專利名稱：一種含金屬硫蛋白的細胞保護劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種含金屬硫蛋白的細胞保護劑，屬于生物制藥領域。具體地說涉及金屬硫蛋白的新用途，即一種以金屬硫蛋白為主要成份的試劑，用于血液灌流治療時對人體血液細胞的保護，以及由細胞嚴重損傷或減少引起疾病的細胞療法中對相應所培養、擴增細胞，或于相應組織、器官所移植、增生細胞的保護。這些由細胞嚴重損傷或減少引起的疾病包括但不限于帕金森病、急性脊髓損傷、多發性硬化癥、老年癡呆癥、關節炎、骨質疏松、心衰竭、突發性血小板減少癥、心臟術后急性腎損傷、化療藥物引起的血細胞減少癥、肺纖維化、糖尿病、肝硬化、卵巢早衰、白血病、股骨壞死癥、肝炎、再生障礙性貧血、骨折、癱 瘓、大腦損傷修復、急性心肌梗塞、軟骨損傷等。
背景技術：
細胞的損傷或減少是多種疾病尤其是神經退行性疾病的關鍵致病機理。如神經細胞信號傳導介導的細胞毒性物質6-羥基多巴胺(6-0HDA)引起神經細胞對該毒物的氧化應激反應，導致位于中腦部位"黑質"中的多巴細胞發生病理性改變，結果引起相應多巴細胞損傷、死亡以及數量減少，多巴胺的合成量降低、對乙酰膽堿的抑制功能降低、乙酰膽堿的興奮作用相對增強，從而發生帕金森病癥狀；又如抗腫瘤藥物順鉬等在殺死腫瘤細胞的同時，對正常細胞特別是骨髓造血細胞也有殺傷作用，造成血細胞減少癥白細胞減少會使機體抵御外來感染能力降低，紅細胞減少會造成貧血，血小板減少則可導致機體了出血等。長期以來，西方醫學倡導“對抗療法”治療疾病細菌感染消滅細菌，病毒感染消滅病毒，血管堵塞消除堵塞，器官損壞切除器官等。其實很多疾病的康復高度依據人自身的免疫系統和再生機制。人體自身具有一定的自我修復功能。如感冒后吃感冒藥物僅僅消除了頭暈、發熱、咳嗽等癥狀，主要還是靠人體內免疫細胞去消滅感冒病毒。創傷后傷口經過抗菌、消炎等處理不再感染，可是以后的傷口愈合，則需要人體自身干細胞遷移到此處，通過自身再生細胞修復受傷組織。人體內這兩種非常重要的細胞一免疫細胞和干細胞在疾病治療中發揮了關鍵性作用免疫細胞像是抵御身體內外致病原的侵襲，干細胞則起到對病灶的緊急救援與損傷修復。許多藥物治療主要是借助對人體自身免疫細胞和干細胞這兩大細胞體系的調動。但是，在同樣多的情況下，不管是否使用外界藥物，人體自身干細胞或免疫細胞的數量、質量、功能是有限的；或者說其數量、質量、功能不足以治療很多組織、器官損傷疾病。這就需要利用細胞體外培養、擴增等專門的技術處理甚至基因修飾，以得到足夠數量、質量、功能的免疫細胞，以及分化或未分化的干細胞。醫生可以用培養好的結構與功能正常的免疫細胞、未分化干細胞、或已衍生分化干細胞當作“藥物”輸送給患者，以修復細胞受損或減少的組織與器官；經過專門處理的以上細胞到達受損組織臟器的一種途徑是通過人體靜脈注射、血液循環，以治療神經退行性疾病、心腦血管疾病、肺纖維化、肝硬化、糖尿病等細胞嚴重受損或減少的疾病。細胞療法方興未艾。例如，人們新近開發的生物免疫細胞療法，主要根據細胞與分子免疫學原理，通過細胞因子，誘發人體自身樹突狀抗原提呈細胞(DC)產生殺傷細胞(CIK)，殺滅乙肝病毒，阻止肝炎、肝纖維化、肝硬化、肝癌進程。目前的抗病毒藥物治療，其作用是抑制病毒復制，消除或減輕肝臟的炎癥、壞死來阻延疾病的進展，但對于有些患者而言，單純采用藥物并沒有阻止其病情的發展，問題主要出在自身的免疫系統，也就是自身免疫細胞不清除病毒，醫學上稱為“免疫耐受”，導致乙肝的久治不愈。只有打破免疫耐受，恢復人體免疫細胞的功能，激活和不斷增強自身免疫功能殺傷病毒的能力，才能從根源上得到有效治療。而具有免疫殺傷作用的特異性細胞T淋巴細胞(CTL)，可對HBV進行精確性、特異性、靶向性、主動性攻擊，殺滅體內HBV病毒。細胞因子誘導的樹突狀抗原提呈細胞-殺傷細胞技術可望將患者自身血液中的單個核細胞通過專門的細胞采集設備提取出來，在體外經過培養，使其增殖、分化成具有特異性殺傷活性的細胞，恢復其對乙肝病毒的殺傷功能，再回輸到患者自身體內，可以起到免疫重建、增強自體免疫功能的作用。另一項成功的細胞療法已經被美國FDA批準用于臨床治療人們用一種細胞治療修復損傷的膝關節，其技術是取自體受累關節的正常軟骨細胞，在實驗室擴增培養3-4周，再植入損傷膝關節。
可是，細胞療法仍存在很多技術難題需要攻克，主要是衍生分化或未分化干細胞、免疫細胞等體外擴增效率低。例如，誘導性多能干細胞(iPS)的成功率低至萬分之一，十萬個細胞中成功4-5個，且耗時很長。有關研究人員使用轉錄因子將iPS的誘導效率提高很多，但所用的轉錄因子含致癌基因，用于治療將存在極大的安全隱患。移去該致癌基因轉錄因子后，效率又回到原來的萬分之一水平。骨髓源性神經干細胞(bone marrow stromalcells-derived neural stem cells,BMSCs-d-NSCs)因其取材相對容易、致瘤風險低、避免倫理爭議、可自體移植，更貼近未來臨床應用。但因其為非神經組織來源，須經體外誘導、分化及調控階段，復雜的體外條件下細胞容易發生細胞損傷導致衰退和死亡，導致細胞存活率很低。很顯然，開發一種普遍有效的防止不同培養階段細胞衰退、損傷、死亡的方法，是細胞療法成敗的關鍵。另一種需要細胞保護的普遍情形出現在近年來逐漸得到應用的血液灌流療法上。針對尿毒癥、危重癥、中毒、系統性紅斑狼瘡(SLE)、重型肝炎等眾多疾病進行血液灌流治療時，為防止微細吸附劑進入末梢血液毛細管，需將血液灌流器中的吸附劑壓得很實，這樣，在將肌酐、有機酚類、胍類、巴比妥類藥物等有毒藥物、農藥、膽紅素、嗎啡、內毒素、血脂、DNA等毒物從血液中除去時，會發生血流通過吸附劑床層時經受高剪切壓力、原來附著在細胞表面的內在保護劑脫落等情況，引起細胞氧化損傷。血液灌流療法的一項重要技術指標是血液細胞如紅細胞、白細胞、血小板的存活率。為提高血液灌流療法的效率，需要細胞保護劑來保護，以防止血液細胞，尤其是血紅細胞的損傷與死亡。金屬硫蛋白是符合以上兩大類應用條件的廣譜保護劑。金屬硫蛋白是一類富含半胱氨酸基團，對多種重金屬有高度親和性，在一定的酸堿度(pH值)及細胞氧化-還原電位環境(可藉細胞器某處谷胱甘肽有還原型和氧化型比例，GSH/GSSG比例顯示)條件下易與多個鎘、鋅等金屬離子結合的多肽蛋白質。哺乳動物的金屬硫蛋白由約61個氨基酸組成，含有20個半胱氨酸和7個金屬離子。金屬硫蛋白作為一種應激蛋白、抗自由基氧化劑、細胞鋅離子介導劑等，具有提高人體免疫力、抵抗重金屬中毒、參與微量元素的貯存、運輸和代謝、排鉛補鋅、抗輻射、延緩衰老、保護人體心肺各器官等多種獨特有效的生物學功能。

發明內容
本發明的目的是，針對血液灌流時血液細胞受損傷，以及細胞體外培養、擴增及細胞移植后于相應組織、器官生長過程中受到的損傷、成活率低等問題，提出一種細胞保護劑以及使用該保護劑用于血液灌流療法，以及治療與嚴重細胞損傷或減少的疾病的細胞移植療法或稱細胞療法，包括這些細胞的體外培養、擴增及細胞移植后于相應組織、器官前后保護的方法。這一方法具有如下一種或一種以下具體特征I.本發明所述的細胞保護劑是以金屬硫蛋白為主要有效成份，金屬硫蛋白的濃度為 O. 001 μ M-IOOmM,優選濃度為 I μ M-IO μ Μ。2.本發明所述的金屬硫蛋白可以是天然的、基因重組表達的、或它們的組合物。3.本發明所述的金屬硫蛋白包括動物、植物等各種來源的金屬硫蛋白提取物、半 成品、各種百分含量比例的粗品、各種純度的純品、各種純度的精品等。4.本發明所述的金屬硫蛋白尤其包括人源化金屬硫蛋白，即人源化金屬硫蛋白-I (hMT-Ι)、人源化金屬硫蛋白_2 (hMT-2)、人源化金屬硫蛋白_3 (hMT-3)、人源化金屬硫蛋白-4(hMT-4)的一種或兩種以上組合物。5.本發明所述的金屬硫蛋白包括存在于一切藥物載體上的金屬硫蛋白；這些載體包括脂質體、納米脂質體、柔性納米脂質體、聚乙二醇等。6.本發明所述的基因重組表達包括但不限于經過基因突變、蛋白質修飾(如硒取代硫元素的半胱氨酸、蛋氨酸后的所謂硒金屬硫蛋白)、蛋白質融合，以及各種為數眾多的細胞工程表達產物。7.本發明所述的基因重組表達金屬硫蛋白主要包括人源化金屬硫蛋白，也就是說所表達的基因為人金屬硫蛋白基因。8.本發明所述的基因重組表達包括由一定的商業或非商業化基因重組表達載體于細菌、酵母、藻類、昆蟲、病毒、植物、動物細胞中的基因表達。9.本發明所述的商業或非商業化基因重組表達載體包括存在于一定基因表達載體的可表達金屬硫蛋白的基因克隆。10.本發明所述的動物包括人以及兔、豬、羊、牛、魚、蝦等可食用動物。11.本發明所述的細胞包括但不限于來源于骨髓、脊髓、臍帶血、胚胎肝臟、神經系統、淋巴系統的細胞，以及干細胞及干細胞衍生分化細胞。12.本發明所述的干細胞包括但不限于骨髓間質干細胞、骨髓源神經干細胞、造血干細胞、造血多能干細胞、造血祖細胞、誘導性多能干細胞(iPS)等。13.本發明所述的干細胞衍生分化細胞，其特征在于，所述的干細胞衍生分化細胞包括但不限于血紅細胞、白細胞、血小板、神經細胞、心肌細胞、粒單細胞、巨核細胞、肝細胞、骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、肌肉細胞、腎細胞、內皮細胞。14.本發明所述的細胞療法包括但不限于干細胞療法、免疫細胞療法、細胞介導的基因療法、基因工程靶向細胞療法等。15.本發明所述的血液灌流器吸附劑包括但不限于各種改性或非改性活性炭、各種改性或非改性高分子樹脂、聚苯乙烯樹脂、改性聚苯乙烯樹脂、陽離子樹脂、纖維素樹脂、大孔吸附樹脂、免疫吸附柱、親和吸附柱、瓊脂糖凝膠，葡聚糖凝膠等。
16.本發明所述的血液灌流療法包括但不限于對尿毒癥、危重癥、中毒、系統性紅斑狼瘡(SLE)、重型肝炎等疾病的治療，即是通過血液灌流器于體外將這些病人血液中的有毒分子如肌酐、有機酚類、胍類、巴比妥類藥物等有毒藥物、農藥、膽紅素、嗎啡、內毒素、血脂、DNA等毒物除去的過程。本發明的理論依據是細胞損傷、凋亡、壞死的主要機制是氧化應激反應。金屬硫蛋白作為一種應激蛋白、抗自由基氧化劑、細胞鋅離子介導劑等，可高效對抗、淬滅細胞氧化應激反應，具有提高人體免疫力、抵抗重金屬中毒、參與微量元素的貯存、運輸和代謝、排鉛補鋅、抗輻射、延緩衰老、保護人體心肺各器官等多種獨特有效的生物學功能。本發明依據的是金屬硫蛋白突出的對抗細胞氧化應激反應的能力，其抗氧化能力是SOD的近5000倍、谷胱甘肽的近10000倍。
本發明的效果作用是血液細胞在體外血液灌流療法，或其它細胞培養不同階段的細胞死亡事件中，均有凋亡、壞死兩種機制的共同參與，并多以凋亡為主。隨時間延長細胞凋亡和壞死情況均逐漸增多金屬硫蛋白可以明顯減少體外培養細胞的損傷、凋亡和壞死。特別是以濃度為I. O μ M、2. O μ M的金屬硫蛋白培養細胞，更具明顯的抗氧化作用，能夠減少細胞氧化應激損傷，增強細胞活力，減少細胞損傷、凋亡和壞死事件的發生，更好地改善其存活。含金屬硫蛋白的細胞保護劑在血液灌流療法以及神經干細胞等眾多細胞的體外培養和移植后細胞保護研究與治療中具有廣闊應用前景。使用人源化金屬硫蛋白的明顯好處是避免免疫原性，因為人體細胞本身就含有該金屬硫蛋白。
具體實施例方式實施例一以密度梯度離心法分離培養大鼠骨髓間質干細胞(BMSCs)，以神經干細胞專用培養基促其向神經干細胞(NSCs)的分化，以O. 5 μ Μ、1 μ Μ、5 μ M三種濃度金屬硫蛋白添加培養基培養所得的骨髓源神經干細胞(BMSCs-d-NSCs)，于37°C的C02孵化箱中培養，分別在1、2、3、4周時以Annexin V-EGFP/PI雙染流式細胞儀檢測，以同一取材的未添加金屬硫蛋白常規培養的同期細胞為對照，比較各組細胞凋亡和壞死情況。結果發現各組細胞傳代培養后，各金屬硫蛋白處理組較對照組活力更為旺盛，增殖速度快，細胞凋亡和壞死情況減少。培養2周時各組間凋亡細胞和壞死細胞比例均有明顯差異；1μΜ、2μΜ金屬硫蛋白處理組細胞凋亡和壞死比例均明顯少于對照組。培養3周時各組凋亡細胞和壞死細胞比例差異更顯著；各金屬硫蛋白處理組細胞凋亡和壞死比例均明顯少于對照組，且I μ Μ、5μ M處理組細胞凋亡和壞死比例也少于O. 5 μ M處理組。這些結果表明金屬硫蛋白可以減少體外培養BMSCs-d-NSCs的凋亡和壞死，特別是以I. O μ Μ_5. O μ M金屬硫蛋白培養細胞，更具明顯的抗氧化損傷作用，能夠增強細胞活力，減少細胞的凋亡和壞死事件的發生。實施例二 取Balb/c小鼠骨髓單個核細胞，用血漿凝塊法，將細胞(2xl05/培養皿)加入含10% 2-巰基乙醇，10%氯化鈣，10%牛血清白蛋白，5%豬血清，10%牛血漿的培養液中，并以O. 5 μ Μ、I μ Μ、5 μ M三種濃度金屬硫蛋白添加培養液于37°C的C02孵化箱中培養，分別在1、2、3、4周時以Annexin V-EGFP/PI雙染流式細胞儀檢測，以同一取材的未添加金屬硫蛋白常規培養的同期細胞為對照，比較各組細胞凋亡和壞死情況。結果發現各組細胞傳代培養后，各金屬硫蛋白處理組較對照組活力更為旺盛，增殖速度快，細胞凋亡和壞死情況減少。經流式細胞儀檢測可見，從I周培養開始各組間凋亡細胞和壞死細胞比例均有明顯差異；I μ Μ、5 μ M金屬硫蛋白處理組細胞凋亡和壞死比例均明顯少于對照組。培養4周時各組凋亡細胞和壞死細胞比例也均有明顯差異；各金屬硫蛋白處理組細胞凋亡和壞死比例均明顯少于對照組，且I μ Μ、5 μ M處理組細胞凋亡和壞死比例也少于O. 5 μ M處理組。這些結果表明金屬硫蛋白可以減少體外培養造血干細胞的凋亡和壞死，特別是含I. O μ Μ-5. O μ M金屬硫蛋白的培養液，更具明顯的抗氧化損傷作用，能夠增強細胞活力，減少細胞的凋亡和壞死事件的發生。實施例三取經IV型膠原酶消化法傳代的穩定人iPS細胞，用RT-PCR法檢測鑒定人iPS多能性基因 0CT4(上游引物 CGAAGAGAAAGCGAACCAGTATC，下游引物 AGAACCACACTCGGACCACATC)、 Sox2 (上游引物 CCCCCGGCGGCAAATGCA，下游引物 TCGGCGCCGGGGAGATACAT)、Nanog (上游引物GCAAAAAAGGAAGACAAGGTCC,下游引物 CCTTCTGCGTCACACCATTG)，并檢驗其干細胞特征。以添加O. 5 μ Μ、1 μ Μ、5 μ M金屬硫蛋白細胞保護劑的iPS干細胞培養基培養于37°C的C02孵化箱中培養。同以上實施例用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡和壞死情況。培養2周時各組間凋亡細胞和壞死細胞比例均有明顯差異；1 μ Μ、5 μ M金屬硫蛋白處理組細胞凋亡和壞死比例均明顯少于對照組。培養3周時各組凋亡細胞和壞死細胞比例差異更明顯。這些結果表明含金屬硫蛋白的細胞保護劑，特別是I. O μ Μ-5. O μ M金屬硫蛋白的培養液，對iPS細胞損傷的保護作用。
權利要求
1.一種含金屬硫蛋白的細胞保護劑，其特征在于，以金屬硫蛋白為主要有效成份的試劑及其應用。
2.如權利要求I所述的細胞保護劑，其特征在于，所述主要有效成分金屬硫蛋白的濃度為O. OOl μ M-IOOmM,優選濃度為I μ M-IO μ M ;所述金屬硫蛋白可以是天然的、基因工程表達的、或它們的組合物。
3.如權利要求2所述的金屬硫蛋白，其特征在于，所述金屬硫蛋白包括植物動物(人以及兔、豬、羊、牛、魚、蝦等一切可食用動物)、等各種來源的金屬硫蛋白提取物、半成品、各種百分含量比例的粗品、各種純度的純品、各種純度的精品等。
4.如權利要求2所述的金屬硫蛋白，其特征在于，所述的金屬硫蛋白尤其包括人源化金屬硫蛋白，即人源化金屬硫蛋白-I (hMT-1)、人源化金屬硫蛋白-2 (hMT-2)、人源化金屬硫蛋白-3 (hMT-3)、人源化金屬硫蛋白-4(hMT-4)的一種或兩種以上組合物。
5.如權利要求2所述的金屬硫蛋白，其特征在于，所述金屬硫蛋白包括在細菌、酵母、植物、哺乳動物細胞中的基因工程表達產物，包括但不限于經過基因突變、蛋白質修飾(如硒取代硫元素的半胱氨酸、蛋氨酸后的所謂硒金屬硫蛋白)、蛋白質融合，以及各種為數眾多的細胞工程表達產物。
6.如權利要求2所述的金屬硫蛋白，其特征在于，所述的金屬硫蛋白包括存在于一切藥物載體上的金屬硫蛋白；這些載體包括脂質體、納米脂質體、柔性納米脂質體、聚乙二醇坐寸ο
7.如權利要求2所述的基因工程表達，其特征在于，所述基因工程表達產物包括存在于一定基因表達載體的可表達的基因克隆，包括由一定的商業或非商業化基因重組表達載體于細菌、酵母、藻類、昆蟲、病毒、植物、動物細胞中的基因表達。
8.如權利要求2所述的基因工程表達，其特征在于，所述基因重組表達如權利要求I所述的細胞，其特征在于，所述的包括但不限于來源于骨髓、脊髓、臍帶血、胚胎肝臟、神經系統、淋巴系統的細胞，以及干細胞及干細胞衍生分化細胞；包括但不限于體外培養細胞、移植到組織后的細胞、體外灌流血細胞等。
9.如權利要求8所述的干細胞，其特征在于，所述的所述的干細胞包括但不限于骨髓間質干細胞、骨髓源神經干細胞、造血干細胞、造血多能干細胞、造血祖細胞、誘導性多能干細胞(iPS)等；所述的干細胞衍生分化細胞，其特征在于，所述的干細胞衍生分化細胞包括血紅細胞、白細胞、血小板、神經細胞、心肌細胞、粒單細胞、巨核細胞、肝細胞、骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、肌肉細胞、腎細胞、內皮細胞。
10.如權利要求I所述的細胞保護劑的應用，其特征在于，應用領域包括但不限于血液灌流治療尿毒癥、危重癥、中毒、系統性紅斑狼瘡(SLE)、重型肝炎時對人體血液細胞的保護，以及由細胞嚴重損傷或減少引起疾病的細胞療法中對相應所培養、擴增細胞，或于相應組織、器官所移植、增生細胞的保護。這些由細胞嚴重損傷或減少引起的疾病包括但不限于帕金森病、急性脊髓損傷、多發性硬化癥、老年癡呆癥、關節炎、骨質疏松、心衰竭、突發性血小板減少癥、心臟術后急性腎損傷、化療藥物引起的血細胞減少癥、肺纖維化、糖尿病、肝硬化、卵巢早衰、白血病、股骨壞死癥、肝炎、再生障礙性貧血、骨折、癱瘓、大腦損傷修復、急性心肌梗塞、軟骨損傷等。
全文摘要
本發明針對血液灌流時血液細胞受損傷，以及細胞體外培養、擴增及細胞移植后于相應組織、器官生長過程中受到的損傷、成活率低等問題，向人們公開了一種含金屬硫蛋白的細胞保護劑，以及使用該保護劑用于血液灌流療法、細胞療法，包括這些細胞的體外培養、擴增及細胞移植后于相應組織、器官前后保護的方法。這一含金屬硫蛋白的細胞保護劑可廣泛用于血液灌流治療尿毒癥、危重癥、中毒、系統性紅斑狼瘡(SLE)、重型肝炎等疾病時對人體血液細胞的保護，以及由細胞嚴重損傷或減少引起疾病的細胞療法中對相應所培養、擴增細胞，或于相應組織、器官所移植、增生細胞的保護。
文檔編號A61K38/16GK102634479SQ20121002516
公開日2012年8月15日 申請日期2012年2月6日 優先權日2012年2月6日
發明者汪志友 申請人:汪志友