白質中自然發現的20種最常見的左旋(L)氨基酸，即丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、天冬酰胺(Asn)、天冬氨酸(Asp)、半胱氨酸(Cys)、谷氨酰胺(Gln)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、組氨酸(His)、異亮氨酸(Ileu)、亮氨酸(Leu)、賴氨酸(Lys)、蛋氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和纈氨酸(Val)。其它天然存在的氨基酸包括例如在與蛋白質合成無關的代謝過程中合成的氨基酸。例如，在產生尿的過程中哺乳動物代謝合成的鳥氨酸和瓜氨酸這些氨基酸。本發明中可用的肽可以含有一個或多個非天然存在的氨基酸。這些非天然存在的氨基酸可以是左旋(L)、右旋(D)或它們的混合物。最佳的狀況是該肽不含有天然存在的氨基酸。 非天然存在的氨基酸是那些通常不是在生物體正常代謝過程中合成，并且不是在蛋白質中天然存在的氨基酸。另外，本發明中優選的可用的非天然存在的氨基酸也不被普通的蛋白酶識別。非天然存在的氨基酸可以出現在該肽的任何位置。例如，該非天然存在的氨基酸可以位于N-末端，C-末端或在N-末端和C-末端之間的任何位置。例如，該非天然存在的氨基酸可以包括烷基、芳基或烷芳基這些基團。烷基氨基酸的一些例子包括a-氨基丁酸、￠-氨基丁酸、Y-氨基丁酸、S-氨基戊酸和e-氨基己酸。芳基氨基酸的一些例子包括鄰、間和對氨基苯甲酸。烷芳基氨基酸的一些例子包括鄰、間和對氨基苯乙酸，和Y-苯基-￠-氨基丁酸。非天然存在的氨基酸也包括天然存在的氨基酸的衍生物。天然存在的氨基酸的衍生物可以包括如向天然存在的氨基酸上添加一個或多個化學基團。例如，一個或多個化學基團可以被添加到苯丙氨酸或酪氨酸殘基的芳香環的2’、3’、4’、5’或6’位中的一個或多個位置上，或色氨酸殘基的苯并環的4’、5’、6’或7’位中的一個或多個位置上。該基團是可以添加到芳香環上的任何化學基團。這些基團的一些例子包括支鏈或直鏈的C1-C4烷基，如甲基、乙基、正丙基、異丙基、丁基、異丁基或叔丁基，C1-C4烴氧基(即烷氧基)，氨基，C1-C4烷基胺和C1-C4=烷基胺(例如甲胺、二甲胺)，硝基，羥基，鹵素(即氟基、氯基、溴基或碘基)。天然存在的氨基酸的非天然存在的衍生物的一些特殊例子包括正纈氨酸(Nva)，正亮氨酸(Nle)和羥脯氨酸(Hyp)。本發明的方法中在有用肽中的氨基酸修飾的另一個例子是該肽的天冬氨酸或谷氨酸殘基的羧基衍生化。衍生化的一個例子是用氨或用如甲胺、乙胺、二甲胺或二乙胺這些伯胺或仲胺酰胺化。衍生化的另一個例子包括用如甲醇或乙醇酯化。另外一種這樣的修飾包括賴氨酸、精氨酸或組氨酸殘基的氨基衍生化。例如，這些氨基可以被酰化。一些合適的酰基包括，例如包括任何上述C1-C4烷基的苯甲酰基或烷酰基，如乙酰基或丙酰基。優選的是非天然存在的氨基酸對普通蛋白酶是穩定的，更優選的是對其不敏感。對蛋白酶穩定或不敏感的非天然存在的氨基酸的例子包括任何上述天然存在的L-氨基酸的右旋(D-)型，以及L-和/或D-型非天然存在的氨基酸。D-氨基酸不是正常存在于蛋白質中的，盡管在某些抗菌肽中發現過它們，但它們是通過除細胞正常的核糖體蛋白合成器以外的工具合成的。本文中所使用的這些D-氨基酸可以認為是非天然存在的氨基酸。為了使對蛋白酶的敏感性降到最低，本發明的方法中有用的肽應該具有少于5個，優選少于4個，更優選少于3個，且最優選少于2個毗鄰的可以被普通蛋白酶識別的L-氨基酸，無論這些氨基酸是否是天然存在的或非天然存在的。最佳的情況是，該肽僅含有D-氨基酸,而不含有L-氨基酸。如果該肽含有蛋白酶敏感的氨基酸序列，則至少這些氨基酸中的一個優選為非天然存在的D-氨基酸(右旋精氨酸)，從而提供蛋白酶抗性。蛋白酶敏感序列的例子包括容易被普通蛋白酶如肽鏈內切酶和胰蛋白酶切開的兩個或多個毗鄰的堿性氨基酸。堿性氨基酸的例子包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸。 在生理pH下該芳香族陽離子肽具有相對于該肽中氨基酸殘基總數的最小數目的凈正電荷是很重要的。生理PH下凈正電荷的最小數目下文中表示為(Pm)。該肽中氨基酸殘基總數下文中表示為(r)。下文討論的凈正電荷的最小數目都是在生理pH條件下。術語“生理pH”在本文中是指哺乳動物身體的組織和器官細胞中的正常pH。例如人的生理pH通常約為7. 4，但是哺乳動物中正常的生理pH可以是從約7. 0到約7. 8之間的任意pH。“凈電荷”本文中是指由存在于該肽中的氨基酸所攜帶的正電荷數和負電荷數的差值。在本說明書中，應當理解為凈電荷是在生理PH下測量的。在生理pH下具有正電荷的天然存在的氨基酸包括L-賴氨酸、L-精氨酸和L-組氨酸。在生理pH下具有負電荷的天然存在的氨基酸包括L-天冬氨酸和L-谷氨酸。通常，肽具有一個正電荷的N-末端氨基和一個負電荷的C-末端羧基。在生理PH下電荷彼此抵消。作為計算凈電荷的一個例子，肽酪氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-賴氨酸-谷氨酸-組氨酸-色氨酸-精氨酸(Tyr-Arg-Phe-Lys-Glu-His-Trp-Arg)具有一個負電荷氨基酸(即，谷氨酸)和四個正電荷氨基酸(即，兩個精氨酸殘基，一個賴氨酸和一個組胺酸)。因此上述肽含有3個凈正電荷。在本發明的一個實施例中，該芳香族陽離子肽在生理pH下凈正電荷最小數目(Pm)和氨基酸殘基總數(r)之間的關系為其中3Pm是小于或等于r+1的最大數。在該實施例中，凈正電荷最小數目(Pm)和氨基酸殘基總數(r)之間的關系如下
~(r) ~3| 4|~^~6]~7| 8|~^~Iol~u]~12]~13]~Iil~15]~16]~17]~18]~19]~20~
~(pjT ~r 2 2 2 3 3 3 4 4 4 5 5 5 6 6 6 1~在另一實施例中，該芳香族陽離子肽在凈正電荷最小數目(Pm)和氨基酸殘基總數(r)之間的關系為其中2pm是小于或等于r+1的最大數。在該實施例中，凈正電荷最小數目(Pm)和氨基酸殘基總數(r)之間的關系如下
~(r) ~3| 4|~^~6]~7| 8|~9]~Iol~u]~12]~13]~~15]~16]~17]~18]~19]~20~
~(pj22334455 6 6 7 7 8 8 9 9 10 ~Io"在一個實施例中，凈正電荷最小數目(Pm)和氨基酸殘基總數(r)相等。在另一實施例中，該肽含有3或4個氨基酸殘基并且具有最少一個凈正電荷，優選為最少2個凈正電荷以及更優選為最少3個凈正電荷。
該芳香族陽離子肽具有相對于凈正電荷總數(Pt)最少量的芳香基團也很重要。芳香基的最小數目在下文中表示為(a)。具有芳香基的天然存在的氨基酸包括組氨酸、色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸這些氨基酸。例如，六肽賴氨酸-谷胺酰胺-酪氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-色氨酸含有2個凈正電荷(由賴氨酸和精氨酸殘基貢獻)和3個芳香基(由酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基貢獻)。
在本發明的一個實施例中，本發明的方法中有用的芳香族陽離子肽在芳香基最小數目(a)和生理pH下凈正電荷總數(pt)之間的關系為其中3a是小于或等于pt+l的最大數，除非當Pt是l，a也可以是I。在該實施例中，芳香基的最小數目(a)和凈正電荷總數(Pt)之間的關系如下
權利要求
1.一種如以下分子式的肽2，，6，-Dmt-D-Arg-Phe-Lys-NH2 (Dmt1-DALDA)。
2.一種組合物，包括如以下分子式的肽2，，6，-Dmt-D-Arg-Phe-Lys-NH2 (Dmt1-DALDA)， 以及藥用載體。
3.一種如以下分子式的肽 Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2 (SS-20)。
4.一種組合物，包括如以下分子式的肽 Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2 (SS-20)，以及藥用載體。
全文摘要
本發明提供了一種用于防止線粒體通透性改變的方法。該方法包括給予有效量的芳香族陽離子肽，該肽具有至少一個凈正電荷；最少四個氨基酸；最多約二十個氨基酸；凈正電荷的最小數目(pm)與氨基酸殘基的總數(r)之間的關系為其中3pm是小于或等于r+1的最大數；以及芳香基的最小數目(a)與凈正電荷的總數(pt)之間的關系為其中2a是小于或等于pt+1的最大數，除非當a是1時，pt也可以是1。本發明提供了一種如以下分子式的肽2’，6’-Dmt-D-Arg-Phe-Lys-NH2或Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2。此外，本發明提供了一種組合物，包括如以下分子式的肽2’，6’-Dmt-D-Arg-Phe-Lys-NH2或Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2，以及藥用載體。
文檔編號A61K38/10GK102617706SQ20121002186
公開日2012年8月1日 申請日期2004年2月3日 優先權日2003年2月4日
發明者彼得·W·席勒, 趙克勝, 黑茲爾·H·塞托 申請人:科內爾研究基金會, 蒙特利爾臨床研究學院