專利名稱：一種高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗稀釋液的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗稀釋液，尤其是ー種含有適量滅活草分枝桿菌菌體的高致病性豬繁埴與呼吸綜合征活疫苗稀釋液。
背景技術(shù)：
豬繁通與呼吸綜合征(Porcinereproductive and respiratory syndrome,PRRS)又稱“豬藍耳病”，是由豬繁埴與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive andrespiratory syndrome virus,PRRSV)引起的豬的ー種高度接觸性傳染病,不同年齡、品種和性別的豬均能感染，但以妊娠母豬和I月齡以內(nèi)的仔豬最易感；該病以母豬流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎、弱仔以及仔豬咳嗽、氣喘等呼吸癥狀為主要特征。該病從20世紀80年代后期出現(xiàn)以來，已給全球的養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失。(吳佳俊等，豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗研究進展，中國預(yù)防獸醫(yī)學報，2010，32 (8) =655-658)。
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2006年4月，我國南方地區(qū)暴發(fā)了ー種以持續(xù)高熱、食欲廢絕、身體發(fā)紺、藍耳、腹瀉為特征，高發(fā)病率和高死亡率，傳播迅速的高致病性藍耳病(Highly pathogenic PRRS,HP-PRRS)，波及全國25個省份，經(jīng)濟損失巨大，研究證明引發(fā)該病的主要病原是高致病性PRRSV，鑒于該病的嚴重危害性，我國于2008年底在新修訂的《一、ニ、三類動物疫病病種名錄》中將其列為ー類動物疫病(韋天超，2009)。高致病性豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)又名藍耳病，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株(PRRSV)引起豬的ー種急性、熱性、接觸性傳染病。以繁殖障礙、呼吸困難、耳朵藍紫、并發(fā)其他傳染病為主要特征。(馬紅艷，郝永清，豬繁殖與呼吸綜合征的研究.畜牧與飼料科學，2007，28 (4) :43-45.)。為了有效地控制高致病性豬繁殖與呼吸綜合征，國內(nèi)已開發(fā)用于預(yù)防PRRS的疫苗。在PRRS活疫苗研制中，疫苗毒株、病毒培養(yǎng)條件和免疫增強劑是研發(fā)有效疫苗的關(guān)鍵。其中，添加免疫增強劑是提高疫苗效力的有效途徑。草分枝桿菌是分枝桿菌中的ー種，其中分枝桿菌胞壁酰ニ肽(MDP)具有很強的免疫治療作用，草分枝桿菌多糖MPS在免疫調(diào)節(jié)、抑制病毒復(fù)制方面有很好效果(周莉婷，趙晶晶等，分枝桿菌多糖免疫調(diào)節(jié)劑研究進展，藥物生物技術(shù)，2011，18 (2) =176-179)。草分枝桿菌可用于高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗稀釋液中，通過提高宿主自身的免疫應(yīng)答能力來提增強疫苗免疫力，安全可靠。由于草分枝桿菌發(fā)酵方便、成本低廉，便于臨床大面積推廣使用。由于稀釋液需要與高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗混合使用，普通的甲醛滅活劑在草分枝桿菌菌體中有殘留的風險，能對高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒產(chǎn)生影響，我們考慮使用丙內(nèi)酯對草分枝桿菌菌體進行滅活。由于丙內(nèi)酯水溶液半衰期短(10°C時僅為18hr，25°C時為3. 5hr，50°C時為20min，75°C時為5min)，能在疫苗液體中完全水解，不必考慮在成品疫苗中的殘留，滅活的草分枝桿菌菌體中無滅活劑殘留，能夠有效保護高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗的免疫原性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗稀釋液，從而將高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗的免疫水平提高到一個新的高度，更加有效的預(yù)防免疫豬群高致病性豬繁殖與呼吸綜合征的發(fā)生。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案為利用一株購于北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所中國普通微生物保藏管理中心、編號為CGMCC AS 4. 1180的草分枝桿菌(Mycobacterium phlei)編號CGMCC AS 4. 1180菌株，進行草分枝桿菌菌體的制備，然后將草分枝桿菌菌體按照每毫升中含O. 001 O. Img菌體(優(yōu)選O. 08mg)的量添加到高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗稀釋液中，得到ー種新型疫苗稀釋液。
具體實施例方式I.草分枝桿菌菌株來源本發(fā)明涉及到的草分枝桿菌(Mycobacterium phlei)菌株購于北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所中國普通微生物保藏管理中心，編號=CGMCC AS
4.1180。2.草分枝桿菌菌體的制備(I)種子培養(yǎng)將草分枝桿菌(Mycobacterium phlei) CGMCC AS 4. 1180株置于種子耀中進行培養(yǎng)，37°C通氣培養(yǎng)，pH值為7. 0，培養(yǎng)時間為3 4天，得到發(fā)酵用種子液；種子罐中的培養(yǎng)基配方酵母提取粉I. Og 5. 0g，濃縮麥芽汁(購自濟南雙麥啤酒物資有限公司)2. Og 10. Og,葡萄糖5. Og 50g,磷酸氫ニ銨I. Og 4. Og,磷酸氫ニ鉀O. 5g I. Og,注射用水加至IOOOmlo(2)草分枝桿菌發(fā)酵培養(yǎng)將配制好的液體培養(yǎng)基與所培養(yǎng)的種子液一起放入種子罐進行發(fā)酵培養(yǎng)，37°C通氣培養(yǎng)，pH值為7.0，培養(yǎng)時間為5天；發(fā)酵罐中培養(yǎng)基配方酵母提取粉5. Og 10. 0g，濃縮麥芽汁(購自濟南雙麥啤酒物資有限公司)5. Og 20g,葡萄糖20g IOOg,磷酸氫ニ銨I. Og 4. Og,磷酸氫ニ鉀0. 5g I. Og,注射用水加至IOOOmlo⑶后處理將發(fā)酵液用β丙內(nèi)酯(1/4000)滅活后，離心濃縮，棄去上清液，取下層菌體用適量生理鹽水重懸浮3次，離心除去雜質(zhì)，測定水分，計算干菌體重量，即得草分枝桿菌菌體。3.高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗稀釋液的制備(I)磷酸緩沖液疫苗稀釋液制備I)磷酸緩沖液的配制甲液磷酸ニ氫鉀9. 074g、注射用水加至1000ml ；乙液:磷酸氫ニ鈉9. 465g、注射用水加至1000ml。如果用含結(jié)晶水的磷酸鹽，則稱量時要按帶水的克分子量除以15稱量。按照甲液こ液=19ml 81ml 37ml 63ml的比例進行磷酸緩沖液的配制，得磷酸緩沖液。2)疫苗稀釋液的制備在配制好的磷酸緩沖液中加入草分枝桿菌菌體，加量為O. 01 O. lmg/ml (優(yōu)選O. 08mg/ml)，即得磷酸緩沖液疫苗稀釋液。(2)生理鹽水稀釋液制備 在O. 9 % NaCl溶液中，加入草分枝桿菌菌體，加量為O. 01 O. lmg/ml (優(yōu)選O. 08mg/ml)，即得生理鹽水疫苗稀釋液。4.對比試驗(I)取商品化的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗，分別用磷酸緩沖液疫苗稀 釋液、生理鹽水疫苗稀釋液和加入O. 08mg/ml草分枝桿菌菌體的磷酸緩沖液疫苗稀釋液、生理鹽水疫苗稀釋液進行稀釋至I頭份/ml，備用。(2)將稀釋好的四種疫苗，分別肌肉注射20頭4-6周齡健康易感仔豬，Iml/頭。(3)免疫28日后，分離血清用豬繁殖與呼吸綜合征抗體檢測試劑盒(ELISA)檢測高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體水平。(4)檢測試劑豬繁殖與呼吸綜合征抗體ELISA試劑盒為美國IDEXX抗體檢測試劑盒，購自北京愛德士元亨生物科技有限公司，生產(chǎn)批號為09418-KE158。(5)抗體檢測方法采用豬藍耳病病毒N蛋白的基因工程表達產(chǎn)物包被微孔板。在試驗中，加入稀釋的對照血清和待檢血清，經(jīng)溫育后，若樣品中含有豬藍耳病N蛋白的特異性抗體，則將與包被板上的抗原結(jié)合，經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的抗體和其他成分后；再加入酶標ニ抗，與包被板上抗原抗體復(fù)合物發(fā)生特異性結(jié)合再經(jīng)洗滌除去未結(jié)合酶結(jié)合物，在孔中加入TMB底物液，與酶反應(yīng)形成藍色產(chǎn)物，加入HF溶液終止反應(yīng)后，用酶標儀630nm波長測定各反應(yīng)孔中的OD值。(6)判定標準在酶標儀上測各孔OD63tol值，樣品OD63tlnm值> O. 42，判為陽性；樣品OD63tlnm值介于
O.387 O. 42之間，判為可疑；樣品OD63tlnm值< O. 38，判為陰性。(7)試驗結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗稀釋液，其特征是每毫升稀釋液含有O. Ol O. 2mg、優(yōu)選 O. 08mg 滅活的草分枝桿菌(Mycobacterium phlei) CGMCC AS 4.1180菌體和磷酸緩沖液。
2.如權(quán)利要求I所述的ー種高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗稀釋液，其特征是其中 的磷酸緩沖液可以用生理鹽水替代。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗稀釋液。該高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗稀釋液中加入了適量的草分枝桿菌菌體，注射后通過提高宿主自身的免疫應(yīng)答能力，并與高致病性藍耳病毒抗原協(xié)同作用，可達到增強疫苗免疫力的作用，從而增加疫苗的免疫效果，能夠更加有效的預(yù)防高致病性豬繁殖與呼吸綜合征的發(fā)生；使用安全可靠。由于草分枝桿菌發(fā)酵方便、成本低廉，可大面積應(yīng)用于高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗稀釋液的生產(chǎn)中，具有直接的經(jīng)濟效益和社會效益。
文檔編號A61P37/04GK102716482SQ20121005712
公開日2012年10月10日 申請日期2012年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月7日
發(fā)明者劉紅娟, 吳昊, 徐龍濤, 王蕾, 鮑海忠 申請人:齊魯動物保健品有限公司