專利名稱：增強腺相關病毒載體功能的方法
增強腺相關病毒載體功能的方法
本申請是國際申請PCT/US2006/013375，國際申請日2006年4月7日，中國國家階段申請號200680010566. 6，名稱“增強腺相關病毒載體功能的方法”的發明專利申請的分案申請。
發明背景
腺相關病毒(AAV)是細小病毒科(Parvovirus)家族的一個成員，它是小的無包膜、二十面體病毒，具有4. 7千堿基(kb)到6kb的單鏈線性DNA基因組。由于該病毒是作為純化的腺病毒原種的污染物被發現的，AAV指定為依賴病毒屬(Dependovirus)。AAV的生命周期包括潛伏期(AAV基因組在感染后位點特異性整合入宿主染色體)，感染期(腺病毒或單純皰疹病毒感染后，整合的基因組接著得到拯救、復制并包裝入感染的病毒)。非致病性、寬宿主范圍(包括非分裂細胞)感染性以及潛在的位點特異性染色體整合的特性使得MV成為用于基因轉移的有吸引力的工具。
已經描述AAV載體用于治療用和免疫原性分子的運載工具。迄今為止，已從人或非人靈長類(NHP)中分離了幾種表征良好的不同AAV。
最近，研究者描述了不同序列的大量AAV[G. Gao等人，Proc Natl Acad Sci USA, 100 (10) : 6081-6086 (2003 年 5 月 13 日)；US-2003-0138772-Al (2003 年 7 月 24 日)]，并且將這些AAV表征為不同的血清型和分化體[G. Gao等人，J. Virol. ,78(12) :6381-6388(2004 年6月)；國際專利公開號WO 2005/033321]。已報道不同的AAV表現出不同的轉染效率， 也表現出對不同細胞或組織的趨性。
想要得到用于向不同細胞類型遞送異源分子的基于AAV的構建體。
發明概述
本發明提供了一種用于改善無功能和/或功能弱的AAV載體的方法。
一方面，該方法提供了一種在選定的腺相關病毒(AAV)序列中校正單現突變 (singleton)以提高選定AAV的包裝產量、轉導效率和/或基因轉移效率的方法。該方法包括改變親代AAV衣殼中的一個或多個單現突變使所述單現突變與用來比對的功能性AAV衣殼序列中對應位點的氨基酸相一致。
另一方面，本發明提供了經修正的AAV序列，即除去一個或多個單現突變的序列。
又一方面，本發明提供了具有根據本發明修正的AAV衣殼的AAV載體。
下述發明詳述容易地表現出本發明的其他方面和優點。
附圖簡述


圖1顯示經單現突變校正的AAV載體的體外293轉導。在載體名稱之后標明了單現突變的校正(如果存在的話)，數字表示突變的數目。
圖2A-2C顯示用293細胞測定的AAV載體在感染復數范圍為IO1到IO4的滴度，其中，圖2A比較親代rh. 8和經單現突變校正的rh. 8 (rh. 8R)，圖2B比較親代rh. 37和經修正的rh. 37，圖2C比較AAV2和AAV8。作為對照，還給出了 AAV2和AAV2/8 eGFP表達載體的相似滴定的結果。Y軸表示以流式細胞計數法測定的eGFP陽性細胞百分比(%)。
圖3是AAV序列的系統發生樹，顯示了它們的系統發生關系和所屬分化體
圖 4A-4L 是 AAV2 [SEQ ID NO: 7]、cy. 5 [SEQ ID NO:8]、rh. 10 [SEQ ID NO:9]、 rh.13[SEQ ID NO:10]、AAVl[SEQ ID NO:11]、AAV3[SEQ ID NO:12]、AAV6[SEQ ID NO:13], AAV7[SEQ ID NO:14]、AAV8[SEQ ID NO:15]、hu. 13[SEQ ID NO:16]、hu. 26[SEQ ID NO:17], hu. 37[SEQ ID NO:18]、hu. 53[SEQ ID NO:19]、rh. 39[SEQ ID NO:20]、rh. 43[SEQ ID NO:21]rh. 46[SEQ ID NO:22]的衣殼蛋白(vpl)核酸序列的比對。
圖 5A-5D 是 AAV2 [SEQ ID NO: 23]、cy. 5 [SEQ ID NO: 24]、rh. 10 [SEQ ID NO: 25]、 rh. 13[SEQ ID NO:26]、AAVl[SEQ ID NO:27]、AAV3[SEQ ID NO:28]、AAV6[SEQ ID NO:29], AAV7[SEQ ID NO:30]、AAV8[SEQ ID NO:31]、hu. 13[SEQ ID NO:32]、hu. 26[SEQ ID NO:33], hu. 37[SEQ ID NO:34]、hu. 53[SEQ ID NO:35]、rh. 39[SEQ ID NO:36]、rh. 43[SEQ ID NO:37]rh. 46[SEQ ID NO:38]的衣殼蛋白(vpl)氨基酸序列的比對。
圖 6A-6B 是 rh. 13[SEQ ID NO: 26]、rh. 2 [SEQ ID NO: 39]、rh. 8 [SEQ ID NO:41]、 hu. 29[SEQ ID NO:42] rh. 64[SEQ ID NO:43]的衣殼蛋白(vpl)氨基酸序列的比對。
發明詳述
本發明提供了一種改善AAV載體功能的方法。本發明尤其適合于改善衣殼含一個或多個單現突變的AAV載體的包裝產量、轉導效率和/或基因轉移效率。本發明進一步提供了根據本發明的方法鑒定和制備的新AAV衣殼序列。
本說明書與權利要求書使用的術語“包含/含有”和“包括”包括其他成分、元素、 數值、步驟等等在內。相反，術語“由...組成”和其變體不包括其他成分、元素、數值、步驟等等在內。·
本發明的單現突變方法
如本文中所用的術語“單現突變(singleton) ”指在選定的(即親代)AAV衣殼序列中的給定位點上的可變氨基酸。通過將親代AAV衣殼序列與功能性AAV衣殼序列文庫比對來確定可變氨基酸的存在。然后分析序列來確定親代AAV衣殼中所有這樣的可變氨基酸序列功能性AAV文庫中的AAV序列在此氨基酸位置完全保守。然后改變親代AAV序列，將單現突變改變為經鑒定功能性AAV衣殼序列在該位點上的保守氨基酸。根據本發明，親代 AAV序列可能具有1-6、1-5、1-4、1-3或2個單現突變。親代AAV序列也可能具有超過6個單現突變。
一旦修正后，經修正的AAV衣殼可用于構建具有經修正衣殼的AAV載體。可使用本領域技術人員公知的技術來構建載體。
根據本發明方法所選擇的用于修正的AAV是想要與親代AAV相比增強其下列三種功能特性之一或多種的AAV，所述的三種功能特性即包裝成具有選定AAV序列的衣殼的病毒粒子，提高轉導效率或增加基因轉移效率。例如，與密切相關的其他AAV相比，親代AAV 的特征可能在于具有較低的包裝效率。在另一個實例中，與密切相關的AAV相比，親代AAV 可能具有較低的轉導效率。在另一個實例中，與密切相關的AAV相比，親代AAV可能具有較低的基因轉移效率(即體內遞送靶分子的能力較低)。在其他的實例中，親代AAV的上述各項功能都合格，但有待進一步提高其中一項或多項功能。
因此，本發明提供了一種功能性AAV的文庫，其中AVV的序列與選定的(親代)AAV 形成對照。適宜的是，該文庫包含具有目標功能的AAV,該目標功能正是欲在選定親代AAV實現的改善。換句話說，該功能性AAV文庫的每一序列的特征在于具有目標水平的包裝能力、目標水平的體外轉導效率或目標水平的體內基因轉移效率(即在對象中向選定靶組織或細胞的遞送能力)。組成文庫的功能性AAV可分別具有這些功能性特征中的一種、兩種或全部。本領域技術人員可容易地確定文庫的其他目標功能。
在一個實施方案中，功能性AAV是能產生具有與AAV1、AAV2、AAV7、AAV8或AAV9同等或更強包裝和轉導效率的病毒粒子的AAV。可用含AAV2r印和AAV2 ITR的假型包裝設定(pseudotype setting)來測評功能。因此，可使用常規技術構建改變的親代AAV,并且， 當與AAV2的產量相比，如果由所屬親代AAV產生病毒的滴度為至少50%時，則認為該AAV 載體是功能性的。另外，本領域技術人員可容易地確定AAV轉導細胞的能力。例如，可構建親代AAV使其包含易于測知病毒的標記基因。例如,讓AAV包含eGFP或另一可進行突光檢測的基因。如果AAV包含CMV-eGFP，當將由改變的親代AAV衣殼產生的病毒以感染復數IO4 轉導293細胞時，轉導效率大于全部細胞GFP熒光的5%時表示有功能，其中，所述細胞以感染復數20用野生型人5型腺病毒預處理2小時。
適宜的是，文庫由至少三種或至少四種功能性AAV衣殼序列組成，所述序列代表至少兩種不同的分化體。優選地，文庫包含各代表性分化體的至少兩個序列。在某些實施方案中提供了三個、四個、五個、六個或更多的分化體。
“分化體”指基于AAV vpl氨基酸序列比對，經鄰接算法、自展值(Bootstrap value)為至少75% (至少1000次復制)確定，并且泊松校正距離不大于O. 05的在系統發生上彼此相關的一組AAV。
文獻中有關于鄰接算法(Neighbor- jioning algorithm)的詳細描述。參見,例如 M. Nei 與 S. Kumar,《分子進化與系統發生學》(Molecular Evolution and Pylogenetics) (牛津大學出版社，紐約(2000))。已有現成用于執行該算法的計算機程序。例如，MEGA v2.1 程序執行改進的Nc1-Goiobori方法。使用這些技術與計算機程序，以及AAV vpl衣殼蛋白序列，本領域的技術人員可容易地確定所選定的AAV是否包含在本文所鑒定的一個分化體內、另一個分化體內、或在這些分化體之外。
雖然分化體主要基于天然存在的AAV vpl衣殼，但并不限于天然存在的AAV。分化體可包括非天然存在的AAV，包括但不限于重組、修飾或改變、嵌合、雜交、合成、人工即其他 AVV，只要這些AVV是基于AAV vpl氨基酸序列比對、用鄰接算法(自展值至少75% (至少 1000次復制))確定且泊松校正距離測量值不大于0. 05的系統發生上彼此相關的AAV。
所描述的AAV分化體包括分化體A (以AAVl和AAV6為代表)、分化體B (以AAV2為代表)、分化體C (以AAV2-AAV3雜交體為代表)、分化體D (以AAV7為代表)、分化體E (以 AAV8為代表)與分化體F (以人AAV9為代表)。這些分化體以各自的成員一一種已知AAV 血清型一為代表。已知的AAVl和AAV6同屬于一個分化體(分化體A)，其中包括回收自3 人的4種分離株。已知的AAV3和AAV5血清型彼此顯著不同，但在本文所述的篩選中未檢測到，沒有包括于這些分化體中。
AAV 分化體的進一步討論可見于 G. Gao 等人，J. Virol. ,78(12) :6381-6388(2004 年6月)和國際專利公開號WO 2004/028817和WO 2005/033321中。后一文件還提供了新的人AAV序列,此處引用作為參考。
在一個實施方案中，用于本發明方法的文庫不包括AAV5。在另一個實施方案中,用于本發明方法的文庫不包括AAV4。然而，在某些實施方案中，例如當親代AAV類似于AAV5 時，在比對中可能需要包括該序列。
雖然可構建包含最小數目序列的文庫，但是可通過利用包含較多序列的文庫來優化鑒定單現突變的效率。適宜的是，所述文庫包含最少四個序列，代表至少兩個分化體。優選地，該文庫中，各分化體各自有至少兩種代表序列。在一個實施方案中，該文庫包含超過 100個AAV序列。在另一個實施方案中，該文庫包含至少3到100個AAV序列。在又一個實施方案中，該文庫包含至少6到50個AAV序列。
適用于本發明功能性文庫的AAV包含，例如AAV1、AAV2、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9 及其他已描述的序列，[G. Gao 等人，Proc Natl. Acad Sc1.，100 (10) :6081-6086 (2003 年 5 月13日)；國際專利公開號WO 2004/042397和WO 2005/033321)]。本領域技術人員可以容易地選擇其他AAV，例如使用國際專利公開號WO 03/093460Α1(2003年11月13日)和美國專利申請公開號2003-0138772A1 (2003年7月24日)描述的方法所分離的AAV。
根據本發明，所述文庫內的所述至少三個序列在衣殼序列全長比對中至少有85% 同一I"生。
蛋白質全長或其片段的氨基酸序列的“同一性百分比(%)”可容易地確定。適宜的是，片段長度至少為大約8個氨基酸，也可長達大約700個氨基酸。通常，當提及兩種不同的腺相關病毒之間的“同一性”、“同源性”或“相似性”時，“同一性”、“同源性”或“相似性”是參照進行“比對”的序列確定的。“比對”序列或“比對”指這樣的多核酸序列或蛋白質(氨基酸)序列，它們與參考序列相比通常包含堿基或氨基酸缺失或增加的校正。
可使用各種公知或市售的多序列比對程序進行比對。用于氨基酸序列比對的程序有例如:“Clustal X”、“MAP” 、“PIMA”、“MSA”、“BLOCKMAKER”、“MEME” 和 “Match-Box” 程序。雖然本領域技術人員可視需要改變設置，但通常這些程序都以默認設置使用。或者，本領域技術人員也可采用能夠象上述算法和程序一樣得出同一性述評或進行比對的其他算法和計算機程序。參見，例如J. D. Thomson等人，Nucl. Acids. Res.，“多序列比對白勺綜合比較(A comprehensive comparison of multiple sequence alignments)，，， 27(13):2682-2690(1999)。
也有用于核酸序列的多序列比對程序。這種程序的實例包括通過因特網的網絡服務器可得的“W串(Clustal胃)”、“04 序列組件”、“祖 ”和“1^1 ”。這些程序的其他來源是本領域技術人員所已知的。或者，也可使用Vector NTI實用程序。還有許多本領域已知的算法也可用于測量核苷酸序列同一性，包括包含在上述程序中的算法。作為另一個實例， 可使用GCG 6.1版中的程序Fasta 來比較多核苷酸序列。Fasta 可得出查詢序列與檢索序列之間最佳重疊區域的對比和序列同一性百分比。例如，可使用GCG 6.1版提供的默認參數(字長為6和用于計分矩陣的NOPAM系數)用Fasta 來確定核酸序列之間的序列同一性百分比，該程序此處引用作為參考。
根據本發明，將被疑包含單現突變的靶或親代AAV衣殼序列與文庫的AAV衣殼序列進行比較。使用AAV衣殼的全長vpl蛋白序列比對進行該比較。
當AAV序列對齊時，對于選定的氨基酸位點，如果文庫中所有AAV在此具有相同的氨基酸殘基(即是完全保守的)而親代AAV具有與此不同的氨基酸殘基，則鑒定到單現突變。
一般地，當以AAV衣殼vpl蛋白為基礎來進行比對時，該比對包含了如此測得的與參比AAV序列(例如AAV2)相比的插入和缺失，氨基酸殘基的編號是基于該比對產生的基準標度(reference scale)。但是，任何給定的AAV序列都可能比基準標度少如干氨基酸殘基。在本發明中，當描述親代AAV和參考文庫的序列時，術語“相同的位點”或“相應的位點”指相對于比對所用的基準標度，各序列氨基酸內相同編號殘基處的氨基酸。但是，在比對之外，各AAV vpl蛋白質內的這些氨基酸可能在不同編號的殘基處。
可選地，可用核酸比對進行本發明方法，并將編碼不同氨基酸的密碼子(即非同義密碼子)鑒定為單現突變。當親代AAV中給定密碼子的核酸序列雖然與文庫中該密碼子的序列不同，但編碼的氨基酸相同時，這些不同的密碼子序列是同義密碼子而非單現突變。
根據本發明，包含單現突變的親代AAV被改變為其中的單現突變殘基被替換為文庫中AAV的保守氨基酸殘基。
可使用常規的定點誘變技術對可變氨基酸的密碼子進行上述置換。一般地，使用僅包括必須步驟的定點誘變來獲得想要的保守氨基酸殘基的密碼子。這樣的方法是本領域技術人員已知的，并可使用公開的方法和/或市售的試劑盒來實行(例如可以從 Stratagene和Promega獲得)。可在AAV基因組序列上實行定點誘變。為了方便起見可用載體(例如質粒骨架)攜帶AAV序列。或者，本領域技術人員可使用本領域公知的其他技術來改變親代AAV。
親代AAV可具有多于一個的單現突變，例如兩個、三個、四個、五個、六個或更多。 但是，可能在一個單現突變校正之后就觀察到功能上的改善。在親代AAV攜帶多個單現突變的實施方案中，可以每次改變一個單現突變，隨后測定修正AAV是否最強了想要的功能。 或者，可在改變多個單現突變后測定想要的功能是否增強。
當親代AAV包含多個單現突變時，即使第一個單現突變改變后就觀察到了功能的改善，仍可以通過改變其余的單現突變來優化功能。
一般地，根據本發明的方法改變了一個或多個單現突變的親代AAV通過將AAV包裝成AAV顆粒來測定其功能。本領域技術人員熟知這些方法，參見，例如如上引用的G. Gao 等人，Proc Natl Acad Sc1. ;Sambrook等人,分子克隆實驗室手冊(Molecular Cloning:A Laboratory Manual),冷泉港出版社(冷泉港,紐約)。
這些改變的AAV具有根據本發明方法產生的新的衣殼，并就其功能接受測定。本文描述了測定AAV功能的適當方法，包括，例如產生脫氧核糖核酸酶(DNAse)保護顆粒能力、體外細胞轉導效率和/或體內基因轉移。適宜的是，與親代AAV的功能相比，本發明改變的AAV具有足夠數目的單現突變被改變從而增強了這些特征性功能中一項或全部。
I1.本發明的新AAV
本發明進一步提供了預測新AAV是否有功能的方法。該方法包含使用本發明的單現突變方法和鑒定選定AAV序列中單現突變的缺失，即沒有單現突變的AAV。
因此，在一個實施方案中，本發明提供了選擇AAV用于產生載體的方法。該方法包括選擇待分析的親代AAV衣殼序列，并在親代AAV衣殼序列和功能性AAV衣殼序列文庫的比對中鑒定親代AAV衣殼上單現突變的缺失。一旦確定選定AAV衣殼沒有單現突變，則該 AVV可根據已知技術用來產生載體。
當術語“基本同源性”或“基本相似性”用于核酸或其片段時意味著當與另一核酸(或其互補鏈)進行包含適當的核苷酸插入或缺失的最佳比對時，比對序列的至少約95% 到99%具有核苷酸序同一性。優選在全長序列、或其開放讀碼框、或其他至少長15個核苷酸的合適片段上具有上述同源性。本文描述了合適片段的實例。
文中用于核酸序列時，術語“序列同一性”、“序列同一性百分比”或“同一性百分比”指在最佳匹配比對中，兩條序列的殘基相同。序列同一性比較的長度可以是基因組全長、基因編碼序列的全長，或需要至少約500到5000個核苷酸的片段。然而，也可能要求較小片段之間的同一性，例如至少約9個核苷酸、通常至少約20到24個核苷酸、至少約28到 32個核苷酸、至少約36或更多核苷酸的片段。
當術語“基本同源性”或“基本相似性”用于描述氨基酸或其片段時意味著當與另一氨基酸(或其互補鏈)進行包含適當的氨基酸插入或缺失的最佳比對時，對比序列的至少約95%到99%具有氨基酸序列同一性，在某些實施方案中，對比序列中的約97%具有同一性。優選在全長序列，或其蛋白(例如，cap蛋白、rep蛋白)或其至少8個氨基酸、或更理想至少15個氨基酸長度的片段上具有上述同源性。本文描述了合適片段的實例。
術語“高度保守的”表示至少80%的同一性，優選至少90%的同一性，更優選超過 97%的同一性。本領域技術人員可根據本領域已知的算法和程序容易地確定同一性。
術語“血清型”是指具有衣殼的AAV在血清學上不同于其他AAV血清型區別。血清學區別是基于該AAV的抗體與其他AVV沒有交叉反應來確定的。交叉反應性通常用中和抗體試驗測定。為了進行該試驗，使用腺相關病毒在兔子或其他合適動物模型中產生抗特定AAV的多克隆血清。在該試驗中，隨后測試所產生的特定AAV的抗血清中和相同(同源) 或異源AAV的能力。將達到50%中和作用的稀釋度作為中和抗體滴度。如果就兩種AAV而言，異源滴度除以同源滴度之商的倒數小于16，則此兩種載體被認為是相同的血清型。相反，如果異源滴度與同源滴度之比的倒數是16或更大，則這兩種AAV被認為是不同的血清型。
在另外的的實施方案中，本發明提供了具有新的衣殼的AAV，包括rh. 20、 rh. 32/33,rh. 39,rh. 46,rh. 73 和 rh. 74。rh. 20 的序列具有 SEQ ID NO:1 的氨基酸序列或與全長SEQ ID NO:1具有95-99%同一性的序列。rh. 32/33的衣殼具有SEQ ID NO: 2的氨基酸序列或與全長SEQ ID NO: 2具有95-99%同一性的序列。rh. 39的衣殼具有SEQ ID NO: 3 的氨基酸序列或與全長SEQ ID NO:3具有95-99%同一性的序列。rh. 46的衣殼具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列或與全長SEQ ID NO:4具有95-99%同一性的序列。rh. 73的衣殼具有SEQ ID NO: 5的氨基酸序列或與全長SEQ ID NO: 5具有95-99%同一性的序列。rh. 74的衣殼具有SEQ ID NO: 6的氨基酸序列或與全長SEQ ID NO: 6具有95-99%同一性的序列。優選地，這些新AAV衣殼序列的同一性達到使它們沒有任何單現突變的程度。新AAV序列見序列表。
在又一個實施方案中，本發明的新AAV序列包括經單現突變校正的AAV衣殼蛋白和編碼這些衣殼蛋白的序列。適當的經單現突變校正的AAV序列的實例包括AAV6.1、 AAV6. 2、AAV6.1. 2、rh. 8R、rh. 48.1、rh. 48. 2、rh. 48.1. 2、hu. 44R1、hu. 44R2、hu. 44R3、 hu. 29R、ch. 5Rl、rh. 67,rh. 54,hu. 48Rl、hu. 48R2 和 hu. 48R3。例如，經單現突變校正的 AAV6 包括AAV6.1、AAV6. 2和AAV6. 12，它們顯示了與親代AAV6序列相比明顯的功能改善。
特別理想的蛋白質包括由如前所述鑒定的核苷酸序列所編碼的AAV衣殼蛋白。所述AAV衣殼由vpl、vp2和vp3這三種蛋白質組成，它們互為剪接變體。衣殼蛋白的其他理想的片段包括位于高變區(HVR)之間的恒定區和可變區。衣殼蛋白的其他理想的片段包括 HVR本身。
一種開發用于確定AAV2中序列歧變區域的算法得出了 12個高變區(HVR)， 其中的5個與先前所述的四個可變區重疊或是其一部分(Chiorini等人，J. Virol., 73:1309-19 (1999) ； Rut I edge 等人，J. Virol.，72:309-319)。使用該算法和 / 或本文所描述的比對技術，確定了新AAV血清型的HVR。例如，HVR位于如下位置HVR1，aal46_152 ；HVR2, aal82-186 ；HVR3, aa262_264 ；HVR4, aa381_383 ；HVR5, aa450_474 ；HVR6, aa490_495 ；HVR7, aa500-504 ；HVR8, aa514-522 ；HVR9, aa534_555 ；HVR10, aa581-594 ；HVRlI, aa658_667 ；以及HVR12，aa705-719 [該編號系統是基于使用AAV2vpl作為參考點的比對]。使用Clustal X程序及其默認設置，或使用其他市售或公知的比對程序及其默認設置(如本文所述的那些)來進行本文的比對，本領域技術人員可容易地確定本發明的新AAV衣殼的相應片段。
適宜的是， 片段至少長8個氨基酸。但是，也可方便地采用其他所需長度的片段。 可通過重組或其他合適的方法例如化學合成來產生這樣的片段。
本發明進一步提供了使用本文所提供的序列信息鑒定的其他AAV序列。例如，鑒于本文所提供的序列，可使用基因組步移技術(genome walking technology) (Siebert等人，1995, Nucleic Acid Research, 23:1087-1088, Friezner-Degen 等人，1986, J. Biol. Chem. 261:6972-6985, BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA)來分離感染性序列。基因組步移技術尤其適合于鑒定和分離與本發明方法所鑒定的新序列鄰近的序列。基于本文所提供的新AAV衣殼序列和rep序列，該技術還可用于分離新AAV的反向末端重復(ITR)。
可由本發明的AAV核酸序列來表達新的AAV氨基酸序列、肽和蛋白質。另外，也可通過本領域已知的其他方法來產生這些氨基酸序列、肽和蛋白質，所述方法包括例如化學合成、其他合成方法或其他方法。可使用多種方法容易地產生本文提供的任一 AAV衣殼序列。
合適的生產技術是本領域技術人員所熟知的。參見，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(Molecular Cloning:A Laboratory Manual),冷泉港出版社(冷泉港，紐約)。或者，還可通過眾所周知的固相肽合成法(Merrifield, J. Am. Chem. Soc, 85:2149 (1962) ；Stewart 和 Young,固相妝合成(Solid Phase Peptide Synthesis) (Freeman,舊金山，1969),第27-62頁)來合成肽。這些及其他適當的生產方法是本領域技術人員已知的，并且不構成對本發明的限定。
可通過各種合適的方法生產本發明的序列、蛋白質和片段，包括重組生產、化學合成或其他合成方法。這種生產方法是本領域技術人員已知的，并且不構成對本發明的限定。
II1.具有新AAV衣殼的rAAV的生產
本發明包括在按照本發明方法鑒定單現突變后通過突變產生的新的AAV衣殼序列ο本發明進一步包括新的AAV rh. 20、rh. 32/33、rh. 39、rh. 46、rh. 73和rh. 74衣殼序列 (SEQ ID No:1-6)。
在另一個方面，本發明提供了利用了本發明的新AAV序列(包括其片段)的用于產生將異源基因或其他核酸序列遞送至靶細胞的病毒載體的分子。
本發明含有AAV序列的分子包括有可遞送至宿主細胞的各種遺傳元件(載體)，例如能夠傳送所帶序列的裸DNA、質粒、噬菌體、轉座子、粘粒、附加體、非病毒遞送載體中的蛋白質(如基于脂質的運載體)、病毒等。
選定載體可通過各種合適的方法遞送，包括轉染、電穿孔、脂質體遞送、膜融合技術、高速DNA包被小球、病毒感染與原生質體融合。用于構建本發明這一方面實施方式的方法是核酸操作領域(包括遺傳工程、重組工程與合成技術)的技術人員已知的。參見，例如Sambrook等，分子克隆實驗室手冊(Molecular Cloning A Laboratory Manual),冷泉港出版社，冷泉港，紐約。
在一個實施方案中，本發明的載體含有編碼本發明的AAV衣殼或其片段的序列及其他元件。在另一個實施方案中，本發明的載體至少含有編碼AAV rep蛋白或其片段的序列。任選地，本發明的載體可含有AAV cap和rep蛋白。在既有AAV rep又有cap的載體中，AAV r印和AAV cap序列可來源于同一分化體的AAV。或者，本發明提供含有來自不同 AAV的rep序列和cap序列載體。在一個實施方案中，rep和cap序列由彼此獨立的來源 (例如分開的載體，或宿主細胞和載體)表達。在另一個實施方案中，rep序列與來自不同 AAV的ca·p序列框內融合形成嵌合AAV載體。任選地，本發明的載體是包裝在本發明的AAV 衣殼中的載體。這些載體與本文所述的其他載體可進一步包含含有選定轉基因的小基因， 轉基因兩側是AAV5' ITR和AAV3' ITR0
因此,在一個實施方案中,本文所述的載體含有編碼來自同一 AAV序列的完整AAV 衣殼的核酸序列。或者，這些載體含有編碼人造衣殼的序列，所述人造衣殼含有與異源AAV 或非AAV衣殼蛋白(或其片段)融合的經單現突變校正的AAV衣殼的一個或多個片段。這些人造衣殼蛋白選自經單現突變校正的衣殼的非連續部分或選自其他AAV衣殼。這些改變的目的是為了增加表達、產量和/或改善選定表達系統中的純化，或為了其他目的(例如 改變趨性或修改中和抗體表位)。
本文所描述的載體例如質粒可用于各種目的，但特別適用于產生含有衣殼的 rAAV,所述衣殼包含AAV序列或其片段。本文詳細描述了這些載體,包括rAAV、它們的元件、 構建體和應用。
在一方面，本發明提供了一種產生具有本發明新AAV衣殼的重組腺相關病毒 (AAV)的方法。該方法涉及培養宿主細胞,該宿主細胞含有如本文所定義的編碼本發明新 AAV衣殼蛋白或其片段的核酸序列；功能性rep基因；至少由AAV反向末端重復(ITR)和轉基因組成的小基因；與足夠的輔助功能因子以將小基因包裝進AAV衣殼蛋白。
在宿主細胞內培養將AAV小基因包裝進AAV衣殼所必需的成分可以瞬時性地(in transe)提供給宿主細胞。或者，由已經用本領域技術人員已知的方法改造而含有一種或多種必需成分的穩定宿主細胞來提供一種或多種必需成分(例如小基因、rep序列、cap序列和/或輔助因子功能)。更適宜的是，這種穩定的宿主細胞含有在誘導型啟動子控制下的所需成分。然而，必需成分也可在組成型啟動子的控制下。在關于適合與轉基因聯用的調節元件的討論中，本文提供了合適的誘導型和組成型啟動子的實例。或者，選定的穩定宿主細胞可含有在組成型啟動子控制下的選定成分和在一個或多個誘導型啟動子控制下的其他選定成分。例如可由293細胞(含有在組成型啟動子控制下的El輔助因子)制造穩定的宿主細胞，但所述穩定的宿主細胞含有在誘導型啟動子控制下的rep和/或cap蛋白。 本領域技術人員也可制備其他穩定的宿主細胞。
產生本發明的rAAV所需的小基因、rep序列、cap序列和輔助因子可以各種能夠傳遞所帶序列的遺傳元件的形式遞送至包裝宿主細胞。選定的遺傳元件可通過任何適當的方法，包括本文所述的方法來遞送。用于構建本發明這一方面的實施方案的方法是核酸操作(包括遺傳工程、重組工程與合成技術)領域的技術人員已知的。參見，例如Sambrook 等人，分子克隆實驗室手冊(Molecular Cloning A Laboratory Manual),冷泉港出版社，冷泉港，紐約。類似地，產生AAV病毒粒子的方法也是眾所周知的，并且適當方法的選擇不限制本發明。參見，例如K. Fisher等人，J. Virol. ,70 :520-532(1993)與美國專利號 5，478，745。
除非另有規定，本文所述的AAV ITR與其他選定AAV成分可容易地選自任一 AAV， 所述AVV包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV9和本發明的其他新 AAV序列。可使用本領域技術人員已知的技術容易地從AAV序列中分離這些ITR或其他AAV 成分。所述AAV可分離獲得或得自學術、商業或公共來源(例如美國典型培養物保藏中心 (ATCC)，Manassas，VA)。或者，所述AAV序列可參考例如文獻或數據庫(例如，GenBank')中的已公開序列通過合成或其他適當的方法獲得。
A、小基因
小基因至少由轉基因及其調節序列和5’和3’反向末端重復(ITR)組成。在一個理想的實施方案中，使用了 AAV血清型2的ITR。然而，也可選擇其他適當來源的ITR。正是該小基因將被包裝進衣殼蛋白并遞送至選定的宿主細胞。
1.轉基因
轉基因是編碼感興趣的多肽、蛋白質或其他產物，并與其側翼的載體序列異源的核酸序列。核酸編碼序列以允許轉基因在宿主細胞中轉錄、翻譯和/或表達的方式操作性地與調節組件相連。
轉基因序列的組成取決于所得到的載體的用途。例如一類轉基因序列包含報道序列，該序列在表達后產生可 檢測的信號。這種報道序列包括但不限于編碼以下物質的DNA 序列β -內酰胺酶、β -半乳糖苷酶(LacZ)、堿性磷酸酶、胸腺激酶、綠色熒光蛋白(GFP)、 增強型GFP(EGFP)、氯霉素乙酰轉移酶(CAT)、熒光素酶、膜結合蛋白(如CD2、CD4、CD8)、流感血凝素蛋白和本領域熟知的存在高親和力抗體或可通過常規方法產生所述抗體的其他物質，以及含有膜結合蛋白的融合蛋白，該膜結合蛋白適當地與血凝素或Myc等物質的抗原標記區融合。
當這些編碼序列與驅動其表達的調節元件相關聯時，可提供由常規方法檢測的信號，所述常規方法包括酶法、放射顯影法、比色法、熒光法或其他光譜測定、熒光激活細胞分選測定與免疫測定，包括酶聯免疫吸附測定(ELISA)、放射性免疫測定(RIA)和免疫組織化學。例如當標記序列是LacZ基因時，通過測定β_半乳糖苷酶的活性來檢測攜帶信號的載體的存在。當轉基因是綠色熒光蛋白或熒光素酶時，攜帶信號的載體可用光度計通過顏色或光的產生來觀測。
然而，理想地，轉基因是編碼具有生物或醫藥用途的產物的非標記序列，所述產物例如蛋白質、肽、RNA、酶、顯性陰性突變體或催化性RNA。理想的RNA分子包括tRNA、dsRNA、 核糖體RNA、催化性RNA、siRNA、小發夾RNA、反式剪接RNA和反義RNA。有用的RNA序列的一個例子是抑制或消除靶核酸序列在經處理的動物中表達的序列。通常，合適的靶序列包括腫瘤靶點和病毒疾病。例如后文免疫原部分所述的腫瘤靶點和病毒。
轉基因可用于校正或減少基因缺陷，包括正常基因的表達低于正常水平的缺陷或功能基因產物不表達的缺陷。或者，轉基因可為細胞提供本來不在該細胞類型或該宿主中表達的產物。轉基因序列的優選類型編碼在宿主細胞中表達的治療性蛋白質或多肽。本發明進一步包括使用多種轉基因。在某些情況下，可采用不同的轉基因編碼一個蛋白質的各個亞基，或編碼不同的肽或蛋白質。當編碼蛋白質亞基的DNA很大時這尤其適合，所述蛋白質例如免疫球蛋白、血小板衍生的生長因子或抗肌萎縮蛋白。為使細胞產生多亞基蛋白質， 用各自含有各不同亞基的重組病毒感染細胞。或者，蛋白質的不同亞基可由同一轉基因編碼。在這種情況下，單個轉基因包含編碼所有亞基的DNA，而各亞基的DNA由內部核糖體進入位點(IRES)隔開。當編碼每個亞基的DNA較小時，例如編碼亞基的DNA與IRES的總體積小于5千堿基對(5kb)時，這尤其適合。作為IRES的替代，DNA可用編碼在翻譯后階段自我切割的2A肽的序列隔開。參見，例如M. L. Donnelly等人，J. Gen. Virol.，78(第一部分):13-21 (1997 年 I 月)；Furler, S.等人，Gene Ther. ,8(11) :864-873(2001 年 6 月)； Klump H.等人，Gene Ther. ,8(10) :811-817 (2001 年 5 月)。該 2A 肽明顯小于 IRES，使得其非常適合用于當空間成為制約因素的時候。更常見的是，當轉基因較大、由多個亞基組成、或兩個轉基因共遞送時，允許共用攜帶所需轉基因或亞基的rAAV以使得它們在體內多聯化形成單一的載體基因組。在這種實施方案中，第一 AAV可攜帶表達一個轉基因的表達盒，第二 AAV可攜帶用于在宿主細胞中共表達的不同轉基因的表達盒。然而，選定的轉基因可編碼任何生物活性產物或其他產物，例如研究所需的產物。
本領域技術人員可容易地選擇適當的轉基因。轉基因的選擇不限制本發明。
2.調節元件
除了以上就小基因而言的主要元件以外，載體還包含常規控制元件，所述常規控制元件以允許轉基因在以下所述 細胞中轉錄、翻譯和/或表達的方式操作性地與轉基因相連，所述細胞為本發明產生的質粒載體轉染或病毒所感染。本文的“操作性相連”的序列包括與感興趣的基因毗連的表達控制序列和以反式(in trans)起作用或在一定距離開外控制感興趣基因的表達的控制序列。
表達控制序列包括適宜的轉錄起始子、終止子、啟動子和增強子序列；有效的RNA 加工信號，例如剪接和聚腺苷酸化(polyA)信號；穩定細胞質mRNA的序列；增強翻譯效率的序列(即=Kozak共有序列)；增強蛋白質穩定性的序列；以及在需要時增強編碼產物分泌的序列。許多表達控制序列，包括天然的、組成型的、誘導型的和/或組織特異性的啟動子是本領域已知并可利用的。
組成型啟動子的例子包括但不限于逆轉錄病毒Rous肉瘤病毒(RSV) LTR啟動子 (任選連有RSV增強子)、巨細胞病毒(CMV)啟動子(任選連有CMV增強子)[參見，例如 Boshart等人，Cell, 41 :521-530 (1985) ]、SV40啟動子、二氫葉酸還原酶啟動子、β _肌動蛋白啟動子、磷酸甘油激酶(PGK)啟動子和EFl啟動子(Invitrogen)。誘導型啟動子能調節基因表達，并可由外源提供的化合物、環境因素(例如溫度)、或特定生理狀態調節，所述狀態例如例如急性期、細胞的特定分化狀態，或僅在正在復制的細胞中起效。誘導型啟動子和可誘導系統可從多種商業來源獲得，包括但不限于Invitrogen、Clontech和Ariad。 已知的還有許多其他系統，可由本領域技術人員容易地選擇。受外源化合物調節的誘導型啟動子的實例包括鋅-誘導的金屬硫蛋白(MT)啟動子、地塞米松(Dex)-誘導的小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)啟動子、T7聚合酶啟動子系統[國際專利公開號WO 98/10088]、蛻皮素昆蟲啟動子[No 等人，Proc. Natl. Acad. Sc1.美國，93 :3346-3351 (1996)]、四環素阻抑系統[Gossen 等人，Proc. Natl. Acad. Sc1.美國，89 :5547-5551 (1992)]、四環素誘導系統[Gossen 等人，Science, 268 :1766-1769 (1996),也參見 Harvey 等人，Curr. Opin. Chem. Biol.，2 :512-518 (1998)]、RU486-誘導系統[Wang 等人，Nat. Biotech.，15 :239-243(1997) 與Wang等人，Gene Ther.，4 :432-441 (1997)]和雷帕霉素-誘導系統[Magari等人， J. Clin.1nvest. ,100 :2856-2872 (1997)]。可用于本發明的其他誘導型啟動子類型是由特定的生理狀態調節的那些，所述狀態例如溫度、急性期、細胞的特定分化狀態，或僅在正在復制的細胞中起效。
在另一個實施方案中使用了轉基因的天然啟動子。當需要轉基因的表達模擬天然表達時，可優選天然啟動子。當轉基因的表達必須暫時性或發展性方式調節、或以組織特異性的方式調節或響應特定的轉錄刺激時，可使用天然啟動子。在另外的實施方案中，也可使用其他天然表達控制元件，例如增強子元件、聚腺苷酸化位點或Kozak共有序列以模擬天然表達。
轉基因的另一實施方案包含操作性連接于組織特異性啟動子的基因。例如，如果需要在骨骼肌中表達，應該使用在肌肉中有活性的啟動子。這包括編碼以下產物的基因的啟動子骨骼β_肌動蛋白、肌球蛋白輕鏈2A、抗肌萎縮蛋白、肌肉肌酸激酶以及活性高于天然啟動子的合成肌肉啟動子(參見=Li等人，Nat. Biotech. , 17 :241-245 (1999))。 已知的組織特異性啟動子的實例有肝特異性的(白蛋白，Miyatake等人，J. Virol. ,71 5124-32(1997);乙肝病毒核心啟動子，Sandig 等人，Gene Ther.，3 :1002-9 (1996) :α-胎蛋白(AFP), Arbuthnot 等人，Hum. GeneTher. , 7 :1503-14 (1996))、骨的骨I丐蛋白(Stein 等人，Mol. Biol. Rep. , 24 185-96 (1997));骨唾液蛋白(Chen 等人，J. Bone Miner. Res. , 11 654-64(1996))、淋巴細胞特異性的(CD2, Hansal 等人，J.1mmunol. 161 :1063-8(1998);免疫球蛋白重鏈；T細胞受體鏈)、神經元特異性的(例如神經元-特異性烯醇酶(NSE)啟動子(Anders·en 等人,Cell. Mol. Neurobiol. ,13 :503-15 (1993))、神經絲輕鏈基因(Piccioli 等人，Proc. Natl. Acad. Sc1.，美國，88 :5611-5 (1991))，以及神經元-特異性 vgf 基因 (Piccioli 等人，Neuron, 15 :373-84(1995)))等。
任選地，攜帶有治療用途的轉基因的質粒還可含有可選擇標記基因或報道基因， 例如編碼遺傳霉素抗性、潮霉素抗性或嘌呤霉素(purimycin)抗性等的序列。這種可選擇的報道基因或標記基因(優選位于有待本發明方法拯救的病毒基因組之外)，例如氨芐青霉素抗性，可用來指示細菌細胞中存在質粒。質粒的其他成分可包括復制起點。可通過常規方法選擇這些和其他啟動子與載體元件，許多這種序列可獲得[參見，例如Sambrook等人，以及本文引用的參考文獻]。
為援引方便，轉基因、啟動子/增強子與5'和3' AAV ITR的組合在此稱為“小基因”。鑒于本發明的教導，憑借常規技術即可設計這種小基因。
3.將小基因遞送至包裝宿主細胞
可用任何遞送至宿主細胞的適當載體例如質粒來攜帶小基因。用于本發明的質粒可改造為適合于在原核細胞、哺乳動物細胞或這二種細胞中復制和整合(任選)的質粒。這些質粒(或其他攜帶5' AAV ITR-異源分子-3' AAV ITR的載體)含有允許小基因在真核細胞和/或原核細胞中復制的序列和用于這些系統的選擇標記。可選擇標記基因或報道基因可包括編碼遺傳霉素抗性、潮霉素抗性或嘌呤霉素抗性等的序列。這些質粒還可含有可用來指示細菌細胞中存在載體的某些可選擇報道基因或標記基因，例如氨芐青霉素抗性。質粒的其他成分可包括復制起點和擴增子，例如使用Epstein Barr病毒核抗原的擴增子系統。該擴增子系統或其他類似的擴增子成分允許細胞中高拷貝附加型復制。攜帶小基因的分子優選轉染入其可暫時存在的細胞中。或者，小基因(攜帶5' AAV ITR-異源分子-3' AAV ITR)可穩定地整合進宿主細胞的基因組，或進入染色體或作為附加體。在某些實施方案中，小基因可以任選地以頭-對-頭、頭-對-尾或尾-對-尾的多聯體形式多拷貝存在。合適的轉染技術是已知的，并可容易地用于將小基因遞送至宿主細胞。
通常，當通過轉染遞送含有小基因的載體時，通常將約5 μ g- οο μ g DNA、約10μ g-50 μ g DNA遞送約I X IO4-1 X IO13個細胞或約I X IO5個細胞。然而，考慮到諸如所選擇的載體、遞送方法和所選擇的宿主細胞等因素，本領域技術人員可調整載體DNA量與宿主細胞之比。
B. Rep 與 Cap 序列
除了小基因以外，宿主細胞還含有在宿主細胞中驅動本發明的新AAV衣殼蛋白 (或含有其片段的衣殼蛋白)表達的序列和與小基因中的AAV ITR相同來源或來自交叉互補來源的rep序列。AAV cap和rep 序列可彼此獨立地由前述AAV源獲得,并可以前述本領域人員已知的任何方式引入宿主細胞。此外，在進行AAV載體假型包裝時，可用不同的AAV 來源(例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9)提供編碼各種主要 r印蛋白的序列。例如rep78/ 68序列得自AAV2，而rep52/40序列得自AAV8。
在一個實施方案中，宿主細胞穩定地含有在合適的啟動子(例如前文所述)控制下的衣殼蛋白。在該實施方案中，衣殼蛋白最好在誘導型啟動子的控制下表達。在另一個實施方案中，衣殼蛋白以轉入方式(in trans)提供至宿主細胞。當以轉入方式遞送至宿主細胞時，衣殼蛋白可通過含有指導選定衣殼蛋白在宿主細胞中表達所需序列的質粒遞送。當以轉入方式遞送至宿主細胞時，攜帶衣殼蛋白的質粒最好還攜帶包裝rAAV所需的其他序列，例如rep序列。
在另一個實施方案中，宿主細胞穩定地含有在合適的啟動子(如前文所述)控制下的rep序列。在該實施方案中，主要rep蛋白最好在誘導型啟動子的控制下表達。在另一個實施方案中，rep蛋白以轉入方式(in trans)提供至宿主細胞。當以轉入方式遞送至宿主細胞時，rep蛋白可通過含有指導選定的rep蛋白在宿主細胞中表達所需序列的質粒遞送。當以轉入方式遞送至宿主細胞時，攜帶衣殼蛋白的質粒也最好攜帶包裝rAAV所需的其他序列，例如rep和cap序列。
因此，在一個實施方案中，rep和cap序列可以位于一個核酸分子上轉染入宿主細胞，并且作為附加體穩定地存在于細胞中。在另一個實施方案中，rep和cap序列穩定地整合進細胞的染色體。在另一個實施方案中，rep和cap序列在宿主細胞中瞬時表達。例如， 用于這種轉染的有用核酸分子從5’到3’含有啟動子、插在啟動子與rep基因序列起始位點之間可選的間隔子、AAV rep基因序列和AAV cap基因序列。
任選地，和/或cap序列可提供于載體上，該載體含有待引入宿主細胞的其他DNA序列。例如載體可含有包含小基因的rAAV構建體。載體可含有一個或多個編碼輔助因子功能例如腺病毒蛋白El、E2a和E4 0RF6的基因與VAI RNA的基因。
用于該構建體的啟動子優選本領域技術人員已知的或前文所述的特征組成型、誘導型或天然啟動子。在一個實施方案中，使用AAV P5啟動子序列。選擇AAV來提供這些序列不是對本發明的限制。
在另一個優選的實施方案中，rep的啟動子是誘導型啟動子，例如前文就轉基因調節元件所述的那些。R印表達的優選的啟動子之一是T7啟動子。用包含由T7啟動子調節的rep基因和cap基因的載體轉染或轉化組成性或誘導性表達T7聚合酶的細胞。參見1998 年3月12日公開的國際專利公開號WO 98/10088。
在設計載體中，間隔子是可選元件。間隔子是插在啟動子和rep基因的ATG起始位點間的DNA序列。間隔子可具有任何所需的設計；即，它可是隨機的核苷酸序列，或者可編碼一個基因產物，例如標記基因。間隔子可含有通常包括起始/終止和PolyA位點的基因。間隔子可以是來自原核生物或真核生物的非編碼DNA序列、重復非編碼序列、無轉錄控制的編碼序列或有轉錄控制的編碼序列。間隔子序列的兩個典型來源是噬菌體梯序列或酵母梯序列，二者可購自例如Gibco或Invitrogen等。間隔子可是任何大小的,只要足以降低rep78和r印68基因產物的表達，使rep52、rep40和cap基因產物的表達處于正常水平。 因此，間隔子的長度范圍約為IObp-1O. Okbp，優選約100bp-8. Okbp0為減少重組的可能性， 間隔子長度優選小于2kbp ;然而，本發明不限于此。
雖然提供r印和cap的分子可能瞬時(即通過轉染)存在于宿主細胞中，但優選 rep和cap蛋白之一或二者與控制其表達的啟動子在宿主細胞中穩定地表達，例如作為附加體或通過整合進宿主細胞染色體。用于構建本發明這方面內容的實施方案的方法是常規遺傳工程或重組工程技術，例如前文參考文獻所述的技術。雖然本說明書提供了具體的構建體的說明性實例，但本領域技術人員可使用本文提供的信息來選擇間隔子、P5啟動子和其他元件(包括至少一個翻譯起始和終止信號)和任選加入的聚腺苷酸化位點，從而可選擇和設計其他合適的構建體。
在本發明的另一個實施方案中，可由宿主細胞穩定地提供rep或cap蛋白。
C.輔助因子功能
為包裝本發明的rAAV，包裝宿主細胞還需要輔助因子功能。任選地，這些功能可由皰疹病毒提供。所需的輔助功能物最好分別由人或非人靈長類腺病毒源提供，例如前文所述的和/或得自各種來源的(包括美國典型培養物保藏中心(ATCC)，Manassas, VA(美國))。在一個目前優選的實施方案中，向宿主細胞提供和/或宿主細胞含有Ela基因產物、 Elb基因產物、E2a基因產物和/或E4 0RF6基因產物。宿主細胞可含有其他腺病毒基因， 例如VAI RNA，但這些基因不是必需的。在優選的實施方案中，宿主細胞中不存在其他腺病毒基因或基因功能。
“表達Ela基因產物的腺病毒DNA”表示編碼Ela或其功能性部分的各種腺病毒序列。表達E2a基因產物的腺病毒DNA和表達E4 0RF6基因產物的腺病毒DNA的定義類似。 腺病毒基因或其功能部分的各等位基因或其他修飾形式也包括在內。所述修飾既包括借助常規遺傳工程或誘變技術特地引入從而以某種方式增強腺病毒功能的那些，也包括天然存在的等位變體。這些用來通過DNA操作獲得腺病毒基因功能的修飾和方法是本領域技術人員已知的。
腺病毒Ela、Elb、E2a和/或E4 0RF6基因產物以及各種其他需要的輔助因子功能可使用各種使其在細胞中表達的方法提供。各條編碼這些產物的序列可各自位于單獨的載體上，或者一個或多個基因可位于同一載體上。載體可以是本領域已知的或前文所述的各種載體，包括質粒、粘粒和病毒。載體可通過本領域已知或前文所述的各種方法引入宿主細胞，所述方法包括轉染、感染、電穿孔、脂質體遞送、膜融合技術、高速DNA-包被小球、病毒感染與原生質體融合等。一個或多個腺病毒基因可穩定地整合入宿主細胞基因組，作為附加體穩定表達，或者瞬時表達。基因產物可全部瞬時表達，包含在附加體上或穩定整合；或者，一些基因產物可穩定地表達，而另一些瞬時表達。此外，各腺病毒基因的啟動子可彼此獨立地選自組成型啟動子、誘導型啟動子或天然腺病毒啟動子。啟動子可由生物體或細胞的特定生理狀態調節(即，分化狀態或復制或靜息細胞)或由其他方法例如外源添加因子調節。
D.宿主細胞和包裝細胞系
宿主細胞本身可選自各種生物體，包括原核(例如細菌)細胞和真核細胞，包括昆蟲細胞、酵母細胞和哺乳動物細胞。特別理想的宿主細胞選自特征哺乳動物種類，包括， 不限于以下細胞A549、WEH1、3T3、10T1/2、BHK、MDCK、C0S1、C0S7、BSC1、BSC40、BMT10、VER0、 W138、HeLa,293細胞(表達功能性腺病毒El)、Saos, C2C12、L細胞、HT1080、H印G2和來源于哺乳動物(包括人、猴、小鼠、大鼠、兔子和倉鼠)的初級成纖維細胞、肝細胞和成肌細胞。 選擇細胞的哺乳動物來源和哺乳動物細胞的類型(即成纖維細胞、肝細胞、腫瘤細胞等)不限制本發明。對所使用細胞的要求是它不攜帶任何除El、E2a和/或E4 0RF6以外的腺病毒基因；它不含有在rAAV產生過程中可導致污染病毒的同源重組的任何其他病毒基因；并且，它能被DNA感染或轉染并表達所轉染的DNA。在優選的實施方案中，宿主細胞是在包含穩定轉染的rep和cap的細胞。
用于本發明的宿主細胞之一是用編碼rep和cap的序列穩定轉化，并用腺病毒El、 E2a和E4 0RF6 DNA 和攜帶有前文所述小基因的構建體轉染的宿主細胞。也可類似地使用穩定的和/或cap表達細胞系，例如B-50 (國際專利申請公開號WO 99/15685)，或美國專利號5，658，785所述的細胞系。另一種理想的宿主細胞含有表達E4 0RF6所需的基本腺病毒DNA。使用本發明的新經單現突變校正的AAV cap序列還可構建出其他細胞系。
本發明制備宿主細胞涉及諸如裝配選定的DNA序列等技術。可使用常規技術實現這種裝配。這種技術包括公知的且描述于前文引用的Sambrook等人的著作中的cDNA和基因組克隆、使用腺病毒和AAV基因組的重疊寡核苷酸序列，結合聚合酶鏈式反應、合成方法以及提供所需核苷酸序列的其他合適方法。
也可使用技術人員已知和本說明書中討論的技術將這些分子(如質粒或病毒)引入宿主細胞。在優選的實施方案中，使用標準轉染技術，例如CaP04轉染或電穿孔，和/或用雜交腺病毒/AAV載體感染細胞系，所述細胞系例如人胚胎腎細胞系HEK293 ( 一種人腎細胞系，含功能性腺病毒El基因，該基因提供反式作用的El蛋白)。
本領域技術人員易于理解的是，本發明的新AAV序列可容易地經調整而適用在上述及其他表達載體系統中用于體外、離體或體內的基因遞送。類似地，本領域技術人員可容易地選擇本發明的其他AAV基因組片段用于各種rAAV和非rAAV載體系統。這些載體系統包括例如慢病毒、逆轉錄病毒、痘病毒、牛痘病毒和腺病毒系統等。這些載體系統的選擇不限制本發明。
因此，本發明進一步提供了使用本發明的新AAV的核酸與氨基酸序列產生的載體。這種載體可用于多種目的，包括遞送治療性分子和用在疫苗給藥方案(vaccine regimens)中。含有本發明的新AAV衣殼的重組AAV對遞送治療性分子特別理想。含有本發明的新AAV序列的這些或其他載體構建體可用于疫苗給藥方案，例如用于共同遞送細胞因子，或用于遞送免疫原本身。
IV.重組病毒及其應用
本領域技術人員可使用本文所述的技術來產生rAAV，該rAAV具有本發明AAV的衣殼或其衣殼含有本發明AAV的一個或多個片段。在一個實施方案中，使用來自經單現突變校正的AAV的全長衣殼。
A.病毒的遞送
另一方面，本發明提供了一種將轉基因遞送至宿主的方法，該方法涉及利用本發明經單現突變校正的AAV(或其功能性片段)產生的重組病毒載體轉染或感染所選宿主細胞。用于遞送的方法是本領域技術人員公知的，并不限制本發明。
在一個理想的實施方案中，本發明提供了一種用于AAV-介導遞送轉基因至宿主的方法。該方法涉及利用含有所選轉基因和修正衣殼蛋白的重組病毒載體轉染或感染所選宿主細胞，該轉基因在指導其表達的序列的控制下 。
任選地，來自宿主的樣品可首先測定其是否含有所選AAV源(例如某血清型) 的抗體。用于檢測中和抗體的各種測定方式已為本領域技術人員所熟知。這種測定的選擇不限制本發明。參見，例如Fisher等人，Nature Med. ,3(3) :306-312 (1997年3月)和 ff. C. Manning 等人，Human Gene Therapy, 9 :477-485(1998 年 3 月 I 日)。該測定的結果， 例如沒有某衣殼來源的特異性中和抗體，可用于確定哪種含有特定來源的衣殼蛋白的AAV 載體是遞送所優選的。
該方法的一方面，可在遞送具有本發明AAV衣殼蛋白的載體之前或之后遞送具有另一不同AAV衣殼蛋白的載體。因此，通過rAAV載體的基因遞送可用于重復地將基因遞送至所選定的宿主細胞中。理想地，在后給予的rAAV載體攜帶與第一 rAAV載體中相同的轉基因，但在后給予的載體含有的衣殼蛋白的來源不同于第一載體(并且優選不同的血清型)。例如如果第一載體具有經單現突變校正的衣殼蛋白，在后給予的載體可具有選自其他AAV的衣殼蛋白，例如可以是另一血清型或另一分化體的AAV。
任選地，多個rAAV載體可通過共同給予多個rAAV載體用于遞送大的轉基因或多個轉基因，在體內多聯化成單個載體基因組。在這種實施方案中，第一AAV可攜帶表達單個轉基因(或其亞基)的表達盒，第二AAV可攜帶在宿主細胞中共表達的表達第二轉基因(或不同亞基)的表達盒。第一 AAV可攜帶多順反子構建體的第一部分(例如啟動子和轉基因，或亞基)的表達盒，第二 AAV可攜帶多順反子構建體的第二部分(例如轉基因或亞基和polyA序列)的表達盒。多順反子構建體的這兩個部分在體內多聯化成共表達由第一和第二 AAV遞送的轉基因的單個載體基因組。在這種實施方案中，攜帶第一表達盒的rAAV載體和攜帶第二表達盒的rAAV載體可以包含在單個藥物組合物中來遞送。在其他實施方案中，兩個或多個rAAV載體以分開的藥物組合物來遞送，這些藥物組合物可基本上同時給藥或略有先后。
上述重組載體可按照公開的方法遞送至宿主細胞中。可將rAAV，優選懸浮在生理相容載體中的rAAV，給予人或非人哺乳動物患者。本領域技術人員可依據病毒遞送所針對的適應癥容易地選擇適當的載體。例如，適當的載體包括可用各種緩沖液配制的鹽水(例如磷酸緩沖鹽水)。其他的載體例子包括無菌鹽水、乳糖、蔗糖、磷酸鈣、明膠、葡萄糖、瓊脂、果膠、花生油、芝麻油和水。載體的選擇不限制本發明。
任選地，除rAAV和載體以外，本發明的組合物還可含有其他常規藥物組分，例如防腐劑或化學穩定劑。適當的防腐劑例如氯代丁醇、山梨酸鉀、山梨酸、二氧化硫、沒食子酸丙酯、對羥基苯甲酸酯類、乙基香草醛、甘油、苯酚與對氯苯酚。適當的化學穩定劑包括明膠和白蛋白。
載體的給予量應滿足轉染細胞所需并應提供足夠的基因傳送和表達水平以提供療效而無副作用，或有醫學上可接受的生理作用，這可由醫學領域技術人員確定。常規的和藥學上可接受的給藥途徑包括但不限于直接遞送至目標器官(例如，肝(任選經肝動脈) 或肺)、口服、吸入、鼻內、氣管內、動脈內、眼內、靜脈內、肌肉內、皮下、真皮內和其他胃腸外給藥途徑。如果需要，可多種給藥途徑聯用。
病毒載體的劑量主要取決于以下因素，例如治療的病癥、患者的年齡、體重和健康狀況，因此可依患者而改變。例如，病毒載體的人用治療有效劑量一般約為含有濃度約 I X IO9-1 X IO16個基因組病毒載體的O.1mL-1OOmL溶液。遞送至大器官(例如肝、肌肉、心臟和肺)的優選的人用劑量可約為5X 101C1-5X IO13個AAV基因組/kg，體積約為1-lOOmL。 遞送至眼的優選劑量約為5X109-5X1012份基因組拷貝，體積約為O.1mL-1mL0可調整劑量以平衡副作用和療效，并且這種劑量可根據重組載體的具體治療性用途而改變。可監測轉基因的表達水平來確定給藥頻率，以獲得病毒載體，優選含有小基因的AAV載體。任選地， 可按照類似于就治療性目所述的給藥方案用本發明的組合物來免疫接種。
后文提供了用本發明的含AAV載體進行遞送的治療性產物和免疫原性產物的實例。這些載體可用于本文所述的各種治療性或接種方案。此外，按照治療性和/或接種方案所需，這些載體可聯合一種或多種其他載體或活性成分用于遞送。
B.治療性轉基因
轉基因編碼的有用的治療性產物包括激素與生長因子和分化因子，包括但不限于胰島素、胰高血糖素、生長激素(GH)、甲狀旁腺激素(PTH)、生長激素釋放因子(GRF)JP 泡刺激素(FSH)、黃體激素(LH)、人絨毛膜促性腺激素(hCG)、血管內皮生長因子(VEGF)、 促血管生成素、血管抑制素、粒細胞集落刺激因子(GCSF)、促紅細胞生產素(EPO)、結締組織生長因子(CTGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、酸性成纖維細胞生長因子(aFGF)、 表皮生長因子(EGF)、血小板衍生的生長因子(TOGF)、胰島素生長因子I和IUIGF-1和 IGF-1I)、轉化生長因子α超家族中的任一個(包括TGFa、活化素、抑制素)、或骨形態發生蛋白(ΒΜΡ)ΒΜΡ1-15中的任一個、生長因子中的調蛋白/神經調節蛋白/ARIA/neu分化因子(NDF)家族的任一個、神經生長因子(NGF)、腦源性神經營養因子(BDNF)、神經營養蛋白NT-3和NT-4/5、睫狀神經營養因子(CNTF)、膠質細胞系衍生神經營養因子(⑶NF)、 neurturin、聚集蛋白、腦信號蛋白/瓦解蛋白家族的任一個、導蛋白_1和導蛋白_2、肝細胞生長因子(HGF)、肝配蛋白、頭蛋白、sonic hedgehog蛋白和酪氨酸輕化酶。
其他有用的轉基因產物包括調節免疫系統的蛋白質，包括但不限于細胞因子和淋巴因子，例如血小板生成素(TPO)、白介素(IL)IL-1到IL-25(包括，例如IL_2、IL-4、 IL-12和IL-18)、單核細胞化學誘導蛋白、白血病抑制因子、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子、Fas配體、腫瘤壞死因子α和β、干擾素α、β和Y、干細胞因子、flk_2/flt3配體。 免疫系統產生的基因產物也可用于本發明。這些產物包括但不限于免疫球蛋白IgG、IgM、 IgA、IgD和IgE、嵌合免疫球蛋白、人源化抗體、單鏈抗體、T細胞受體、嵌合T細胞受體、單鏈T細胞受體、I類和II類MHC分子，以及經改造的免疫球蛋白和MHC分子。有用的基因產物還包括補體調節蛋白質，例如補體調節蛋白、膜輔因子蛋白(MCP)、衰變加速因子(DAF)、 CR1、CF2 和 CD59
其他有用的基因產物包括激素受體、生長因子、細胞因子、淋巴因子、調節蛋白質和免疫系統蛋白質的任一種。本發明包括膽固醇調節和/或脂質調節的受體，包括低密度脂蛋白(LDL)受體、高密度脂蛋白(HDL)受體、極低密度脂蛋白(VLDL)受體和清除受體。 本發明也包括以下基因產物例如類固醇激素受體超家族的成員，包括糖皮質激素受體和雌激素受體、維生素D受體和其他核受體。此外，有用的基因產物包括轉錄因子，例如jun、 fos、max、mad、血清效應因子(SRF)、AP_1、AP2、myb、MyoD和肌細胞生成蛋白、含有蛋白質的 ETS-盒、TFE3、E2F、ATFl、ATF2、ATF3、ATF4、ZF5、NFAT、CREB、HNF-4、C/EBP、SP1、CCAAT-盒結合蛋白、干擾素調節因子(IRF-1)、Wilms腫瘤蛋白、ETS-結合蛋白、STAT、GATA-盒結合蛋白，例如GATA-3和翼狀螺旋蛋白的叉頭蛋白家族。
其他有用的基因產物包括氨甲酰合成酶1、鳥氨酸轉氨甲酰酶、精氨基琥珀酸合成酶、精氨基琥珀酸裂合酶、精氨酸酶、延胡索酰乙酰乙酸水解酶、苯丙氨酸羥化酶、α-1 抗胰蛋白酶、葡萄糖-6-磷酸酶、膽色素原脫氨酶、胱硫醚合成酶、支鏈酮酸脫羧酶、白蛋白、異戊酰-CoA脫氫酶、丙酰-CoA羧化酶、甲基丙二酰CoA變位酶、戊二酰-CoA脫氫酶、胰島素、β -葡糖苷酶、丙酮酸羧酸鹽、肝磷酸化酶、磷酸化酶激酶、甘氨酸脫羧酶、H-蛋白、T-蛋白、囊性纖維化跨膜傳導調節蛋白(CFTR)序列和抗肌萎縮蛋白基因產物[例如 小-或微-抗肌萎縮蛋白]。其他有用的基因產物包括可 用于酶活性缺乏所導致的各種病癥例如可用于酶替代治療的酶。例如，含有甘露糖-6-磷酸的酶可用于治療溶菌酶儲存疾病(例如編碼β -葡糖醛酸糖苷酶(GUSB)的基因)。
其他有用的基因產物包括用于治療血友病的產物，包括B型血友病(包括因子 IX)和A型血友病(包括因子VIII及其變體，例如異二聚體的輕鏈和重鏈和B-缺失結構域；美國專利號6，200, 560和美國專利號6，221，349)。因子VIII基因編碼2351個氨基酸，該蛋白具有六個結構域，從氨基向羧基端依次指定為Al-A2-B-A3-Cl-C2[Wood等人， Nature, 312 :330 (1984) ；Vehar 等人，Nature, 312 :337 (1984)；以及 Toole 等人，Nature, 342 :337 (1984)]。人因子VIII在細胞內經加工產生主要含有重鏈和輕鏈的異二聚體，所述重鏈含有Al、A2和B結構域，所述輕鏈含有A3、Cl和C2結構域。單鏈多肽與異二聚體作為無活性的前體在血漿中循環，直至在A2和B結構域之間被凝血酶切割而激活，由此釋放出B結構域并形成由Al和A2結構域組成的重鏈。該蛋白質激活的前凝血質形式不含B結構域。此外，在天然蛋白中，B結構域之側的兩條多肽鏈(“a”和“b”)與二價鈣陽離子結入口 ο
在一些實施方案中，小基因含有編碼10個氨基酸信號序列的因子VIII重鏈的前57個堿基對和人生長激素(hGH)聚腺苷酸化序列。在另一實施方案中，小基因進一步含有Al和A2結構域，以及B結構域N-末端的5個氨基酸，和/或B結構域C-末端的85個氨基酸，以及A3、Cl和C2結構域。在另外的實施方案中，編碼因子VIII重鏈和輕鏈的核酸被編碼B結構域的14個氨基酸的42個核酸隔開并包含在單個小基因中[美國專利號 6，200，560]。
本文使用的治療上的有效量指可產生足夠量的因子VIII以降低受試對象血液凝結所需時間的AAV載體的量。通常，因子VIII水平低于正常水平的1%的嚴重血友病患者的全血凝時間大于60分鐘，而非血友病患者約為10分鐘。
本發明不限于任何具體的因子VIII序列。已經分離和產生了許多因子VIII的天然和重組形式。因子VIII的天然形式和重組形式的實例見專利和科學文獻，包括美國專利號 5，563，045 ;5，451，521 ;5，422，260 ;5，004，803 ;4，757，006 ;5，661，008 ； 5，789，203 ； 5，681，746 ;5，595，886 ;5，045，455 ;5，668，108 ;5，633，150 ;5，693，499 ;5，587，310 ;5， 171,844 ;5，149,637 ;5，112,950 ;4，886，876 ;國際專利公開號 WO 94/11503, WO 87/07144， WO 92/16557, WO 91/09122, W097/03195, WO 96/21035 和 WO 91/07490 ;歐洲專利申請號 EP O 672 138，EP O 270 618，EP O 182 448，EP O 162 067，EP O 786 474，EP O 533 862，EP O 506 757，EP O 874 057，EP O 795 021，EP O 670 332，EP O 500 734 ；EP O 232 112 和 EP O 160 457 ;Sanberg等人，世界血友病聯合會第20屆國際會議(XXth Int. Congress of the World Fed. Of Hemophilia), (1992)和 Lind 等人，Eur. J. Biochem. , 232 :19 (1995)。
編碼上述因子VIII的核酸序列可使用重組方法獲得或從已知包含該序列的載體得到。此外，也可使用標準技術直接從含有該序列的細胞和組織中分離所需序列，所述標準技術例如酚提取與cDNA或基因組DNA的PCR[參見，例如=Sambrook等人]。除了克隆以外，核苷酸序列也可合成產生。可用標準方法制備重疊的寡核苷酸，從重疊的寡核苷酸裝配成完整的編碼序列中[參見，例如Edge, Nature, 292 :757 (1981) ;Nambar i等人，Science, 223 :1299(1984)和 Jay 等人，J. Biol. Chem.，259 :6311 (1984)]。
此外，本發明不限于人因子VIII。實際上，本發明意在包括來自除人以外的動物的因子VIII，所述動物包括但不限于寵物動物(例如狗、貓和馬)、牲畜(例如牛、山羊和綿羊)、實驗室動物、海生動物、大型貓科動物(large cat)等。
AAV載體可含有編碼因子VIII片段的核酸，該片段本身無生物活性，但當給予受試對象時則能改善或恢復血凝時間。例如，如前所述，因子VIII蛋白含有兩條多肽鏈由 B結構域隔開的重鏈和輕鏈，B結構域將在加工過程中被切除。如本發明所證明的，用因子 VIII的重鏈和輕鏈共轉導受體細胞導致生物活性因子VIII的表達。由于大多數血友病患者僅在一條鏈(例如重鏈或輕鏈)中含有突變或缺失，這就有可能僅給予患者有缺陷的那條鏈來與另一條鏈互補。
其他有用的基因產物包括非天然存在的多肽，例如具有非天然存在的氨基酸序列的嵌合或雜交多肽，所述非天然存在的氨基酸序列含有插入、缺失或氨基酸取代。例如，經單鏈改造的免疫球蛋白可用在某些免疫低下患者中。其他類型的非天然存在的基因序列包括反義分子和催化性核酸，例如核酶，可用于降低靶的過度表達。
降低和/或調節基因表達對治療以細胞過度增殖為特征的過度增殖性疾病，例如癌癥和銀屑病，尤其理想。靶多肽包括，與正常細胞相比，僅在過度增殖細胞中產生或在過度增殖細胞中以更高水平產生的多肽。靶抗原包括癌基因和易位基因編碼的多肽，所述癌基因編碼的多肽例如myb、myc、fyn,所述易位基因編碼的多肽如bcr/abl、ras、src、P53、 neu、trk和EGRF。除了作為靶抗原的癌基因產物，用于抗癌治療和保護性治療方案的靶多肽包括B細胞淋巴瘤產生的抗體的可變區和T細胞淋巴瘤的T細胞受體的可變區，在某些些實施方案中，它們也用作自身免疫疾病的靶抗原。其他腫瘤相關多肽也可用作靶多肽，例如在腫瘤細胞中處于較高水平的多肽，包括單克隆抗體17-1A所識別的多肽和葉酸結合多肽。
其他合適的治療性多肽和蛋白質包括通過賦予抗自身免疫相關靶的廣譜基礎保護性免疫應答來治療患自身免疫疾病和紊亂的個體的多肽和蛋白，所述自身免疫相關靶包括細胞受體和產生“自我”定向抗體的細胞。T細胞介導的自身免疫疾病包括類風濕性關節炎(RA)、多發性硬化癥(MS)、SjOgren氏綜合征、結節病、胰島素依賴型糖尿病(IDDM)、自身免疫甲狀腺炎、反應性關節炎、強直性脊柱炎、硬皮病、多肌炎、皮肌炎、銀屑病、脈管炎、 韋格納肉芽腫病、克羅恩病和潰瘍性結腸炎。這些疾病均以結合內源性抗原并引發自身免疫疾病相關炎性級聯反應的T細胞受體(TCR)為特征。
C.免疫原性轉基因
本發明的AAV載體以避免產生針對包含于載體的AAV序列的免疫應答為宜。然而， 這些載體配制成使得載體攜帶的轉基因得以表達從而誘導對選定抗原的免疫應答。例如， 為促進免疫應答，可由組成型啟動子控制轉基因的表達，如本文所述將載體與佐劑組合，和 /或可將載體引入退化組織中。
適當的免疫原性轉基因的實例可包括選自各種病毒科的免疫原性轉基因。需要免疫應答來抵御的病毒科的實例包括小RNA病毒科，其包括導致約50%普通感冒病例的鼻病毒屬；腸病毒屬，其包括脊 髓灰質炎病毒、柯薩奇病毒、艾柯病毒和人腸病毒(例如甲肝病毒)；以及口瘡病毒屬，其主要在非人動物中導致口蹄疫。在小RNA病毒科內，靶抗原包括VP1、VP2、VP3、VP4和VPG。其他病毒科包括星狀病毒和杯狀病毒科。杯狀病毒科包括視為流行性腸胃炎重要病因的諾瓦克組病毒。另一種有望用于靶抗原在人或非人動物中誘導免疫應答的病毒科是披膜病毒科，該科包括甲型病毒屬，該甲型病毒屬包括辛德畢斯病毒、 羅斯河病毒、和委內瑞拉、東部和西部馬腦炎病毒和風疹病毒屬，包括風疹病毒。黃病毒科包括登革熱、黃熱、日本腦炎、圣路易斯腦炎和蜱傳性腦炎病毒。其他靶抗原可從丙型肝炎或冠狀病毒科產生，其中包括許多非人病毒，例如感染性支氣管炎病毒(家禽)、豬傳染性胃腸病毒(豬)、豬凝血性腦脊髓炎病毒(豬)、貓感染性腹膜炎病毒(貓)、貓腸冠狀病毒 (貓)、狗冠狀病毒(狗)和可導致普通感冒和/或非-甲型、乙型或丙型肝炎的人呼吸冠狀病毒，該科病毒還可能是嚴重急性呼吸道綜合癥(SARS)的病因。在冠狀病毒科內，靶抗原包括El (也稱為M或基質蛋白)、E2 (也稱為S或刺蛋白)、E3 (也稱為HE或血凝素-依爾替糖)、糖蛋白(并非所有冠狀病毒中都有)或N(核衣殼)。他抗原還可以是針對動脈炎病毒科和彈狀病毒科的。彈狀病毒科包括水皰病毒屬(例如皰疹口炎病毒)和狂犬病病毒屬(例如狂犬病)。在彈狀病毒科內，適當的抗原可源于G蛋白或N蛋白。包括出血熱病毒例如馬爾堡和埃博拉病毒的絲狀病毒科可能是合適的抗原來源。副黏病毒科包括I 型副流感病毒、3型副流感病毒、3型牛副流感病毒、腮腺炎病毒(流行性腮腺炎病毒)、2型副流感病毒、4型副流感病毒、新城疫病毒(小雞)、牛瘟病毒、麻疹病毒(其包括麻疹和犬瘟熱)，以及肺病毒(其包括呼吸道合胞病毒)。流感病毒被分在正黏病毒科內，并且是抗原 (例如HA蛋白、NI蛋白)的合適來源。布尼亞病毒科包括布尼亞病毒屬(加利福尼亞腦炎，拉克羅斯腦炎)、白蛉熱病毒屬(裂谷熱)、漢坦病毒屬(普馬拉是hemahagin熱病毒)、 內羅畢病毒屬(內羅畢綿羊病)和各種未命名的銀環蛇病毒(bungaviruse)。沙粒病毒科提供抗LCM和拉沙熱病毒的抗原來源。抗原的另一來源是博內病毒科。呼腸孤病毒科包括呼腸孤病毒屬、輪狀病毒屬(其導致兒童急性腸胃炎)、環狀病毒屬和科羅拉多蜱熱病毒屬 (科羅拉多蝶熱病毒屬、Lebombo病毒屬(人)、馬變性腦病病毒屬、藍舌病病毒屬)。逆轉錄病毒科包括致腫瘤RNA病毒亞科，該亞科包括人和·獸醫疾病，例如貓白血病病毒、HTLVI 和HTLVI1、慢病毒亞科(包括HIV、猿免疫缺陷病毒、貓免疫缺陷病毒、犬感染性貧血病毒和泡沫病毒亞科)。
就HIV和SIV而言，已經描述了許多合適的抗原，并可以容易地選擇。合適的HIV 和SIV抗原的實例包括但不限于gag、pol、Vif、Vpx、VPR、Env、Tat和Rev蛋白，及其各種片段。例如，適當的被膜(env)蛋白的片段包括,例如gp41、gpl40和gpl20。另外，已經描述了對于這些及其他HIV和SIV抗原的各種修飾。用于該用途的合適抗原是本領域技術人員所知的。例如，可從其他蛋白中選擇編碼gag、pol、Vif以及Vpr、Env、Tat和Rev的序列。參見， 例如在美國專利5，972，596中描述了修飾的gag蛋白。同時參見，在D. H. Barouch等人， J. Virol.，75 (5) :2462-2467(2001 年 3 月)和 R.R. Amara 等人，Science, 292:69-74 (2001 年4月6日)中所描述的HIV和SIV蛋白。這些蛋白質或其亞基可經由多個載體或由單個載體單獨或組合遞送。
乳多空病毒科包括多瘤病毒亞科(BKU和J⑶病毒)和乳頭瘤病毒亞科(與癌癥或乳頭瘤的惡性進展有關)。腺病毒科包括導致呼吸疾病和/或腸炎的病毒(EX、AD7、ARD、 O. B.)。細小病毒科包括貓細小病毒(貓腸炎)、貓全白細胞減少病病毒、狗細小病毒和豬細小病毒科。皰疹病毒科包括皰疹病毒亞科，該亞科包括單純皰疹病毒屬(HSV1、HSVII)、 水痘病毒屬(假狂犬病、水痘帶狀皰疹)；以及β皰疹病毒亞科，該亞科包括巨細胞病毒屬 (HCMV，鼠巨細胞病毒屬)；和Y皰疹病毒亞科，該亞科包括淋巴潛伏病毒屬、EBV(伯基特淋巴瘤)、人皰疫病毒6A、6B和7、卡波西肉瘤相關皰疫病毒與彌猴皰疫病毒(B病毒)、傳染性鼻氣管炎病毒屬、馬雷克病病毒屬和細長病毒屬。痘病毒科包括脊椎動物痘病毒亞科， 包括正痘病毒屬(大天花(天花)和牛痘(牛痘))、副痘病毒屬、禽痘病毒屬、山羊痘病毒屬、兔痘病毒屬、豬痘病毒屬和昆蟲痘病毒亞科。嗜肝DNA病毒科包括乙肝病毒。可作為抗原的合適來源的一種未歸類病毒是肝炎S病毒、戊肝病毒和朊病毒。另一種作為抗原來源的病毒是Nipan病毒。其他的病毒來源包括鳥感染性粘液囊病病毒和豬呼吸和生殖綜合征病毒。甲型病毒科包括馬動脈炎病毒和各種腦炎病毒。
本發明還包括用于免疫人或非人動物抗其他病原體的免疫原，所述病原體包括感染人和非人脊椎動物的細菌、真菌、寄生微生物或多細胞寄生蟲，或來自癌細胞或腫瘤細胞的病原體。細菌病原體的實例包括致病性革蘭氏陽性球菌，其包括肺炎球菌、葡萄球菌(及其產生的毒素，例如腸毒素B)和鏈球菌。致病性革蘭氏陰性球菌包括腦膜炎球菌、淋球菌。致病性腸革蘭氏陰性桿菌包括腸桿菌科；假單胞菌屬、不動桿菌屬和埃肯菌屬；類鼻疽假單孢菌屬；沙門氏菌屬；志賀氏菌屬；嗜血桿菌屬莫拉氏菌屬；杜克雷嗜血桿菌(H. ducreyi)(其導致軟下疳)；布魯桿菌(布魯桿菌病)；野兔熱弗朗西絲菌(Franisella tularensis)(其導致兔熱病)；鼠疫耶爾森菌(鼠疫)和其他耶爾森菌屬 (巴斯德菌屬);念珠狀鏈桿菌和螺菌屬；革蘭氏陽性桿菌，其包括單核細胞增多李斯特菌； 紅斑丹毒絲菌；白喉棒狀桿菌(Corynebacterium diphtheria)(白喉)；霍亂；炭疽桿菌 (B. anthracis)(炭疽)；多諾萬病(腹股溝肉芽腫)和巴爾通體病。致病性厭氧細菌導致的疾病包括破傷風；肉毒中毒(肉毒梭菌(Clostridum botulimum)及其毒素)；產氣莢膜梭菌(Clostridium perfringen)及其ε毒素；其他梭菌屬；結核病；麻風和其他分枝桿菌屬。致病性螺旋體疾病包括梅毒；密螺旋體病雅司病、品他病和地方性梅毒；以及鉤端螺旋體病。較高致病性細菌和致病性真菌導致的其他感染包括鼻疽(鼻疽伯克霍爾德氏菌(Burkholderia mallei);放線菌病；諾卡菌病；隱球菌病、芽生菌病、組織胞漿菌病和球孢子菌病；念珠菌病、曲霉病和毛霉病；孢子絲菌病；副球孢子菌病、石樣真菌病、球擬酵母病、足分枝菌病和著色真菌病；以及皮真菌病。立克次體感染包括斑疹傷寒熱、落磯山斑疹熱、Q熱(伯內特科克斯立克次體(Coxiella burnetti))和立克次氏體痘。支原體和衣原體感染的實例包括支原體肺炎、性病性淋巴肉芽腫、鸚鵡熱和圍產期衣原體感染。致病性真核細胞包括致病性原生動物和蠕蟲，并且由其產生的感染包括阿米巴病、瘧疾、利什曼病、 錐蟲病、弓形體病、卡氏肺囊蟲(Pneumocystis carinii)、Trichans、鼠弓形體(Toxoplasma gondii)、巴貝蟲病、賈第蟲病、旋毛蟲病、絲蟲病、血吸蟲病、線蟲、吸蟲(trematode)或吸蟲(fluke)感染和絳蟲(絳蟲)感染。
這些生物體和/或其產生的毒素中有許多已被疾病控制中心[(⑶C)，健康與人類服務部(Department of Heath and Human Services),美國]認定為是可用于生物攻擊的物質。例如，某些此類生物物質包括 目前分類為A類物質的炭疽桿菌(Bacillus anthracis)(炭疽)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)及其毒素(肉毒桿菌毒素)、鼠疫耶爾森菌(Yersinia pestis)(鼠疫)、大天花(天花)、野兔熱弗朗西絲菌(Franisella tularensis)(兔熱病)和病毒性出血熱[絲狀病毒(例如埃博拉病毒、馬爾堡病毒) 和沙粒病毒[例如拉沙病毒、馬丘博病毒];目前分類為B類物質的伯內特科克斯立克次體(Coxiella burnetti) (Q熱)、布魯桿菌(布魯桿菌病)、鼻疽伯克霍爾德氏菌 (Burkholderia mallei)(鼻疽)、假鼻疽伯克霍爾德氏菌(Burkholderia pseudomallei) (類鼻疽)、蓖麻(Ricinus communis)及其毒素(蓖麻蛋白毒素)、產氣莢膜梭菌 (Clostridium perfringen)及其毒素(ε 毒素)、葡萄球菌(Staphylococcus)及其毒素 (腸毒素B)、鶴踏熱衣原體(Chlamydia psittaci)(鶴踏熱)、水上安全威脅(water safety threat)(例如霍亂弧菌(Vibrio cholerae)、小隱孢子蟲(Cryptosporidium parvum)、斑疫傷寒熱(普氏立克次體(Richettsia powazekii)和病毒性腦炎(甲型病毒，例如委內瑞拉馬腦炎、東部馬腦炎、西部馬腦炎)；以及目前分類為C類物質的Nipan病毒和漢坦病毒。此外，其他如此分類或不同分類的生物體也可能在將來可被鑒定和/或用于這種目的。 容易理解的是，本文所述的病毒載體和其他構建體可用于傳遞來自這些生物體的抗原、病毒、其毒素或其他副產物，這可預防和/或治療這些生物物質引起的感染或其他不良反應。
施用本發明的載體來遞送抗T細胞可變區的免疫原引發包括CTL在內的免疫應答來消除T細胞。在類風濕性關節炎(RA)中，己鑒定了參與該疾病的數種特定TCR可變區。這些TCR包括V-3、V-14、V-17和V-17。因此，遞送編碼這些多肽中至少一種的核酸序列將引發以參與RA的T細胞為目標的免疫應答。在多發性硬化癥(MS)中，已鑒定了參與該疾病的數種特定TCR可變區。這些TCR包括V-7和V-1O。因此，遞送編碼這些多肽中至少一種的核酸序列將引發以參與MS的T細胞為目標的免疫應答。在硬皮病中，已鑒定了參與該疾病的數種特定TCR可變區。這些TCR包括V-6、V-8、V-14和V_16、V_3C、V_7、V-14、 V-15、V-16、V-28和V-12。因此，遞送編碼這些多肽中至少一種的核酸分子將引發以參與硬皮病的T細胞為目標的免疫應答。因此，本發明的rAAV衍生的重組病毒載體提供了一種有效的基因轉送載體，它們能在體內或體外將選定轉基因遞送至選定宿主細胞中，既使該生物體具有針對一種或多種 AAV源的中和抗體。在一個實施方案中，rAAV與細胞體外混合，使用常規方法培養被感染的細胞，并將被轉導細胞回輸給患者。
這些組合物尤其適用于治療目的和免疫接種目的的基因遞送，所述免疫接種包括誘導保護性免疫。本發明的AAV和包含本發明的AAV的組合物還可以用于免疫療法，例如在為本申請申請人所共有的、2004年4月28日遞交的“致免疫分子的連續的腺病毒和AAV 介導的傳遞”的美國專利申請號60/565，936。
此外，本發明的組合物也可用于體外生產所需基因產物。就體外生產而言，可如下獲得所需產物(例如蛋白質)用含有編碼所需產物的分子的rAAV轉染宿主細胞，并在允許表達的條件下培養細胞培養物，然后從培養物中獲得所需產物。然后，可視需要純化和分離該表達產物。合適的轉染、細胞培養、純化和分離技術是本領域技術人員已知的。
以下實施例闡述了本發明的幾個方面與實施方案。
實施例1
根據本發明的方法，將AAV序列與包含分化體A、B、C、D、E和F(由AAV9代表)各自代表性序列的文庫比對時，確定了其具有單現突變。下列表格顯示了有待改變為保守序列的衣殼序列和單現突變。為表示某些突變，單現突變后面有*，再后面是用于取代它的氨基酸殘基。為表示其他有些突變，單現突變后面是其氨基酸位置和用來取代它的殘基。
氨基酸編號是基于這些AAV衣殼各自的已公開序列。參見，例如G.Gao等人， J. Virol.，78 (12) :6381-6388 (2004 年 6 月)和國際專利公開號 WO 2004/042397 [其中的全部序列存放在GenBank中]，以及2004年9月30日提交的國際專利公開號WO 2005/033321，其引用作為參考。
例如，就下表而言，各名稱應如下理解。Cy5Rl指氨基酸殘基位點13處為天冬氨酸(D)的經修正氨基酸序列SEQ ID NO 24 ；cy5天然氨基酸序列的第13位殘基處是甘氨酸。Cy5R2指氨基酸殘基位點13處(在天然序列中為甘氨酸)為天冬氨酸且在氨基酸殘基位點403處(在天然序列中為天冬氨酸)為天冬酰胺的經修正氨基酸序列SEQ ID NO 240 Cy5R3具有經修正的氨基酸序列SEQ ID NO :24，具有與Cy5R2相同的改變，此外，在位點158 處為賴氨酸(在天然序列中為天冬酰胺)，在位點161處為谷氨酰胺(在天然序列中為脯氨酸)。鑒于以上信息，本領域技術人員可容易地確定在下表中所列的其他單現突變改變。
權利要求
1.一種腺相關病毒AAV6. 2載體，具有經修飾的AAV6衣殼，所述衣殼具有經修飾的SEQ ID NO:29所示氨基酸序列，其中氨基酸殘基位點129處的原苯丙氨酸改為亮氨酸。
2.如權利要求1所述的AAV載體，其是用于向宿主細胞遞送基因產物。
3.—種核酸分子,其中的核酸序列編碼一種AAV6. 2衣殼,所述衣殼具有經修飾的SEQ ID NO:29所示氨基酸序列，其中氨基酸殘基位點129處的原苯丙氨酸改為亮氨酸。
4.如權利要求1所述的AAV載體，還含有小基因，所述小基因具有AAV反向末端重復 (ITR)和異源基因，所述異源基因與指導其在宿主細胞內表達的調控序列操作性相連。
5.如權利要求4所述的AAV載體,所述反向末端重復來自與AAV6.2異源的AAV。
6.一種腺相關病毒(AAV)載體，具有經修飾的AAVrh48衣殼(rh48. 2)，所述經修飾的衣殼具有經修飾的SEQ ID N0:44所示氨基酸序列，其中氨基酸殘基位點304處的原絲氨酸改為天冬酰胺。
7.如權利要求6所述的AAV載體，所述衣殼還具有以下修飾SEQID N0:44第217位的原賴氨酸改為谷氨酸。
8.如權利要求6或7所述的AAV載體，所述載體攜有編碼基因產物的轉基因，所述轉基因受指導其在宿主細胞內表達的調控序列的調控。
9.一種組合物，包含如權利要求6-8中任一項所述的AAV載體和生理相容載體。
10.如權利要求6-8中任一項所述的AAV載體或如權利要求9所述的組合物，它們是用于向對象遞送基因產物。
11.一種核酸分子，其中的核酸序列編碼經修飾的AAVrh48衣殼，所述經修飾的衣殼具有經修飾的SEQ ID N0:44所示氨基酸序列，其中氨基酸殘基位點304處的原絲氨酸改為天冬酰胺。
12.如權利要求11所述的核酸分子，所述AAVrh48衣殼還具有以下修飾SEQ ID NO:44第217位的原賴氨酸改為谷氨酸。
13.—種腺相關病毒(AAV)載體，具有選自以下的AAVhu48衣殼(a)具有經修飾SEQ ID NO:50所示氨基酸序列的hu48衣殼，其中氨基酸殘基位點277處的原甘氨酸改為絲氨酸、氨基酸殘基位點322處的原谷氨酸改為賴氨酸、氨基酸殘基位點552處的原絲氨酸改為天冬酰胺；和(b)具有經修飾SEQ ID N0:50所示氨基酸序列的hu48衣殼，其中氨基酸殘基位點277處的原甘氨酸改為絲氨酸、氨基酸殘基位點322處的原谷氨酸改為賴氨酸。
14.如權利要求13所述的AAV載體，所述衣殼是具有以下修飾的SEQID N0:50所示氨基酸序列的hu48衣殼(a)氨基酸殘基位點277處的原甘氨酸改為絲氨酸、氨基酸殘基位點322處的原谷氨酸改為賴氨酸、氨基酸殘基位點552處為天冬酰胺。
15.如權利要求13或14所述的病毒載體，所述病毒載體攜有編碼基因產物的轉基因， 所述轉基因受指導其在宿主細胞內表達的調控序列的調控。
16.一種組合物，包含權利要求13-15中任一項所述的AAV載體和生理相容載體。
17.如權利要求13-15中任一項所述的AAV載體或如權利要求16所述的組合物,它們是用于向對象遞送基因產物。
18.一種核酸分子，其中的核酸序列編碼選自以下的經修飾的AAVhu. 48衣殼(a)具有經修飾SEQ ID NO:50所示氨基酸序列的hu48衣殼，其中氨基酸殘基位點277處的原甘氨酸改為絲氨酸、氨基酸殘基位點322處的原谷氨酸改為賴氨酸、氨基酸殘基位點552處的原絲氨酸改為天冬酰胺；和(b)有經修飾SEQ ID NO: 50所示氨基酸序列的hu48衣殼，其中氨基酸殘基位點277處的原甘氨酸改為絲氨酸、氨基酸殘基位點322處的原谷氨酸改為賴氨酸。
19.如權利要求18所述的核酸分子，所述經修飾的AAVhu48是(a)具有經修飾SEQID NO: 50所示氨基酸序列的hu48衣殼，其中氨基酸殘基位點277處的原甘氨酸改為絲氨酸、氨基酸殘基位點322處的原谷氨酸改為賴氨酸、氨基酸殘基位點552處的原絲氨酸改為天冬酰胺。
20.如權利要求18所述的核酸分子，其為質粒。
21.一種腺相關病毒(AAV)載體，具有AAVrh32/33衣殼，所述衣殼具有SEQID NO: 2所示氨基酸序列，所述病毒載體攜有編碼基因產物的轉基因，所述轉基因受指導其在宿主細胞內表達的調控序列的調控。
22.如權利要求21所述的AAV載體，所述基因產物是免疫原或抗原。
23.如權利要求21或22所述的AAV載體，所述基因產物源自病毒抗原或免疫原。
24.如權利要求23所述的AAV載體，所述抗原或免疫原選自HIV或SIV抗原或流感病毒蛋白。
25.一種組合物，包含藥學上認可的載體和權利要求21-24中任一項所述的AAV載體。
26.權利要求21-24中任一項所述的載體，它是用于向宿主細胞遞送基因產物。
27.一種核酸分子，其中的核酸序列編碼AAVrh32/33衣殼，所述衣殼具有SEQ ID NO: 2 所示氨基酸序列。
28.—種腺相關病毒(AAV)載體，具有AAVrh. 64衣殼，所述衣殼具有經修飾的SEQ ID NO:43所示氨基酸序列，其中第697位的原精氨酸改為色氨酸。
29.如權利要求28所述的病毒載體，所述病毒載體攜有編碼基因產物的轉基因，所述轉基因受指導其在宿主細胞內表達的調控序列的調控。
30.一種組合物，包含權利要求28或29所述的AAV載體和生理相容載體。
31.如權利要求28或29所述的AAV載體或如權利要求30所述的組合物，它們是用于向對象遞送基因產物。
32.—種核酸分子，其中的核酸序列編碼經修飾的AAVrh. 64衣殼，所述衣殼具有經修飾的SEQ ID NO:43所示氨基酸序列，其中第697位的原精氨酸改為色氨酸。
33.如權利要求32所述的核酸分子，其為質粒。
全文摘要
本發明提供了一種在選定的腺相關病毒(AAV)序列中校正單現突變從而提高選定AAV的包裝產量、轉導效率和/或基因轉移效率的方法。該方法包括改變親代AAV衣殼中的一個或多個單現突變，使它們與用來比對的功能性AAV衣殼序列中相應位點上的氨基酸相一致。
文檔編號A61K48/00GK102994549SQ20121042203
公開日2013年3月27日 申請日期2006年4月7日 優先權日2005年4月7日
發明者L·范登伯格, G·高, J·M·威爾森 申請人:賓夕法尼亞大學托管會