專利名稱：一種禽用滅活疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種禽用滅活疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
我國(guó)是一個(gè)農(nóng)業(yè)大國(guó)，改革開放以來，畜牧業(yè)得到了突飛猛進(jìn)的發(fā)展，已成為世界畜牧業(yè)大國(guó)，是世界上養(yǎng)雞、養(yǎng)豬最多的國(guó)家，具有廣闊的獸藥市場(chǎng)。據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織 (FAO)統(tǒng)計(jì)，進(jìn)人20世紀(jì)80年代以來，全世界肉類每年增加的數(shù)量80%來自中國(guó)。畜牧業(yè)養(yǎng)殖總量未來保持穩(wěn)定增長(zhǎng)。以水禽為例，水禽是我國(guó)的特色傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)，也是畜牧業(yè)的重要組成部分，其飼養(yǎng)量和消費(fèi)量一直穩(wěn)居世界首位。據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)統(tǒng)計(jì)，目前鴨、 鵝出欄量分別達(dá)到22. 78億只和6. 97億只；鴨、鵝的存欄量居世界首位。截止2005年底， 我國(guó)鴨存欄7. 3億只，占全世界鴨存欄量的69% ;我國(guó)鵝存欄量為2. 7億只，占世界鵝存欄量的88%。我國(guó)水禽產(chǎn)品產(chǎn)值占畜牧業(yè)總產(chǎn)值的10%。由于水禽飼養(yǎng)方式和環(huán)境的特殊性，極易感染各種傳染病，一旦發(fā)病，傳播較快，損失嚴(yán)重。從2003年底開始，H5N1亞型高致病性禽流感造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，也引發(fā)了嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。使用疫苗對(duì)畜禽經(jīng)行強(qiáng)制免疫，是疾病預(yù)防控制的重要措施之一，每年國(guó)家購(gòu)買疫苗支出就得上百億元人民幣。目前的疫苗接種絕大多數(shù)都是通過直接注射來完成。通過對(duì)滅活疫苗的長(zhǎng)期使用，目前發(fā)現(xiàn)直接注射存在諸多問題。第一、目前滅活疫苗油佐劑與抗原的比例為3 2，油的比例大，不僅不易吸收，而
且具有一定的毒副作用；第二、目前滅活疫苗的生產(chǎn)工藝一般需要分三步第一步將注射用的白油和油溶性的乳化劑混合均勻，第二部將抗原液與水溶性的乳化劑混合均勻，第三部將第一、二部的均勻溶液混合并進(jìn)一步乳化，制備出油包水的滅活疫苗；疫苗的制造工藝比較復(fù)雜、生產(chǎn)成本聞;第三、油包水的滅活疫苗注射時(shí)阻力大，增加了免疫的難度。因此，減少油佐劑的用量和改變疫苗的制備工藝，減少禽類動(dòng)物的應(yīng)激反應(yīng)，有著十分重要和現(xiàn)實(shí)的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是發(fā)明一種禽用滅活疫苗及其制備方法，其使用的油佐劑在改變?nèi)榛瘎┖蜏p少油佐劑用量的前提下，能夠增強(qiáng)動(dòng)物的免疫效果，優(yōu)化制備工藝，減少生產(chǎn)成本。本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種禽用油佐劑，其含有組分及各組分的體積百分比如下聚氧乙烯氫化蓖麻油RH40O. 5-12% ；油酸山梨醇脂(司班-80)1-21% ；吐溫-801-12% ；
油55-97.5%;所述油為EQLANE 130。所述的禽用滅活疫苗的油佐劑的制備方法，包括如下具體步驟(I)按配方分別量取聚氧乙烯氫化蓖麻油RH40，油酸山梨醇脂(司班-80)，吐溫-80 1_5%，油和抗原液；將油加熱到60-100°C，按照體積比加入聚氧乙烯氫化蓖麻油 RH40，混勻；(2)待油溫降到50°C以下后，加入油酸山梨醇脂攪拌均勻，110°C滅菌30分鐘，冷卻，即得到所述禽用滅活疫苗的油佐劑。一種禽用滅活疫苗，其含有組分及各組分的體積百分比如下聚氧乙烯氫化蓖麻油RH40O. 5-5% ；油酸山梨醇脂(司班-80)1-10% ；吐溫-801-5% ；油25-67.5%;抗原液30-55% ；所述油為EQLANE 130。較佳地，所述禽用滅活疫苗，其含有組分及各組分的體積百分比如下聚氧乙烯氫化蓖麻油RH40I. 5-2% ；油酸山梨醇脂(司班-80)4. 5-6% ；吐溫-801-2% ；油43-44% ；抗原液40-50%。所述聚氧乙烯氫化蓖麻油RH40做為非離子增溶劑和乳化劑，它是由氫化蓖麻油產(chǎn)生的聚乙二醇及甘油羥基硬脂酸40(德國(guó)藥典、歐洲藥典)或Polyxyl40氫化蓖麻油(美國(guó)藥典-國(guó)家處方)，HLB值14-16，CremophorRMO熔點(diǎn)約為30°C，微臭，水溶性無味，能溶于水、乙醇、正丙醇、異丙醇、乙酸乙酯、氯仿、四氯化碳、三氯乙烯、苯、甲苯和二甲苯氯仿； 在水中的溶解度隨溫度的升高而變小，至一定溫度時(shí)溶液顯乳光，并能和同類Cremophor、 脂肪酸、脂肪醇混合；在水和醇溶液是穩(wěn)定的，但和濃酸、濃堿相遇時(shí)會(huì)水解；水溶液經(jīng)熱壓滅菌(120度)后PH值稍有下降。本發(fā)明所述的禽用滅活疫苗的油佐劑的制備方法為(I)按配方分別量取聚氧乙烯氫化蓖麻油RH40，油酸山梨醇脂(司班-80)，吐溫-80 1_5%，油和抗原液；將油加熱到60-100°C，按照體積比加入聚氧乙烯氫化蓖麻油 RH40，混勻；(2)待油溫降到50°C以下后，加入油酸山梨醇脂攪拌均勻，110°C滅菌30分鐘，冷卻，即得到所述禽用滅活疫苗的油佐劑。使用時(shí)，將所述禽用滅活疫苗的油佐劑與30-55%抗原，優(yōu)選比例為40-50%，乳化后即得到滅活疫苗，2-8度儲(chǔ)存?zhèn)溆谩１景l(fā)明的有益效果為本發(fā)明中由于使用具有親水和疏水基的聚氧乙烯氫化蓖麻油RH40，增強(qiáng)了乳化效果，減少了白油的用量，簡(jiǎn)化了生產(chǎn)工藝，通過實(shí)驗(yàn)證明在小鼠和水禽中能夠增強(qiáng)免疫效果，使抗體在較長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)保持在一個(gè)較高的水平，通過減少油的用量，使油的粘稠度降低，減少了注射的難度。


圖I、不同種類乳化劑制備的油佐劑疫苗免疫小鼠后抗體水平變化檢測(cè)結(jié)果比較。圖2 :新油佐劑疫苗免疫小鼠后抗體水平變化檢測(cè)結(jié)果比較。圖3 :不同比例新油佐劑禽流感H5N1 (Re-5株)滅活疫苗免疫SFP雞后抗體水平變化檢測(cè)結(jié)果比較。圖4 :新油佐劑疫苗免疫肉鴨后HI抗體水平變化檢測(cè)結(jié)果比較I。圖5 :新油佐劑疫苗免疫肉鴨后HI抗體水平變化檢測(cè)結(jié)果比較2。
具體實(shí)施例方式實(shí)施主要試劑的說明I、聚氧乙烯氫化蓖麻油RH40，原產(chǎn)地為德國(guó)BASF，批號(hào)為83109247G0，購(gòu)買于北京鳳禮精求商貿(mào)有限責(zé)任公司，HLB值14-16，Cremophor RH40熔點(diǎn)約30°C，微臭，水溶液無味，粘度(25 0C ) 20-40mPa · s2、油酸山梨醇脂(Span-80)購(gòu)買于北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司，具體技術(shù)指標(biāo)如下水份.................................^ 2%皂化值................................135-160羥值....................................190-220酸值......................................^ 9%3、油佐劑為道達(dá)爾石油(廣州)有限公司提供的Gemseal 40 (G40)、EQLANE130或國(guó)產(chǎn)的10號(hào)白油，所用的油是經(jīng)過深度精制后的礦物油。具有無色、無味、化學(xué)惰性、光安定性能好，基本組成為飽和烴結(jié)構(gòu)，芳香烴、含氮、氧、硫等物質(zhì)近似于零，對(duì)酸、光、熱均穩(wěn)定，不溶于乙醇，溶于乙醚、苯、石油醚等，并可與多數(shù)脂肪油互溶。4、吐溫-80購(gòu)買于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)為F20050719，具體技術(shù)指標(biāo)如下水份..............................^ 3%皂化值KOH mg/g.................45-55羥值KOH mg/g.....................65-80酸值KOH mg/g......................... (2灼燒殘?jiān)?....................^ O. 25%重金屬...........................彡 O. 001%。實(shí)例一禽用滅活疫苗的油佐劑的制備(以EQLANE130為例)用量筒分別取二組80ml EQLANE130 (道達(dá)爾石油(廣州)有限公司產(chǎn)品)，置于帶攪拌子的三角瓶中；用帶加熱的磁力攪拌器加熱EQLANE130，邊加熱邊攪拌，加熱到80°C， 向一組EQLANE130中加入5 %聚氧乙烯氫化蓖麻油RH40，另一組EQLANE130加入5%吐溫-80，混勻J#EQLANE130溫降到50°C以下后，按照體積比加入10%油酸山梨醇脂，110°C 滅菌30分鐘，定容到100ml，冷卻至室溫存儲(chǔ)備用，即得禽用滅活疫苗的EQLANE130油佐劑，其中，加入聚氧乙烯氫化蓖麻油RH40的一組命名為EQLANE130新油佐劑，加入吐溫_80的一組命名為EQLANE130油。采用相同的方法，分別制備白油和新白油佐劑，G40油和G40新油佐劑。實(shí)例二 不同種類乳化劑制備的油佐劑疫苗免疫小鼠后抗體水平變化檢測(cè)I、禽流感H5N1 (Re-5株)滅活疫苗的制備A、將實(shí)施例I制備得到的白油、G40油和EQLANE130油分別與禽流感H5N1 (Re-5 株)抗原液(由廣東大華農(nóng)動(dòng)物保健品股份有限公司提供)，按照I : I的體積比例混勻， 再用高速勻漿機(jī)乳化10-15分鐘，分別制備出以下三種滅活疫苗H5Nl(Re-5株)+白油疫苗、H5N1 (Re-5 株)+G40 油苗、H5N1 (Re-5 株)+EQLANE130 油苗；B、將實(shí)施例I制備得到的新白油佐劑組G40新油佐劑組和EQLANE130新油佐劑組分別與禽流感H5N1 (Re-5株)抗原液(由廣東大華農(nóng)動(dòng)物保健品股份有限公司提供)， 按照I : I的體積比例混勻，再用高速勻漿機(jī)乳化10-15分鐘，分別制備出以下三種滅活疫苗:H5Nl(Re-5株)+新白油佐劑疫苗、H5N1 (Re_5株)+G40新油佐劑疫苗、H5N1 (Re-5 株)+EQLANE130新油佐劑疫苗。C、將R40與禽流感H5N1 (Re-5株)抗原液(由廣東大華農(nóng)動(dòng)物保健品股份有限公司提供)，按照I : I的體積比例混勻，再用高速勻漿機(jī)乳化10-15分鐘，制備H5N1 (Re-5 株)+R40 D、以生理鹽水為陰性對(duì)照。2、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組6-8周清潔級(jí)昆明白小鼠48只，分8組，每組6只，各組按O. Iml/只的劑量分別腿部肌肉注射上述滅活疫苗，具體分組如下(1)、冊(cè)附0^-5株)+白油佐劑組;(2)、H5N1 (Re-5株)+新白油佐劑疫苗組； (3)、H5N1 (Re-5 株)+G40 油苗組；(4)、H5N1 (Re-5 株)+G40 新油佐劑疫苗組；(5)、H5N1 (Re-5 株)+EQLANE130 油苗組；(6)、H5N1 (Re-5 株)+EQLANE130 新油佐劑疫苗組；(7)、H5N1 (Re-5 株)+MO 組；(8)、生理鹽水組。3、采樣各組小鼠免疫前取血I次；免疫后10天，14天，28天、42天眼眶靜脈取血各一次， 共取5次；每次取血O. 1-0. 2ml ;血樣置37°C 1-2小時(shí)，4000轉(zhuǎn)/分離心8_10分鐘，取血清置于離心管中，_20°C保存?zhèn)溆谩?、禽流感特異性IgG檢測(cè)(I)抗原包被用ELISA包被液稀釋抗原至2 μ g/ml，用稀釋后的抗原包被96孔板，100 μ I/孔，4°C過夜；(2)封閉PBST(0.05%Tween20溶于PBS)洗滌3次，每次5min，5%脫脂奶粉(完達(dá)山乳業(yè)股份有限公司生產(chǎn))，100 μ I/孔，37°C封閉Ih ；(3)加血清PBST洗滌3次，每次5min，將小鼠血清用2 %脫脂奶粉做2倍梯度稀釋，以未免疫的小鼠血清作對(duì)照，100 μ I/孔，37°C孵育Ih ；(4)加二抗PBST洗漆3次,每次5min,加入HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG (Solarbio 公司生產(chǎn) I 1000)，100μ I/孔，37°C孵育 Ih ;(5)顯色PBST洗滌3次，每次5min，加底物TMB (Amresco公司生產(chǎn))顯色， 100 μ I/ 孔，37°C避光顯色 15min ；(6)終止加入O. 2mo 1/L硫酸終止顯色，100 μ I/孔;(7)讀數(shù)0D 450nm/620nm處測(cè)光密度值。實(shí)驗(yàn)孔的OD值為對(duì)照孔的兩倍時(shí)認(rèn)為
是陽(yáng)性。5、結(jié)果將所得IgG檢測(cè)結(jié)果作圖，如圖I所示。分析圖I可知，單獨(dú)用乳化劑制備的疫苗效果不明顯，加入不同種類油佐劑制備的疫苗，新的乳化劑聚氧乙烯氫化蓖麻油RH40整體抗體水平明顯好于傳統(tǒng)乳化劑吐溫-80，產(chǎn)生抗體的時(shí)間均早于傳統(tǒng)乳化劑，最佳疫苗組為H5N1 (Re-5株)+EQLANE130新油佐劑疫苗組。實(shí)例三新油佐劑疫苗免疫小鼠后抗體水平變化檢測(cè)I、禽流感H5N1 (Re-5株)滅活疫苗的制備將實(shí)例I中得到的白油和EQLANE130新油佐劑分別與禽流感H5N1 (Re-5株)抗原液(由廣東大華農(nóng)動(dòng)物保健品股份有限公司提供)，按照I : I的比列混勻，再用高速勻漿機(jī)乳化10-15分鐘，即分別制備成H5N1 (Re-5株)+白油苗和H5N1 (Re-5株)+EQLANE130新油佐劑疫苗，同時(shí)以生理鹽水做另一組對(duì)照。2、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組取6-8周清潔級(jí)昆明白小鼠18只，分3組，每組6只，各組按O. Iml/只的劑量分別腿部肌肉注射上述滅火疫苗或生理鹽水，具體分組如下(1)、冊(cè)附0^-5株)+白油苗;(2)、H5N1 (Re-5 株)+EQLANE130 新油佐劑組；(3)、生理鹽水組。3、采樣各組小鼠免疫前取血I次；免疫后10天，14天，28天、42天、56天眼眶靜脈取血各一次，共取6次；每次取血O. 1-0. 2ml ;血樣置37°C 1-2小時(shí)，4000轉(zhuǎn)/分離心8_10分鐘， 取血清置于離心管中，_20°C保存?zhèn)溆谩?、禽流感特異性IgG檢測(cè)檢測(cè)方法和步驟和實(shí)例2相同。5、結(jié)果將所得IgG檢測(cè)結(jié)果作圖，如圖2所示。分析圖2可知，采用本發(fā)明以EQLANE130 為原料制備的新佐劑，并用其配置成禽流感H5N1 (Re-5)滅活疫苗。在抗原量等同的前提下，與原來配方白油滅活疫苗相比，EQLANE130新油佐劑在免疫后第10天能夠產(chǎn)生較高的抗體效價(jià)(I 12800)，明顯好于原白油佐劑組抗體效價(jià)(I 3200)，免疫之后42天抗體水平達(dá)到最高值，EQLANE130新油佐劑抗體效價(jià)(I 204800)明顯高于原白油劑組抗體效價(jià)(I 51200)。也就是說從免疫后產(chǎn)生抗體效價(jià)的時(shí)間和整體的抗體效價(jià)，EQLANE130新油佐劑均好于原白油劑組。
實(shí)例四不同比例新油佐劑禽流感H5N1 (Re-5株)滅活疫苗免疫SFP雞后比較實(shí)驗(yàn)I、將實(shí)例I中得到的EQLANE130新油佐劑分別按占疫苗體積的60%、50%、30%、 20%、10%與占疫苗體積的45%的禽流感H5N1 (Re-5株)抗原液(由廣東大華農(nóng)動(dòng)物保健品股份有限公司提供)充分混勻，再用高速勻漿機(jī)乳化10分鐘，即制備成油包水禽流感滅活疫苗，另外用實(shí)例I中制備的白油按占疫苗體積的60%與占疫苗體積的50%的禽流感 H5Nl(Re-5株)抗原液(由廣東大華農(nóng)動(dòng)物保健品股份有限公司提供)充分混勻，再用高速勻漿機(jī)乳化10分鐘，作為對(duì)照，同時(shí)用生理鹽水作為另一個(gè)對(duì)照。2、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組
取21-28日齡SFP雞35只，分7組，每組5只，各組按O. 5ml/只的劑量分別頸部皮下注射上述疫苗，具體分組如下
(1)、冊(cè)附(1^-5株)+60%新油佐劑組；
(2)、冊(cè)附(1^-5株)+60%普通白油組；
(3)、H5N1 (Re-5 株)+50 % 新油佐劑組；
(4)、H5N1 (Re-5 株)+30 % 新油佐劑組；
(5)、H5N1 (Re-5 株)+20 % 新油佐劑組；
(6)、H5N1 (Re-5 株)+10 % 新油佐劑組；
(7)、生理鹽水組。
3、采樣
各組SFP雞免疫前取血I次；免疫后7天、10天、14天、21天、28天、60天各取血一次，共取7次；每次取血O. 5-lml ;血樣置37°C 1-2小時(shí)，4000轉(zhuǎn)/分離心8_10分鐘，取血清置于離心管中，_20°C保存?zhèn)溆谩?br> 4、抗體檢測(cè)
(I)材料與試劑
PBS實(shí)驗(yàn)自配溶液
微量反應(yīng)板購(gòu)于海門盛邦實(shí)驗(yàn)器材有限公司
禽流感H5N1 (Re-5)抗原購(gòu)于哈爾濱獸醫(yī)研究所
SPF雞購(gòu)于北京梅里亞維生物技術(shù)公司
(2)實(shí)驗(yàn)步驟
血凝(HA)試驗(yàn)
(a)在微量反應(yīng)板的1-12孔均加入25微升PBS。
(b)吸取25微升病毒抗原加入第I孔，混勻。
(c)從第I孔吸取25微升病毒抗原加入第2孔，混勻后從第2孔內(nèi)吸取25微升加入第3孔，如此進(jìn)行倍比稀釋至第11孔，從第11孔吸取25微升棄之。
(d)每孔再加入25微升PBS。
(e)每孔均加入25微升1% (V/V)雞紅細(xì)胞懸液(將雞紅細(xì)胞懸液充分搖勻后加入)。
(f)振蕩混勻，在室溫(20-25°C )下靜置40分鐘后觀察結(jié)果(如果環(huán)境溫度太高，
可置4°C環(huán)境下I小時(shí))。對(duì)照孔紅細(xì)胞將明顯的從孔底沿著傾斜面向下呈線形流動(dòng)。
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(g)結(jié)果判定。將板傾斜，觀察紅細(xì)胞有無呈淚滴狀流淌。沉于孔底的紅細(xì)胞沿著傾斜面向下呈線形流動(dòng)者為沉淀，表明紅細(xì)胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的紅細(xì)胞凝成均勻薄層，傾斜后紅細(xì)胞不流動(dòng)，說明此孔紅細(xì)胞被病毒凝集。完全血凝(不流淌) 的病毒抗原最高稀釋倍數(shù)代表一個(gè)血凝單位(HAU)。血凝抑制試驗(yàn)(HI)(a)根據(jù)血凝試驗(yàn)結(jié)果配制4HAU的病毒抗原。以完全血凝的病毒最高稀釋倍數(shù)作為終點(diǎn)，終點(diǎn)稀釋倍數(shù)除以4即為含4HAU的抗原的稀釋倍數(shù)。例如，如果血凝的終點(diǎn)滴度為I : 256，則4HAU抗原的稀釋倍數(shù)應(yīng)是I : 64(256 除以4)。(b)在微量反應(yīng)板的1-11孔加入25微升PBS，第12孔加入50微升PBS。(c)吸取25微升血清加入第I孔內(nèi)，充分混勻后吸25微升于第2孔，依次倍比稀釋至第10孔，從第10孔吸取25微升棄去。(d) 1-11孔均加入含4HAU混勻的病毒抗原液25微升，混勻，室溫(約20°C )靜置至少30分鐘。(e)每孔加入25微升的1%雞紅細(xì)胞懸液輕輕混勻，靜置約40分鐘(室溫約20°C， 若環(huán)境溫度太高可置4°C條件下I小時(shí))，對(duì)照孔紅細(xì)胞將明顯的從孔底沿著傾斜面向下呈線形流動(dòng)。(f)結(jié)果判定以完全抑制4個(gè)HAU抗原的血清最高稀釋倍數(shù)作為HI滴度。只有陰性對(duì)照孔血清滴度不大于21og2，陽(yáng)性對(duì)照孔血清誤差不超過I個(gè)滴度，試驗(yàn)結(jié)果才有效。 HI價(jià)小于或等于31og2判定HI試驗(yàn)陰性；HI價(jià)等于41og2為陽(yáng)性。5、結(jié)果將所得結(jié)果作圖如圖3所示，分析圖3可知通過實(shí)驗(yàn)得出結(jié)果較好的組為 H5Nl(Re-5 株)+60%新油佐劑組、H5N1 (Re_5 株)+60%普通白油組、H5N1 (Re-5 株)+50% 新油佐劑組三個(gè)實(shí)驗(yàn)組，另外三個(gè)實(shí)驗(yàn)組結(jié)果一般，從而得到在不影響乳化效果的前提下， 新油佐劑使用量可以由傳統(tǒng)白油佐劑的60%降低到50%，減少了 10%油佐劑的用量，且抗體水平在較長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)維持在較高的水平。實(shí)例五新油佐劑疫苗免疫肉鴨后HI抗體水平變化檢測(cè)II、禽流感H5N1 (Re-5株)滅活疫苗的制備將實(shí)例I中得到的EQLANE130新油佐劑和白油分別與禽流感H5N1 (Re-5株)抗原液(由廣東大華農(nóng)動(dòng)物保健品股份有限公司提供)，按照I : I的體積比列混勻，再用高速勻漿機(jī)乳化10分鐘，即分別制備成H5N1 (Re-5株)+EQLANE130新油佐劑滅活疫苗和 H5N1 (Re-5株)+白油滅活疫苗，并以沒有經(jīng)過處理的H5N1 (Re-5株)抗原和生理鹽水分別作為對(duì)照。2、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組取10-14日齡肉鴨24只，分4組，每組6只，各組按O. 3ml/只的劑量分別頸部皮下注射上述疫苗，H5N1 (Re-5株)抗原或生理鹽水，具體分組如下(1)、冊(cè)附(1^-5株)+白油佐劑組(2)H5N1 (Re-5 株)+EQLANE130 新油佐劑組(3)、H5N1 (Re-5 株)抗原組
(4)、生理鹽水組3、采樣免疫前取血I次；免疫后10天，14天，21天，28天、35天、42天各取血一次，共取 7次；每次取血O. 5-lml ;血樣置37°C 1-2小時(shí)，4000轉(zhuǎn)/分離心8_10分鐘，取血清置于離心管中，-20°C保存?zhèn)溆谩?、抗體檢測(cè)檢測(cè)方法和步驟和實(shí)例4相同。5、結(jié)果將所得結(jié)果作圖如圖4，分析圖4可知通過實(shí)驗(yàn)用禽流感H5Nl(Re_5)制備出來的滅活疫苗，新油佐劑滅活疫苗和原白油佐劑滅活疫苗免疫麻鴨后均能產(chǎn)生較高的抗體， 因前期受母源抗體的影響，兩種疫苗均要到免疫后28天才能產(chǎn)生較高的抗體，且維持一段較高的時(shí)間，二者比較起來EQLANE130新油佐劑滅活疫苗組明顯好于原白油佐劑滅活疫苗組，從第28天開始整體抗體效價(jià)EQLANE130新油佐劑滅活疫苗組抗體水平平均高出原白油佐劑滅活疫苗組1-2 (log2)，在抵御禽流感病毒入侵將起到十分重要的作用。實(shí)例六新油佐劑疫苗免疫肉鴨后HI抗體水平變化檢測(cè)2I、禽流感H5Nl(Re_4株)滅活疫苗的制備將實(shí)例I中得到的EQLANE130新油佐劑和白油分別與禽流感H5N1 (Re-4株)抗原液(由廣東大華農(nóng)動(dòng)物保健品股份有限公司提供)，按照I : I的體積比例混勻，再用高速勻漿機(jī)乳化10分鐘，即分別制備成H5N1 (Re-4株)+EQLANE130新油佐劑滅活疫苗和 H5N1 (Re-4株)+白油佐劑滅活疫苗，并以沒有經(jīng)過處理的H5N1 (Re-4株)抗原和生理鹽水分別作為對(duì)照。2、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組取10-14日齡肉鴨24只，分4組，每組6只，各組鴨頸部皮下注射下述疫苗O. 3ml/ 只，具體分組如下(l)H5Nl(Re_4 株)+白油佐劑組(2)H5N1 (Re-4 株)+EQLANE130 新油佐劑組(3)、H5N1 (Re-4 株)抗原組(4)、生理鹽水組3、采樣免疫前取血I次；免疫后10天，14天，21天，28天、35天、42天各取血一次，共取 7次；每次取血O. 5-lml ;血樣置37°C 1-2小時(shí)，4000轉(zhuǎn)/分離心8_10分鐘，取血清置于離心管中，-20°C保存?zhèn)溆谩?、抗體檢測(cè)檢測(cè)方法和步驟和實(shí)例4相同。5、結(jié)果將所得結(jié)果作圖如圖5，分析圖5可知通過實(shí)驗(yàn)用禽流感H5Nl(Re_4)抗原制備出來的滅活疫苗，新油佐劑滅活疫苗和原白油佐劑滅活疫苗免疫麻鴨后均能產(chǎn)生較高的抗體，因前期受母源抗體的影響，兩種疫苗均要到免疫后28天才能產(chǎn)生較高的抗體，且維持一段較高的時(shí)間，二者比較起來EQLANE130新油佐劑滅活疫苗組明顯好于原白油佐劑滅活疫苗組，特別是到免疫后42天EQLANE130新油佐劑滅活疫苗組整體抗體水平高于原白油佐劑滅活疫苗組l-2(log2)。以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說明，不能認(rèn)定本發(fā)明的具體實(shí)施只局限于這些說明。對(duì)于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，其架構(gòu)形式能夠靈活多變，可以派生系列產(chǎn)品。只是做出若干簡(jiǎn)單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明由所提交的權(quán)利要求書確定的專利保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1 1一種禽用滅活疫苗的油佐劑，其含有組分及各組分的體積百分比如下聚氧乙烯氫化蓖麻油RH40O. 5-12% ；油酸山梨醇脂(司班-80)1-21% ；吐溫-80所述油為EQLANE 130。
2.如權(quán)利要求I所述的禽用滅活疫苗的油佐劑的制備方法，其特征在于，包括如下具體步驟(O按配方分別量取聚氧乙烯氫化蓖麻油RH40，油酸山梨醇脂(司班-80)，吐溫-801-5%，油和抗原液；將油加熱到60-100°C，按照體積比加入聚氧乙烯氫化蓖麻油RH40，混勻；(2)待油溫降到50°C以下后，加入油酸山梨醇脂攪拌均勻，110°C滅菌30分鐘，冷卻，即得到所述禽用滅活疫苗的油佐劑。
3.一種禽用滅活疫苗，其特征在于，其含有組分及各組分的體積百分比如下聚氧乙烯氫化蓖麻油RH400.5-5%;油酸山梨醇脂(司班-80)1-10% ；吐溫-801-5% ；油25-67. 5% ；抗原液30-55% ；所述油為EQLANE 130。
4.如權(quán)利要求3所述的禽用滅活疫苗，其特征在于，所述禽用滅活疫苗含有組分及各組分的體積百分比如下聚氧乙烯氫化蓖麻油RH401.5-2%;所述油為EQLANE 130。
5.如權(quán)利要求3或4所述的禽用滅活疫苗的制備方法，其特征在于，包括如下具體步(1)按配方分別量取聚氧乙烯氫化蓖麻油RH40，油酸山梨醇脂(司班-80)，吐溫-801-5%，油和抗原液；將油加熱到60-100°C，按照體積比加入聚氧乙烯氫化蓖麻油RH40，混勻；(2)待油溫降到50°C以下后，加入油酸山梨醇脂攪拌均勻，110°C滅菌30分鐘，冷卻，即得到所述禽用滅活疫苗的油佐劑；(3)將所述禽用滅活疫苗的油佐劑與抗原液混合，乳化后即得到禽用滅活疫苗，2-8°C儲(chǔ)存?zhèn)溆谩Ｓ退嵘嚼娲贾?司班-80) 吐溫-80 油抗原液4. 5-6% ； 1-2% ； 43-44% ； 40-50%
全文摘要
本發(fā)明提供了一種禽用滅活疫苗，其含有組分及各組分的體積百分比如下聚氧乙烯氫化蓖麻油RH400.5-5%；油酸山梨醇脂(司班-80)1-10%；吐溫-801-5%；油25-67.5%；抗原液30-55%；所述油為EQLANE130。配置疫苗時(shí)將制備得到的EQLANE130新油佐劑與抗原11混勻、乳化后得到滅活疫苗。用EQLANE130新油佐劑制備疫苗能夠減少10%油的用量，將制備過程縮短為兩步，免疫動(dòng)物后能夠提高體液免疫反應(yīng)和增強(qiáng)免疫效果。
文檔編號(hào)A61P37/04GK102580082SQ201210048108
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月28日
發(fā)明者何忠淮, 王賓, 陳瑞愛, 黃文科 申請(qǐng)人:廣東大華農(nóng)動(dòng)物保健品股份有限公司, 肇慶大華農(nóng)生物藥品有限公司