專利名稱：：在植物中生產(chǎn)豬生殖和呼吸綜合征口服疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及在植物中生產(chǎn)動物疫苗。更具體地講，本發(fā)明涉及表達(dá)獲自或源于豬生殖和呼吸綜合征病毒的至少一個基因。本發(fā)明還涉及相關(guān)蛋白的純化和服用，以便在豬體內(nèi)誘導(dǎo)保護(hù)性抗體的產(chǎn)生。本發(fā)明背景豬生殖和呼吸綜合征(PRRS)是作為一種重要的豬傳染病出現(xiàn)的。自從這種病于1987年在美國首次發(fā)現(xiàn)以來(Keffaber1989)，PRRS已快速蔓延，并且現(xiàn)在已成為世界范圍內(nèi)養(yǎng)豬業(yè)的一個嚴(yán)重問題。在依阿華州的一個地區(qū)，這種病導(dǎo)致了85000頭豬的死亡，而在歐洲，在1990/91的冬季估計(jì)出現(xiàn)了超過一百萬頭以上的死亡(Anon1990，綜述文獻(xiàn)參見Meredith1995)。在加拿大，PRRS感染在安大略和魁北克更加流行，不過，還報導(dǎo)了在其他省份的爆發(fā)情況(Morin和Robinson1991，Dea等1992，Sanford1992)。臨床現(xiàn)象從嚴(yán)重爆發(fā)到持續(xù)感染不等。飼養(yǎng)母豬的嚴(yán)重癥狀包括流產(chǎn)、早產(chǎn)和死胎，而對小豬來說，呼吸疾病更常見的是導(dǎo)致高達(dá)80％的斷奶前死亡(Loula1991，綜述文獻(xiàn)可以參見Chritianson和Joo1994)。持續(xù)感染的動物可能在臨床上沒有癥狀，但會持續(xù)釋放病毒，并且它是向新生動物傳播病毒的重要來源。在嚴(yán)重爆發(fā)情況下，受感染的飼養(yǎng)場，可能平均損失其每年斷奶小豬生產(chǎn)的10％。由PRRS病毒感染在每頭母豬上所造成的直接損失估計(jì)為70-350美元，并且每頭母豬的潛在的效益損失還有440美元(Meridith1995，Muirhead1992，Polson1990)。由于延長了達(dá)到屠宰重量所需要的平均時間(達(dá)7天)所導(dǎo)致的生長速度降低造成了幼豬/肥育豬的損失。另外，很多國家禁止從受感染的國家進(jìn)口活豬和精液，這進(jìn)一步造成了加拿大生豬出口的經(jīng)濟(jì)損失(Anon1992)。迫切需要建立合適的控制措施，以防PRRS病毒的感染，以使加拿大，特別是有大量養(yǎng)豬場的安大略的養(yǎng)豬業(yè)保持活力和競爭力。在臨床上，大部分豬在從初次感染中恢復(fù)之后變得對進(jìn)一步的PRRS病毒感染有免疫力。用失活的PRRS病毒免疫的母豬還能防止流產(chǎn)。以上發(fā)現(xiàn)表明，主動的免疫能夠誘導(dǎo)對保護(hù)豬不受PRRS病毒感染來說重要的中和抗體反應(yīng)(Albina1992)。通常，有兩種類型的疫苗能對動物進(jìn)行主動免疫減活疫苗和滅活疫苗。減活疫苗通常更具有免疫原性，因此可以誘導(dǎo)更高效價的抗體反應(yīng)和持續(xù)時間更長的免疫反應(yīng)。不過，常規(guī)減活疫苗是通過諸如自發(fā)突變或隨機(jī)突變的不確定的機(jī)制產(chǎn)生的。因此，活的疫苗具有在免疫時恢復(fù)該疫苗菌株的毒力和實(shí)際發(fā)病的潛力。相反，失活的滅活疫苗是安全的，但通常在免疫原性方面較差，并需要大劑量的抗原。因此，生產(chǎn)專門供獸醫(yī)使用的這種疫苗成本太高?，F(xiàn)代重組DNA技術(shù)，使得我們能夠通過在植物中生產(chǎn)重組亞基PRRS病毒抗原來開發(fā)安全的、有效的、低成本的疫苗。含有哺乳動物基因蛋白的轉(zhuǎn)基因植物的育成是植物生物技術(shù)的一個重大發(fā)展(Lefebvre等1998)。從那時起，業(yè)已表達(dá)了多種哺乳動物基因，并且業(yè)已認(rèn)識到植物是有效的、低成本的、不用滅菌的生物反應(yīng)器，它具有生產(chǎn)對醫(yī)藥和工業(yè)有價值的蛋白的巨大潛力。植物是高等真核生物，并且能夠正確使蛋白折疊和糖基化，而細(xì)菌系統(tǒng)不能?？梢杂帽磉_(dá)PRRS病毒抗原的植物飼養(yǎng)豬，并因此使得豬對所述病毒性疾病免疫。我們的方法可用于開發(fā)未來的獸醫(yī)用疫苗候選物，這種疫苗不僅能保護(hù)豬免受PRRS病毒感染，而且還能使動物不受很多其他傳染病的感染。豬生殖和呼吸綜合征(PRRS)是一種在豬身上新鑒定的傳染病，并且業(yè)已成為一種養(yǎng)豬業(yè)中最重要的疾病。最近業(yè)已分離了PRRS的致病劑，并且它似乎屬于已知為Arterivirus類型的不確定類型的病毒(Plagemann和Meonnig1992，Meulenberg等1993)。Arterivirus還包括三種其他病毒馬貧血病毒、猴出血熱病毒、和小鼠乳酸脫氫酶病毒。豬體內(nèi)的PRRS病毒是一種包膜病毒，含有15kb的單鏈RNA基因組，具有陽性極性。最近業(yè)已用在歐洲分離的原形Lelystad病毒測定了其完整的基因組序列(Meulenberg等1993)。PRRS病毒及其他arteriviruses似乎具有冠狀病毒的基因組組構(gòu)和表達(dá)策略(Snijder等994)。在病毒基因組中鑒定了8個開放讀框(ORFs)。人們認(rèn)為ORF1a和1b編碼病毒基因組復(fù)制和轉(zhuǎn)錄所必需的RNA聚合酶。ORF7編碼與病毒基因組RNA相互作用并將其包入衣殼的核殼蛋白。計(jì)算機(jī)預(yù)測業(yè)已表明，ORF2-6編碼與病毒外膜相關(guān)的膜蛋白。在上述潛在的膜蛋白中，ORF5是一種主要結(jié)構(gòu)蛋白，業(yè)已在純化的病毒顆粒中鑒定到這種蛋白(Loemba等1996)。ORF6也是一種膜蛋白，但它與其他arteriviruses不同，它不是誘導(dǎo)中和抗體反應(yīng)的抗原。ORF2、ORF3、和ORF4蛋白尚未鑒定，因此，其生物學(xué)功能在目前大多未知。對于小鼠的乳酸脫氫酶病毒來說，用單克隆抗體進(jìn)行的研究業(yè)已表明，ORF5蛋白是誘導(dǎo)中和抗體的一種主要病毒抗原(Plagemann和Moennig1992)。還有報導(dǎo)說ORF2可能在小鼠中誘導(dǎo)中和抗體方面起著次要作用。在JP08205858和US5,510,258中分別披露了在上皮細(xì)胞或組織培養(yǎng)系統(tǒng)中生產(chǎn)PRRS病毒蛋白。類似地，US5,510,258提供了一種用于生產(chǎn)PRRSV的組織培養(yǎng)基礎(chǔ)系統(tǒng)。在WO96/04010和WO94/18311中，將一種綠猴腎細(xì)胞系用于生產(chǎn)所述病毒，而在WO95/31550中，所述疫苗是用一種桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的。另外，EP732340披露了用一種合適的宿主系統(tǒng)作為桿狀病毒的優(yōu)選宿主生產(chǎn)糖基化形式的PRRSV。后一個申請還涉及ORFS2-4的表達(dá)。WO96/21012涉及用苜蓿和煙草作為植物表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)免疫球蛋白。上述文獻(xiàn)沒有一件披露或暗示用植物宿主制備獲自PRRS病毒的蛋白。當(dāng)給小鼠口服從轉(zhuǎn)基因植物組織中提取的粗制蛋白時，發(fā)現(xiàn)這種在轉(zhuǎn)基因植物中產(chǎn)生的細(xì)菌抗原(大腸桿菌腸毒素)能有效免疫小鼠(Haq等1995)。業(yè)已將植物用于生產(chǎn)疫苗抗原，用于諸如乙型肝炎病毒和Norwalk病毒的病毒疾病免疫(Mason等1992，1996)。所述抗原可用于小鼠的口服免疫，并且就Norwalk病毒抗原來說相當(dāng)通過桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生的抗原。用農(nóng)桿菌屬介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化植物，并且通過直接喂給植物組織或作為粗制蛋白提取物服用所述抗原。業(yè)已通過在植物病毒的表面上表達(dá)病毒表位，然后用所述改性病毒感染易感宿主生產(chǎn)了抗諸如貂腸病毒的動物疾病和諸如脊髓灰質(zhì)炎的人類疾病的植物產(chǎn)生的疫苗(Dalsgaar等1997，Haynes等1986)。所述植物病毒是從組織中純化的，并給實(shí)驗(yàn)動物服用。盡管該系統(tǒng)是非常有效的，但它所能產(chǎn)生的抗原的大小局限于37個氨基酸，這就要求抗原的表位圖是完整的(Yusibov等1997)。情況并不總是這樣，特別是對新發(fā)現(xiàn)的疾病來說，表達(dá)完整長度的蛋白是唯一的選擇。另外，表達(dá)是瞬時的，并且在農(nóng)業(yè)水平上污染也是一個問題。用植物作為生物反應(yīng)器的引人注目的證據(jù)是在兩篇最近的論文中提出的，第一篇論文證實(shí)了一種分泌性免疫球蛋白的四條鏈在植物中的正確表達(dá)和組裝，而且這種抗體具有所有的功能(Ma等1995)。新的研究業(yè)已擴(kuò)展到人類血紅蛋白的主題，并且進(jìn)一步證實(shí)了植物作為生物反應(yīng)器的用途(Diercyk等1997)。上述例子基于農(nóng)桿菌屬介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，如果需要，它可以用種子再生形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因植物。盡管一直以來植物都是藥理學(xué)的活性制品來源，植物基因工程的出現(xiàn)產(chǎn)生了無數(shù)新的可能性(Ma和Hein1995，Goddjin和Pen1995)。業(yè)已證實(shí)煙草本身特別適用于用異源基因轉(zhuǎn)化，并且有時可以作為植物轉(zhuǎn)化的模型系統(tǒng)(Horsch等1989)。盡管所述集中在作物保護(hù)方面的生物技術(shù)尚未發(fā)現(xiàn)在煙草生產(chǎn)上的用途，煙草仍然具有作為生物反應(yīng)器的主要作用。煙草葉片能夠產(chǎn)生高水平(8-10％)的可溶性蛋白(組分1蛋白，F(xiàn)1P)(Woodleif等1981)，并且業(yè)已建立了中試系統(tǒng)，以便純化該組分，用作高蛋白實(shí)用添加劑(Montanari等1993)。我們業(yè)已將所述F1P系統(tǒng)改進(jìn)成表達(dá)絨杜父魚Ⅱ型抗凍蛋白的轉(zhuǎn)基因煙草，并確定了能使轉(zhuǎn)基因蛋白產(chǎn)量最大的農(nóng)業(yè)條件(待批的加拿大申請2，188，220；Kenward1995)。通過使該系統(tǒng)基于局部改良的煙草突變型(81V9)消除了尼古丁污染最終制品的所有潛在可能，所述突變型僅具有有限的合成煙草生物堿的能力(Chaplin1977)。考慮到口服運(yùn)送食用植物組織的轉(zhuǎn)基因蛋白的潛在可能性，這一點(diǎn)特別重要。苜蓿在作為在植物生產(chǎn)蛋白的生物反應(yīng)器方面具有某些獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。以全植株為基礎(chǔ)計(jì)算蛋白含量通常為20％，并且可以根據(jù)管理措施而更高。這一特征以及高的植物產(chǎn)量的特征，使得每公頃的苜蓿作物能比在安大略的任何其他作物產(chǎn)生更多的蛋白。這主要是因?yàn)楦錾系母鼍哂蟹浅Ｓ行У墓痰饔?，而葉片又起著有效儲存器的作用。結(jié)果，在不使用高成本并且破壞環(huán)境的氮肥的情況下，在植物中可以達(dá)到高的蛋白含量。由于苜蓿還是多年生的，苜蓿植株還能夠提供額外的環(huán)保作用，例如將雪(和水分)保持在大田中，并減輕風(fēng)和土壤流失；多年生的習(xí)性還消除了一年生作物所需要的整地和種植的成本。隨著植物重組蛋白的生產(chǎn)從小試規(guī)模到中試規(guī)模的改變。必須強(qiáng)調(diào)管理問題(Miele1997)。從管理和工業(yè)安全角度出發(fā)，非糧食種類對于生物活性蛋白的生產(chǎn)來說是理想的。煙草和苜蓿是非糧食作物，因此將表達(dá)編碼生物學(xué)活性蛋白的基因的轉(zhuǎn)基因植物材料意外泄露到人類食物鏈中機(jī)會幾乎為零。其他植物生物反應(yīng)器系統(tǒng)不具有這一優(yōu)點(diǎn)。在加拿大生產(chǎn)煙草可進(jìn)一步降低基因泄露到地方植物種群中的危險，因?yàn)樵诩幽么鬀]有天然存在的野生煙草物種。采用煙草系統(tǒng)，蛋白生產(chǎn)是基于葉片而不是種子或根，當(dāng)結(jié)合在開花之前收獲葉片的事實(shí)時，實(shí)際上不存在在未來的種植季節(jié)中出現(xiàn)不可控制的生物反應(yīng)器植物的危險。在加拿大，煙草不能越冬，因此不會在下一個季節(jié)中有宿根再生。用于轉(zhuǎn)基因蛋白生產(chǎn)的背景基因型和系統(tǒng)強(qiáng)調(diào)了多種潛在的管理問題，并開始解決有可能損害產(chǎn)品質(zhì)量的生物學(xué)活性次級代謝物的問題。本發(fā)明提供了一種低成本生產(chǎn)能夠在豬體內(nèi)誘導(dǎo)針對PRRS病毒的保護(hù)性抗體產(chǎn)生的病毒抗原蛋白的方法。本發(fā)明概述本發(fā)明涉及在植物組織中表達(dá)動物疫苗。更具體地講，本發(fā)明涉及在植物中表達(dá)獲自PRRS病毒的至少一個基因，并給豬服用該基因產(chǎn)物。根據(jù)本發(fā)明，提供了一種制備至少一種豬生殖和呼吸綜合征病毒蛋白的方法，該方法包括以下步驟獲得編碼所述蛋白的基因，將所述基因插入適于轉(zhuǎn)化植物的載體，用所述載體轉(zhuǎn)化植物，以及生長所述轉(zhuǎn)化的植物。該方法可以使用天然基因序列或合成基因序列。另外，本發(fā)明涉及上述方法，其中，收獲所述轉(zhuǎn)化的植物，以便獲得收獲的組織，從收獲的組織中提取蛋白，并在提取步驟之后選擇性地純化所述蛋白。本發(fā)明還提供了通過該方法制備的蛋白。本發(fā)明還涉及上述方法，其中，對天然或合成基因序列進(jìn)行修飾，以便增強(qiáng)所述基因在植物組織中的表達(dá)和其所編碼蛋白的穩(wěn)定性。本發(fā)明還包括上述方法，其中修飾包括用一個異源信號序列取代其天然信號序列，一個ER滯留基序(retention)，一個裂解位點(diǎn)，和一個HIS標(biāo)記。本發(fā)明還提供了一種上述方法，其中，所述基因編碼ORF5蛋白。本發(fā)明還涉及上述方法，其中，所述植物是煙草植物或苜蓿植物。本發(fā)明還涉及序列1所示的DNA分子，和含有該DNA分子的載體，所述DNA分子操作地與啟動子、增強(qiáng)子和終止子區(qū)連接，另外，本發(fā)明提供了含有上述載體的植物。本發(fā)明還涉及一種使豬對豬生殖呼吸綜合征免疫的方法，包括用上述載體轉(zhuǎn)化植物，生長所述轉(zhuǎn)化植物，收獲所述轉(zhuǎn)化植物以便獲得收獲的組織，對豬喂給所述收獲的組織，如果需要重復(fù)喂養(yǎng)步驟。本發(fā)明還包括提供上述方法，其中，從所述收獲的組織中提取由存在于所述載體上的DNA分子編碼的蛋白并作為食品添加劑或作為注射劑給豬施用。另外，本發(fā)明還涉及給豬服用非收獲的植物組織。附圖的簡要說明通過以下說明本發(fā)明的上述和其他特征變得明顯，其中，結(jié)合附圖進(jìn)行說明，其中圖1表示合成PRRS病毒ORF5基因的核苷酸序列的例子。對天然成熟蛋白序列進(jìn)行改變，原始堿基在上面示出。來自煙草的PR1b分泌信號出現(xiàn)在1-93號堿基上，成熟PRRS病毒ORF5編碼區(qū)出現(xiàn)在94-621號堿基上，凝血酶裂解位點(diǎn)出現(xiàn)在622-636號堿基上，組氨酸尾出現(xiàn)在649-666號堿基上，以及KDEL基序出現(xiàn)在667-678號堿基上。圖2表示用寡核苷酸模塊構(gòu)建合成PRRS病毒ORF5基因的簡化克隆方案的例子。模塊Ⅰ-Ⅲ表示獨(dú)立的寡核苷酸，首先將這些寡核苷酸退火，然后連接，然后擴(kuò)增以便產(chǎn)生具有特殊限制位點(diǎn)的DNA雙鏈，所述限制位點(diǎn)可以對完成的合成基因進(jìn)行酶促組裝。為了進(jìn)行克隆，將一個BamHI限制位點(diǎn)添加在該序列的5’末端，而將Kpn1序列添加在3’末端。源于苜?；ㄈ~病毒的前導(dǎo)序列出現(xiàn)在10-45號堿基上，源于煙草的PR1b分泌信號出現(xiàn)在49-143號堿基上，成熟PRRS病毒天然ORF5蛋白編碼區(qū)出現(xiàn)在144-663號堿基上。作為密碼子優(yōu)化方法的一部分進(jìn)行的單個堿基改變或增加限制位點(diǎn)通過在天然序列的上面用單個的黑體字母表示。凝血酶裂解位點(diǎn)出現(xiàn)在664-681號堿基上，組氨酸尾出現(xiàn)在692-709號堿基上，而ER保留信號出現(xiàn)在710-721號堿基上。圖3表示用于構(gòu)建構(gòu)成所述合成基因的模塊的寡核苷酸序列的例子。圖4表示用于構(gòu)建合成ORF5的包括模塊Ⅰ、Ⅱ、和Ⅲ的引物的完整序列。引物1-12分別為序列鑒定號2-13。圖5表示用天然ORF5基因構(gòu)建(pCAMTerX-ORF5A)或合成ORF5基因構(gòu)建(pCAMTerX-ORF5B)轉(zhuǎn)化的煙草植物的Northern分析。圖5A和B獲自用pCAMTerX-ORF5A轉(zhuǎn)化的植物的葉片組織獲得的RNA的Northern印跡，圖5C和D獲自用pCAMTerX-ORF5B轉(zhuǎn)化的植物的葉片組織獲得的RNA的Northern印跡?！唉恕北硎痉肿哟笮?biāo)記；“81V9”是未轉(zhuǎn)化的(對照)植物。圖6表示用合成基因構(gòu)建(pPSP-ORF5B)轉(zhuǎn)化的煙草植物的Western分析。用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從植物中分離蛋白，用SDS-PAGE分離，并轉(zhuǎn)移到膜上，用對ORF5專一的多克隆抗血清探測。所述抗血清是從豬體內(nèi)獲得的。泳道M是預(yù)染色分子量標(biāo)記；泳道1是未轉(zhuǎn)化的植物(對照)；而泳道2-9是轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明提供了低成本生產(chǎn)能夠在豬體內(nèi)誘導(dǎo)針對PRRS病毒的保護(hù)性抗體產(chǎn)生的病毒抗原蛋白的方法。為了在植物中表達(dá)所需要的蛋白，可以使用編碼感興趣的PRRS病毒的蛋白，例如ORF5蛋白的基因。還希望構(gòu)建編碼感興趣的蛋白，例如ORF5蛋白的合成基因，以便其表達(dá)產(chǎn)物與天然病毒蛋白相同。為了優(yōu)化所述異源基因在植物中的表達(dá)，可以視需要改變或設(shè)計(jì)天然或合成基因，以便相應(yīng)的蛋白以高于天然基因的水平產(chǎn)生。優(yōu)選設(shè)計(jì)具有與天然基因有大約60-90％同源性的合成基因，對該基因進(jìn)行修飾，并在植物中高水平表達(dá)。所述合成基因更優(yōu)選包括與天然基因的大約80-90％的同源性。在下面的實(shí)施例中，披露了一種包括82％的同源性的基因，不過，可以理解的是，該實(shí)施方案不應(yīng)被示為是任何意義上的限定。還希望對天然或合成基因作進(jìn)一步的修飾，以便可以優(yōu)化所述基因的表達(dá)和所述蛋白的穩(wěn)定性或純化。例如，可以對所述基因的5’或3’區(qū)進(jìn)行修飾，以便增強(qiáng)所述基因的表達(dá)，并將其產(chǎn)物引導(dǎo)至合適的細(xì)胞間區(qū)室中，以便確保其穩(wěn)定性。下面解釋對天然基因的修飾，以便天然和合成基因包括KDELER滯留基序，PR1b信號序列，和裂解位點(diǎn)和組氨酸尾，以便有利于其編碼蛋白的純化。不過，這些改變僅僅被示為是例子，因?yàn)檫€可以使用其他5’、3’、或內(nèi)部修飾來優(yōu)化表達(dá)蛋白的表達(dá)，穩(wěn)定性以及選擇性地，純化。還希望在植物組織中表達(dá)編碼具有抗原特性的片段的所述PRRS病毒的需要的ORF基因的片段或部分。為了證實(shí)本發(fā)明，舉例說明了編碼源于PRRS病毒的ORF5蛋白的天然和合成基因。例如，該合成基因具有序列1的核苷酸序列(還可參見圖1)，不過，編碼PRRS病毒的ORF’s或這些ORF’s的組合的其他基因可以方便地取代所述舉例說明的合成基因(例如，參見圖1)。編碼所述成熟蛋白的合成基因優(yōu)選包括類似于在植物中高水平表達(dá)的基因的密碼子偏倚性，所述蛋白具有一個能進(jìn)行簡單提取的基序，并且所述成熟蛋白被引導(dǎo)至所述細(xì)胞的一個區(qū)室，以便增強(qiáng)該產(chǎn)物的穩(wěn)定性，例如，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)的腔。不過，還涉及其他位點(diǎn)，例如胞外分泌，以便簡化提取方案，或葉綠體或線粒體區(qū)室。在定向引導(dǎo)至ER的情況下，所述表達(dá)產(chǎn)物還要進(jìn)行進(jìn)一步的體內(nèi)加工，包括信號肽的裂解。所述改性的天然或合成基因還包括一個C末端基序，該基序使得所編碼的蛋白滯留在ER中。我們業(yè)已獲得了從在加拿大的養(yǎng)豬場的病害爆發(fā)中分離到的PRRS病毒(PA-8)，并且克隆了該病毒基因組的3’末端的4kb并進(jìn)行了測序(Yoo1997)。該片段含有ORF2-7的完整的編碼序列。ORF5包括600個核苷酸，它編碼一種200個氨基酸的多肽。預(yù)測的ORF5蛋白含有在其N-末端具有一個疏水性信號序列，以及兩個其他疏水性結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域可能是跨膜區(qū)。在前50個氨基酸的片段中還發(fā)現(xiàn)了4個推測的N-連接糖基化位點(diǎn)。為了插入疫苗病毒基因組中，通過工程方法合成了完整的ORF5序列，并且我們能夠構(gòu)建重組疫苗病毒(Yoo1997)。這種重組疫苗病毒攜帶ORF5基因，該基因位于受疫苗病毒晚期啟動子控制的病毒基因組的胸苷激酶基因座上。在用該重組疫苗病毒感染細(xì)胞時，特別鑒定到一種分子量為25kD的多肽。這種肽能與在大腸桿菌中產(chǎn)生的針對ORF5蛋白的單特異性抗體專一性起反應(yīng)。以上結(jié)果表明，ORF5基因是有功能的，并可用于在植物系統(tǒng)中表達(dá)蛋白。不過，可以理解的是，本發(fā)明還涉及源于PRRS病毒的其他推測的ORF’s的使用，并且可以單獨(dú)使用，或者視需要與其他ORF’s組合使用?！盎颉笔侵敢环N特定的核苷酸序列，包括編碼區(qū)或其片段，并選擇性地包括調(diào)節(jié)該基因表達(dá)的啟動子和終止子，以及基因表達(dá)所需的其他位點(diǎn)，例如，聚腺苷酸化信號，由它調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的終止?！熬幋a區(qū)”或“結(jié)構(gòu)基因”是指任何DNA片段，它在遺傳學(xué)轉(zhuǎn)錄和翻譯之后決定多肽的一級結(jié)構(gòu)。另外，還可以視需要使用包括編碼區(qū)或結(jié)構(gòu)基因的感興趣的區(qū)域的片段?！昂铣苫颉笔侵竿ㄟ^化學(xué)方法合成的結(jié)構(gòu)基因的DNA序列。合成基因可以包括感興趣的基因的片段或完整的編碼區(qū)。另外，合成基因還可以包括增強(qiáng)該基因表達(dá)的調(diào)控元件，或有利于該蛋白產(chǎn)物穩(wěn)定性的基序。還希望一種合成基因選擇性地包括可用于分離和純化由所述合成基因編碼的蛋白或蛋白片段的區(qū)。“DNA調(diào)控區(qū)”是指基因組序列上的任何區(qū)，它具有控制與該調(diào)控區(qū)操作連接的DNA序列表達(dá)的特性。所述調(diào)控區(qū)可以包括啟動子或增強(qiáng)子區(qū)，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員所了解的其他調(diào)控元件。“啟動子”是指位于編碼區(qū)5’末端的核苷酸序列或其片段，它含有啟動轉(zhuǎn)錄和調(diào)控轉(zhuǎn)錄速度所需的所有信號。用于舉例說明本發(fā)明的啟動子是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的組合型啟動子。不過，如果需要組織特異性基因表達(dá)的話，例如進(jìn)行種子或葉特異性表達(dá)，則也可以使用對上述組織專一的啟動子。另外，正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的，還可以使用誘導(dǎo)型啟動子，以便在通過提供對誘導(dǎo)表達(dá)的合適刺激誘導(dǎo)表達(dá)之后調(diào)控所述基因的表達(dá)。誘導(dǎo)型啟動子的使用可能是必要的，因?yàn)橛袝r異源蛋白的組成型合成的使用可能是有毒的或者抑制植物的正常生長，其結(jié)果是，只有轉(zhuǎn)化后再生的植物是能以極低水平表達(dá)異源蛋白的植物。在缺少誘導(dǎo)物的條件下所述DNA序列或基因不能轉(zhuǎn)錄。通常，專一性結(jié)合誘導(dǎo)型啟動子以便激活轉(zhuǎn)錄的蛋白因子是以失活形式存在的，然后通過誘導(dǎo)物將其直接或間接轉(zhuǎn)化成活性形式。所述誘導(dǎo)物可以是化學(xué)制劑，如蛋白、代謝物、生長調(diào)節(jié)劑、除草劑或酚化合物或通過熱、冷、鹽或毒粒因子產(chǎn)生的生理學(xué)脅迫或通過諸如病毒的病原體或致病劑的作用間接產(chǎn)生?？梢酝ㄟ^將誘導(dǎo)物異源施加到細(xì)胞或植物上使含有誘導(dǎo)型啟動子的植物細(xì)胞接觸該誘導(dǎo)物，例如通過噴霧、澆灌、加熱或類似方法使用。“組成型啟動子”是指指導(dǎo)一種基因在植物的所有部分表達(dá)并且在植物發(fā)育中連續(xù)表達(dá)的啟動子。已知組成型啟動子的例子包括與CaMV35S轉(zhuǎn)錄物相關(guān)的啟動子和農(nóng)桿菌屬Ti質(zhì)粒胭脂氨酸合酶基因。本發(fā)明的嵌合基因結(jié)構(gòu)還可包括一個3’非翻譯區(qū)。3’非翻譯區(qū)是指一個基因的一部分，包括DNA片段，該片段含有聚腺苷酸化信號和能夠影響mRNA加工或基因表達(dá)的任何其他調(diào)控信號。所述聚腺苷酸化信號的特征通常是完成在mRNA前體的3’末端添加聚腺苷酸尾。聚腺苷酸化信號被普遍認(rèn)為存在與規(guī)范形式5’-AATAAA-3’具有同源性，不過，其變化也是常見的。合適的3’區(qū)的例子是3’轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)，它含有農(nóng)桿菌屬腫瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)?；虻木巯佘账峄盘?，如胭脂氨酸合酶(Nos基因)和植物基因，如大豆儲存蛋白基因，和核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(ssRUBISCO)基因的小亞基。因此，源于本發(fā)明構(gòu)建物的結(jié)構(gòu)基因的3’非翻譯區(qū)可用于構(gòu)建在植物中表達(dá)的嵌合基因。本發(fā)明的基因構(gòu)建物還可以視需要包括其他增強(qiáng)子，翻譯或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子。上述增強(qiáng)子區(qū)對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是眾所周知的，并且可以包括ATG起始密碼子和相鄰序列。所述起始密碼子必須處于編碼序列的讀框內(nèi)，以確保整個序列的翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子可源于多種來源，包括天然和合成來源。翻譯起始區(qū)可以由所述轉(zhuǎn)錄起始區(qū)或所述結(jié)構(gòu)基因的來源提供。所述序列還可源于被選擇用于表達(dá)所述基因的啟動子，并且可以進(jìn)行特別修飾，以便增強(qiáng)mRNA的翻譯。為了有利于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的鑒定，本發(fā)明的構(gòu)建物還可進(jìn)行進(jìn)一步的操作，以便包括植物選擇標(biāo)記。有用的選擇標(biāo)記包括能產(chǎn)生對諸如慶大霉素、潮霉素、卡那霉素等的抗生素的抗性的酶。類似地，還可以使用能產(chǎn)生通過顏色改變鑒定的化合物的酶，如GUS(β-葡糖醛酸酶)或發(fā)光鑒定，如熒光素酶?！稗D(zhuǎn)化”是指遺傳信息的穩(wěn)定的種間轉(zhuǎn)移，這種轉(zhuǎn)移可以通過表型證實(shí)?？梢杂肨i質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電穿孔等將本發(fā)明的構(gòu)建物導(dǎo)入植物細(xì)胞，這些方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。本發(fā)明的一部分還涉及含有本發(fā)明嵌合基因構(gòu)建物的轉(zhuǎn)基因植物。由植物細(xì)胞再生全植株的方法在本領(lǐng)域中是公知的，并且對本發(fā)明來說獲得轉(zhuǎn)化和再生植株的方法已不重要。一般，轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞是在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的，所述培養(yǎng)基可含有諸如抗生素的選擇制劑，而將選擇標(biāo)記用來有利于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的鑒定。一旦形成愈傷組織，可以通過采用合適的植物激素按照已知方法促進(jìn)芽的形成，并將所述芽轉(zhuǎn)移到發(fā)根培養(yǎng)基上，以便再生植株。然后將所述植株用于建立重復(fù)的世代，用種子或用植物繁殖方法建立?！懊艽a子優(yōu)化”是指選擇合成寡核苷酸結(jié)構(gòu)模塊的合適的DNA核苷酸，以及隨后的結(jié)構(gòu)基因或其片段的酶促組裝，以便接近植物體內(nèi)的密碼子使用。有關(guān)文獻(xiàn)中披露了用密碼子優(yōu)化構(gòu)建合成基因的方法，該方法局限于細(xì)菌基因，如蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringeinsus)殺昆蟲晶體蛋白的細(xì)菌基因和兩種昆蟲基因(有關(guān)綜述參見Kozeil等1996)。該方法成功應(yīng)用于細(xì)菌基因(例如，Adang等1996，Sardana等1996)。密碼子優(yōu)化的昆蟲基因?qū)λ鲎兓瘺]有反應(yīng)，并且隨后證實(shí)了需要糾正細(xì)胞定向使得由于密碼子優(yōu)化產(chǎn)生的所有改進(jìn)黯然失色(Hightower等1994，F(xiàn)lorack等1995)。業(yè)已證實(shí)，ER保留信號可顯著提高二硫鍵結(jié)合的轉(zhuǎn)基因蛋白的濃度，因此，通過定點(diǎn)誘變將KDELER滯留基序添加到ORF5cDNA的3’末端(Schouten等1996，Kunkel1985)。盡管業(yè)已發(fā)現(xiàn)針對ER的腔的蛋白的源于小鼠的某些天然信號能在植物中正確起作用，但并不是在任何情況下都能夠確保如此，不過，使用PR1b信號序列能確保異源蛋白的正確定向，并且在某些場合下使用植物信號可提高轉(zhuǎn)基因蛋白濃度(Schouten等1996，Horack等1995，Denecke等1990)。尚沒有報導(dǎo)披露在包括本文所披露的元件的組合的植物中表達(dá)異源基因，所述組合包括使用天然植物ER定向信號，密碼子優(yōu)化和ER滯留基序以及相同的合成基因?！癘RF5蛋白”是指存在于Arterivirus家族成員中的兩種已知跨膜外膜糖蛋白中的一種。為了使表達(dá)水平和轉(zhuǎn)基因蛋白產(chǎn)量最大，在DNA水平上檢測ORF5基因，然后優(yōu)化其編碼區(qū)，以便在植物中表達(dá)，使用類似于由Sardana等1996年披露的方法。密碼子使用的標(biāo)準(zhǔn)誤差(密碼子使用偏倚性的指標(biāo))是通過如下方法計(jì)算的首先求出天然ORF5基因的每一個密碼子相對高水平表達(dá)的植物基因的使用的比例偏差的平方，然后計(jì)算平均方差。所使用的公式為SDCU=Σn=1N[(Xn-Yn)/Yn]2/N]]>其中Xn表示密碼子n在高水平表達(dá)的植物基因中的使用頻率，而Yn表示密碼子n在感興趣的基因中的使用頻率，而N表示在感興趣的基因中密碼子的總數(shù)。使用Murray等(1989)的數(shù)據(jù)編制雙子葉植物的高水平表達(dá)基因的密碼子使用表。本發(fā)明合成PRRS病毒ORF5基因的組裝是通過本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行的。為了加強(qiáng)在植物中的表達(dá)而設(shè)計(jì)的ORF5前蛋白是通過酶促方法用化學(xué)合成的寡核苷酸雙鏈片段組裝在DNA載體上。然后用本領(lǐng)域已知方法將所述合成PRRS病毒ORF5基因轉(zhuǎn)入植物基因組。還要涉及的是可以根據(jù)需要和具體情況用多種方法給動物服用含有異源蛋白的轉(zhuǎn)基因植物。例如，如果所述蛋白是口服使用的話，可以收獲所述植物組織并直接喂給動物，或者在喂養(yǎng)之前將收獲的組織干燥，或者在不進(jìn)行事先收獲的情況下讓動物食用所述植物。將所述收獲的植物組織作為動物飼料的飼料添加劑使用也屬于本發(fā)明的范圍。另外，從轉(zhuǎn)基因植物獲得的蛋白可以在用作飼料添加劑之前提取，提取成粗制、部分純化、或純化形式。給豬服用上述任何形式的蛋白會導(dǎo)致保護(hù)動物不受PRRS病毒影響的抗體的產(chǎn)生。計(jì)算密碼子使用的標(biāo)準(zhǔn)誤差(SDCU)，其結(jié)果為87.0。如圖1(序列1)所示，當(dāng)用植物中更常用的密碼子代替罕見的密碼子時，SDCU降低4倍達(dá)到20.6。通過組裝3個各自為大約200bp的DNA模塊(模塊Ⅰ、模塊Ⅱ、和模塊Ⅲ參見圖1和2，以及圖4所示序列；圖4中的引物1-12分別是序列鑒定號2-13)構(gòu)建所述合成ORF5基因。每一個模塊含有在5’和3’末端突出的限制位點(diǎn)，以便用于通過標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行克隆，并容許連接該合成模塊，以便形成完整的ORF5編碼區(qū)。完整的ORF5編碼區(qū)含有5’NcoⅠ和BamHⅠ限制位點(diǎn)，以及3’BspHⅠ和KpnⅠ限制位點(diǎn)。通過使用植物中高水平表達(dá)基因常用的密碼子設(shè)計(jì)長度大約為60-90bp的重疊寡核苷酸，構(gòu)建ORF5合成基因的單個模塊(圖3)。在94℃下將寡核苷酸(各自為100皮摩爾)的中央配對變性1分鐘，用35分鐘時間冷卻到60℃以便退火，在60℃下保持5分鐘，在此期間添加5.25個單位的ExpandDNA聚合酶(BoehringerMannheim)。然后用5分鐘時間將該反應(yīng)混合物加熱到68℃，并在68℃下進(jìn)行2小時的補(bǔ)平反應(yīng)。將10微升所得到的雙鏈DNA片段用作PCR擴(kuò)增的模板，使用10皮摩爾的5’和3’的引物，和5.25個單位的ExpandDNA聚合酶，350微摩爾dNTP’s，1.75毫摩爾氯化鎂。然后用標(biāo)準(zhǔn)方法對擴(kuò)增的DNA片段進(jìn)行凝膠純化。按照生產(chǎn)商推薦的方法將相當(dāng)于模塊Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的PCR片段導(dǎo)入pGEMTEasy克隆載體中。通過用相當(dāng)于在所述片段的5’和3’末端導(dǎo)入的酶位點(diǎn)的限制酶消化將模塊Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ從pGEMTEasy載體上切除。通過連續(xù)的克隆步驟將所述片段組裝成完整的合成基因，組裝到pBluescript(KS+)克隆載體上。例如，通過分別用BamHⅠ和HindⅢ、HindⅢ和XbaⅠ，XbaⅠ和KpnⅠ消化將模塊Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ從所述載體上釋出。將模塊Ⅱ和Ⅲ同時導(dǎo)入用HindⅢ和KpnI消化過的pBluescript中(三聯(lián)連接)上。然后用BamHⅠ和HindⅢ消化該載體(pBS23)，并加入模塊Ⅰ以便完成所述合成基因。由于ORF5信號序列將所述蛋白正確引導(dǎo)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)的腔中的能力尚不清楚，用獲自煙草光合相關(guān)蛋白1b(PR1b)信號序列的推測的信號序列取代ORF5基因上的前29個氨基酸。所述取代是通過設(shè)計(jì)兩種其他引物用于構(gòu)建密碼子優(yōu)化的ORF5基因的模塊Ⅰ而進(jìn)行的。這兩種引物的一個例子如圖3所示(序列鑒定號2和3；還可參見圖4的模塊Ⅰ中的引物1-4)。對兩種合成基因(一種具有PR1b信號另一種具有天然信號)進(jìn)行比較，并發(fā)現(xiàn)PR1b信號會導(dǎo)致以較高水平合成蛋白(資料未提供)。為了有利于從植物組織中純化ORF5蛋白，在所述天然蛋白序列的末端和KDEL基序的開始部分之間插入C末端凝血酶裂解位點(diǎn)和組氨酸尾(NOVAGEN，劍橋)。通過修飾用于構(gòu)建模塊Ⅲ的合成寡核苷酸加入該序列。因此，制備的基因結(jié)構(gòu)包括PR1b序列，模塊Ⅰ-Ⅲ(合成ORF5)，裂解位點(diǎn)HIS標(biāo)志，和KDEL基序。對所述合成的PRRS病毒ORF5基因進(jìn)行測序，并發(fā)現(xiàn)其編碼與天然ORF5基因相同的蛋白。所不同的是可根據(jù)情況添加PR1b序列，HIS標(biāo)志序列，或KDEL基序。將重復(fù)的35S增強(qiáng)子-啟動子+AMV前導(dǎo)序列(Kay等1987；Jobline和Gehrke1987)和源于煙草的p1275組成型啟動子系統(tǒng)(B.L.MikiWO97/282268)用于構(gòu)建包括所述合成ORF5基因的載體。對于重復(fù)的35S和p1276表達(dá)系統(tǒng)來說，將天然的和密碼子優(yōu)化的ORF5基因作為Nco1-BamHⅠ片段插入僅靠所述啟動子的下游，并位于T-DNA臂序列之間。根據(jù)其組成元件將重復(fù)的35S載體命名為pCAMTerX-ORF5A或pCAMTerX-ORF5BpCAMTerX-ORF5A包括天然ORF5基因；pCAMTerX-ORF5B含有所述合成ORF5成熟蛋白編碼區(qū)，PR1b信號序列和KDELER滯留基序；由于35S啟動子已知是在苜蓿中表達(dá)的(Maggio等1996)，還用“Purdue超級啟動子”對于表達(dá)合成ORF5基因制備一套平行的構(gòu)建物(Ni等1995，植物雜志，7卷；661-676頁)。所述超級啟動子使用農(nóng)桿菌屬章魚氨酸和甘露氨酸合酶啟動子和激活物的亞域啟動異源基因在植物中的高水平組成型表達(dá)。將天然ORF5或合成ORF5基因克隆到源于二元載體pBISN1的pBI101.2上，該載體攜帶所述超級啟動子，以便產(chǎn)生pPSP-ORF5A和pPSP-ORF5BpPSP-ORF5A包括所述天然基因，pPSP-ORF5B含有合成的ORF5A成熟蛋白編碼區(qū)，PR1b信號序列和KDELER滯留基序。將所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)入攜帶無臂Ti質(zhì)粒pEHA104的農(nóng)桿菌屬菌株EHA105中。位于該質(zhì)粒上的植物選擇標(biāo)記是新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(nptⅡ，VandenElzen等1985)。只將最好的表達(dá)構(gòu)建物與p1275啟動子一起使用，得到載體p12760RF5。為了制備載體p12760RF5，用5’NcoⅠ和3’BspMⅠ裂解合成的ORF5基因，并連接到pRND400二元載體上，該載體含有位于NcoⅠ限制位點(diǎn)上游的p1275啟動子。位于該基因3’末端的BspHⅠ突出端和NcoⅠ限制位點(diǎn)是相容的，并且連接在一起之后可破壞這兩個位點(diǎn)。將ORF5基因?qū)胫参锘蚪M然后用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法用農(nóng)桿菌屬介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化將各種合成的ORF5基因構(gòu)建物轉(zhuǎn)化入煙草(Horsch等1989)。將源于品種81-V9的體外無菌生長的低煙堿煙草植物用作原始材料。與來自溫室生長植物的葉片相比，無菌體外材料的使用可降低由于污染造成的損失。為了進(jìn)行轉(zhuǎn)化，用解剖刀將切除了中脈的葉片材料切成1平方厘米的片段，并使上皮一側(cè)向下放在含有MS鹽、B5維生素、3％蔗糖、1mg/lBAA(6-芐基氨基嘌呤)和0.1mg/lNAA(α-萘乙酸)的固體培養(yǎng)基(培養(yǎng)基1)上預(yù)培養(yǎng)2天。將生長在LB培養(yǎng)基中的過夜培養(yǎng)物稀釋大約50％，然后用各自含有包括上面鑒定的五種構(gòu)建之一的載體的農(nóng)桿菌屬菌株進(jìn)行感染。將葉片外殖體快速浸入(大約30秒)，并放在Whatman2號濾紙上吸印，去掉多余的細(xì)菌。然后將其送回培養(yǎng)基1上培養(yǎng)2天。為了抑制細(xì)菌生長，并開始轉(zhuǎn)化組織的選擇，將所述外殖體轉(zhuǎn)移到含有500微克/毫升羧噻吩毒霉素-棒酸復(fù)合劑(SmithKlineBeecham，Oakville)和選擇劑，100微克/毫升卡那霉素(Sigma，St.Louis)的培養(yǎng)基上。每隔2-3周將所述外殖體轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上，在3-5周內(nèi)開始出現(xiàn)芽。一旦形成明確的莖，將所述芽切除，并轉(zhuǎn)移到裝有由MS鹽、B5維生素、3％蔗糖、500μg/ml頭孢氨噻或羧噻吩青霉素-棒酸復(fù)合劑和100μg/ml卡那霉素組成的固體培養(yǎng)基的Magenta盒中。在根形成之后，將推測的轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)移到溫室中。為了確保每一個植物是由獨(dú)立的轉(zhuǎn)化過程產(chǎn)生的，在該方法的初期將所述外殖體分裂成單獨(dú)的片段，并且從每一個片段中僅選擇一個芽。為了進(jìn)行苜蓿轉(zhuǎn)化，制備攜帶輔助質(zhì)粒pMP90和pBISN10RF5A-E五種二元載體中的一個的根癌農(nóng)桿菌菌株C58C1的過夜液體培養(yǎng)物。將所述細(xì)菌繼代到新的液體培養(yǎng)基中，并在光學(xué)密度=1.0時使用該培養(yǎng)物。從溫室生長的苜蓿植物上收獲幼小葉柄(每個莖上的3個最小的葉柄)，并通過在75％的乙醇中浸泡30秒然后在4％的次氯酸鈣中浸泡20分鐘進(jìn)行消毒，然后將所述葉柄放在無菌水中漂洗，3次更換無菌水，并切成長度為1厘米的片段。將所述葉柄片段浸入農(nóng)桿菌屬培養(yǎng)物中1分鐘，從細(xì)菌培養(yǎng)物中取出，并直接放置到誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含有100微摩爾乙酰丁香酮，無抗生素)上，并在25℃下在黑暗中培養(yǎng)2天。然后將所述葉柄在無菌的1/2濃度的MS鹽溶液(Sigma，pH5.8)中浸泡2分鐘，并轉(zhuǎn)移到含有500毫克/升頭孢氨噻和50毫克/升卡那霉素的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。大約每隔10-14天將所述葉柄轉(zhuǎn)移到新的平板上。在幾周之后，出現(xiàn)小的愈傷組織，保留愈傷組織直到形成體細(xì)胞胚。將所述胚放在1/2含有50毫克/升卡那霉素和1％(w/v)蔗糖MS培養(yǎng)基(pH5.8)上發(fā)芽。將綠色長形的胚分別轉(zhuǎn)移到發(fā)芽培養(yǎng)基上，不附帶任何愈傷組織，然后放置在該培養(yǎng)基上直到根、芽和葉形成。然后將單獨(dú)的小植株種植到花盆中的土壤中，并轉(zhuǎn)移到溫室中進(jìn)一步生長。用對所述轉(zhuǎn)基因的5’和3’末端專一的引物通過PCR篩選每一個推測的轉(zhuǎn)基因煙草和苜蓿植物中所述轉(zhuǎn)基因的存在(參見圖4)。例如，圖1的轉(zhuǎn)基因可使用具有下列序列的引物上游引物5’GCAAATGCCTCAAACGATTCAAGC3’，(溫度60℃)；和下游引物3’TCTCAAAGTCGCCTTGTTACCCC5’(溫度59℃)，不過，還可以使用其他引物組合(其他引物參見圖4)。用標(biāo)準(zhǔn)方法從植物組織中提取DNA，并進(jìn)行30輪次的擴(kuò)增，擴(kuò)增使用15皮摩爾的兩種引物，100mMdNTP’s，2mM氯化鎂，一個單位Taq聚合酶和50ng的DNA模板。用不會裂解T-DNA臂內(nèi)部的限制酶消化源于陽性植物的DNA，并用需要的轉(zhuǎn)基因作為探針進(jìn)行Southern分析。通過標(biāo)準(zhǔn)方法用50μCi的[α32P]CTP隨機(jī)標(biāo)記探針。所有洗滌是在高嚴(yán)格條件下進(jìn)行的。從含有天然ORF5基因的轉(zhuǎn)基因植物中分離RNA，并用逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)或Northern分析(參見表1)進(jìn)行分析。為了進(jìn)行RT-PCR，首先用不合RNase的Dnase處理10微克RNA，將其中的2微克用于cDNA合成。將寡聚dT(12-18)05.μg與RNA混合，并加熱到90℃，讓其冷卻到70℃，然后在冰上冷卻。第一股鏈的合成是在42℃下在含有10mMDTT，0.5mMdNTP，50mMTris-HCl，pH8.3，75mM氯化鉀，3mM氯化鎂和200個單位的上標(biāo)轉(zhuǎn)錄Ⅱ逆轉(zhuǎn)錄酶(GibcoBRL生命技術(shù)公司)的緩沖液中進(jìn)行50分鐘。在70℃下加熱15分鐘使所述酶熱失活。然后按上述方法用2微升的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)物作為模板和對ORF5專一的引物進(jìn)行PCR。在檢驗(yàn)過的30個植株中的27個中檢測到ORF5的轉(zhuǎn)錄物。通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用從含有天然或合成ORF5基因的轉(zhuǎn)基因植物中提取的20微克RNA進(jìn)行Northern印跡分析。與在同一個印跡上電泳的λHindⅢ片段相比，在Northern印跡上檢測到的轉(zhuǎn)錄物(參見圖5A-D)對于天然ORF5來說其大小為1200-1400堿基，而對于合成ORF5來說為1500-1800堿基。上述估計(jì)的大小大于天然基因(602bp)或合成基因(752bp)，這可能是因?yàn)榫哂衼碜詥幼?例如35SCaMV，250bp)，終止子(nos終止子250bp)，和polyA尾(長度未知)的附加序列。為了增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因表達(dá)并確保在表達(dá)水平選擇到具有穩(wěn)定大田性狀的大量的(25-30)初級轉(zhuǎn)化體，篩選拷貝數(shù)，并對單拷貝高表達(dá)品系進(jìn)行大田性狀評價。用標(biāo)準(zhǔn)方法(例如，Northern和Western印跡，Sambrook等1989)評價表達(dá)水平。如上文所述，通過PCR篩選30個含有天然ORF5基因的轉(zhuǎn)化體和23個含有合成ORF5基因的轉(zhuǎn)化體，并通過RT-PCR(僅適用天然ORF5基因)和Northern印跡分析進(jìn)行分析。還對用pPSP-ORF5A轉(zhuǎn)化的煙草植物進(jìn)行Northern分析。用對ORF5表達(dá)產(chǎn)物專一的多克隆抗血清通過Western分析檢測上述轉(zhuǎn)基因煙草植物中的8個的蛋白表達(dá)。所述抗體是從豬體內(nèi)獲得的。在上述含有PSP-ORF5A構(gòu)建的植物中，發(fā)現(xiàn)有7個表達(dá)ORF5基因產(chǎn)物(圖6)。表1含有天然ORF5的轉(zhuǎn)基因植物的分析總結(jié)<tablesid="table1"num="001"><table>轉(zhuǎn)基因植物PCR篩選逆轉(zhuǎn)錄PCRNorthern分析A陽性陽性陽性B陽性陽性陽性C陽性陽性陽性D陽性陽性陽性</table></tables>用ELISA對轉(zhuǎn)基因蛋白產(chǎn)量進(jìn)行定量。用在大腸桿菌中合成的GST-ORF5融合蛋白在兔體內(nèi)產(chǎn)生ORF5蛋白的單特異性多克隆抗體。另外，還制備了在豬體內(nèi)抗全PRRS病毒的多克隆抗體。將這兩個抗體用于蛋白表達(dá)研究，并用于蛋白定量的ELISA。ORF5蛋白純化在液氮和1×結(jié)合緩沖液中快速冷凍5克源于轉(zhuǎn)基因煙草植物的葉片組織，通過米拉布過濾，以500×g的速度離心5分鐘，通過0.45微米膜再次過濾。讓濾液通過含有His-BindNi2+樹脂的層析柱，并用10倍體積的結(jié)合緩沖液洗滌，然后用6倍體積的洗滌緩沖液洗滌。然后用6倍體積的洗脫緩沖液將ORF5蛋白洗滌液從所述柱上洗脫，在液氮中快速冷凍，并在-70℃下保存待用。動物的免疫實(shí)驗(yàn)為了在動物體內(nèi)用在植物中產(chǎn)生的重組ORF5蛋白引起保護(hù)性免疫反應(yīng)，可以考慮兩種施用途徑肌內(nèi)施用和口服。肌內(nèi)施用用ORF蛋白提取物對4組豬進(jìn)行免疫，每一組有3只動物。所述4組由用苜?；驘煵莸恼Ｖ参锾崛∥锩庖叩膬蓚€對照組，一個用苜蓿-ORF5蛋白免疫的組，和一個用煙草ORF5蛋白免疫的組組成，在第一次免疫之前將動物放血，并測定對PRRS病毒的免疫前抗體效價。將抗原與油基佐劑混合，每只動物使用大約100微克的ORF5蛋白進(jìn)行肌內(nèi)免疫，每隔3周免疫1次，共免疫3次。在免疫之后3周、6周、和8周采集外周血樣，然后檢查對ORF5蛋白和PRRS病毒有反應(yīng)的特異性抗體的形成?？诜弥参锂a(chǎn)生的ORF5蛋白使動物對PRRS病毒免疫的口服方法基于普通粘膜免疫系統(tǒng)的概念。業(yè)已證實(shí)，在身體的粘膜部位，特別是在腸道上誘導(dǎo)的免疫性能夠通過所述普通粘膜免疫系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到身體的遠(yuǎn)側(cè)粘膜部位(綜述文獻(xiàn)參見Kagnoff，1996)。在人體內(nèi)，腺病毒感染呼吸道會導(dǎo)致急性呼吸道疾病。這種疾病在軍人中被特別稱為急性呼吸病(ARD)。業(yè)已開發(fā)了腺病毒疫苗，并且在美國軍隊(duì)中用作預(yù)防ARD的口服疫苗已有40年時間。業(yè)已證實(shí)該方法通過口服疫苗抗原能在呼吸道中非常有效地誘導(dǎo)粘膜免疫性。由于PRRS病毒在豬體內(nèi)的初次感染部位是呼吸道，為了有效預(yù)防感染在呼吸道中誘導(dǎo)中和抗體反應(yīng)是非常重要的。通過在豬體內(nèi)的腸道部位服用ORF5抗原，可以在呼吸道部位誘導(dǎo)有效的免疫性，因此預(yù)防PRRS病毒感染。將4組豬，每組3只動物，用于飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。兩組動物通過口服食用正常植物(煙草和苜蓿)，另兩組動物食用表達(dá)ORF5蛋白的轉(zhuǎn)基因植物。在免疫之后3周和6周從所述動物體內(nèi)采集血樣，以便監(jiān)測其循環(huán)系統(tǒng)中的抗體反應(yīng)。還可以在腸道和呼吸道中檢查抗體反應(yīng)。當(dāng)血清中出現(xiàn)抗體效價時，將所述動物宰殺，并收集腸道洗液和肺洗液，用于分泌抗體分析。特異性抗體分析通過酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)分析血清樣品中ORF5蛋白的特異性抗體的存在。在組織培養(yǎng)物中生長PRRS病毒，并通過不連續(xù)的蔗糖梯度離心純化。將病毒抗原包被在ELISA平板上，并進(jìn)行IgG檢測ELISA。還通過噬斑減少中和實(shí)驗(yàn)檢查所述血清樣品中和病毒感染性的能力。檢查肺洗液和腸洗液中分泌IgA抗體的存在和中和效價。為了檢測IgA抗體，將PRRS病毒包被的平板與各種稀釋比例的腸洗液或肺洗液一起培養(yǎng)，并將抗原-抗體復(fù)合物與二級抗豬IgA抗體一起培養(yǎng)。加入抗二級抗體綴合物和生色底物，以便形成顏色。還通過PRRS病毒噬斑減少實(shí)驗(yàn)檢查了分泌的IgA中和病毒的能力。本文所引用的所有文獻(xiàn)均被收作參考文獻(xiàn)。業(yè)已結(jié)合優(yōu)選實(shí)施方案對本發(fā)明進(jìn)行了說明。不過，對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說顯而易見的是，在不脫離下面的權(quán)利要求書所述的本發(fā)明的范圍的前提下可以作出多種改變和改進(jìn)。參考文獻(xiàn)AdangMJ，RocheleauTA，MerloDJ，MurrayEE(1996)合成殺昆蟲晶體蛋白基因。美國專利5,567,862。AlbinaE，MadecF，CarioletR，和TorrisonJ.(1994)豬生殖和呼吸綜合征病毒在受感染豬和農(nóng)場單位的免疫反應(yīng)和持續(xù)性。VetRec134567-573。Anonymous(1990)國內(nèi)養(yǎng)豬場3530。Anonymous(1992)豬傳染病新聞1353N。Anonymous(1995)確定孟山都加拿大公司的綜合除草劑抗性canola品系GT73的環(huán)境安全性。決議文件DD95-02，加拿大農(nóng)業(yè)和農(nóng)產(chǎn)品，渥太華。ChaplinJF(1977)在煙草中育成不同的煙堿含量。美國化學(xué)協(xié)會會刊，173屆會議，新奧爾良，LA。ChristiansonWT，和JooHS.(1994)。豬生殖和呼吸綜合征綜述。豬保健品210-28。DalsgaardK等(1997)預(yù)防目標(biāo)動物得病毒病的由植物產(chǎn)生的疫苗。國內(nèi)生物技術(shù)。15248-252。DeaSA，BilodeauRA，AthanassiousR，SauvageauRA，和MartineauGP.(1992)。在魁北克的豬流行性流產(chǎn)和呼吸綜合征與在血清學(xué)上和Lelystad病毒有關(guān)的病毒相關(guān)。Proc12thCongrIntlPigVetSoc1116。DeneckeJ，BottremanJ，DeblaereR(1990)植物細(xì)胞中的蛋白分泌可以通過缺陷途徑進(jìn)行。植物細(xì)胞251-59。DieryckW，PagnierJ，PoyartC，MardenMC，GruberV，BournatP，BaudinoS，和MerotB(1997)源于轉(zhuǎn)基因煙草的人血紅蛋白。自然38629-30。Du等。植物細(xì)胞報導(dǎo)199413330Ferullo等。作物科學(xué)1996361011FlorackD，AllefsS，BollenR，BoschD，VisserB，StiekemaW(1995)在煙草中表達(dá)天蠶蛾殺菌肽B基因。Trans.Res.4132-141。GoddjinOJM，和PenJ(1995)作為生物反應(yīng)器的植物。TIBTECH13379-387。HaqTA，MasonHS，ClementsJD，和ArntzenCJ(1995)用在植物中產(chǎn)生的重組細(xì)菌抗原進(jìn)行口服免疫。科學(xué)268714-716。Horsch，R.B.，F(xiàn)ry，J.E.，Hoffman，N.L.，Eicholtz，D.，Rogers，S.G.，和Fraley，R.T.(1985)將基因轉(zhuǎn)入植物的簡單的通用方法?？茖W(xué)2271229-1231。JobiingSA，和GehrkeL(1987)含有植物病毒非翻譯前導(dǎo)序列的嵌合信使RNA的強(qiáng)化翻譯。自然325622-625。KagnoffMF(1996)粘膜免疫學(xué)新境界。今日免疫學(xué)171-7-59。KaffaberKK(1989)未知病因的生殖缺陷。AmerAssSwinePracNewsletter。11-10。KayR，ChanA，DalyM，和McPhersonJ(1987)重復(fù)35S啟動子序列產(chǎn)生植物基因的強(qiáng)的增強(qiáng)子?？茖W(xué)2361299-1302。KenwardK(1995)在轉(zhuǎn)基因煙草中表達(dá)魚抗凍蛋白基因以提高抗凍性，并作為分子農(nóng)業(yè)的模型。博士論文(Queens大學(xué)，波士頓)KunkelTA(1985)不進(jìn)行表型選擇的快速和有效的位點(diǎn)專一型誘變。ProcNatlAcadSci82488-492LefebvreDD，MikiBL，和LaliberteJF(1987)哺乳動物金屬硫蛋白在植物中的功能。生物/技術(shù)51053-1056。LoulaT(1991)。神秘的豬疾病。Agri-pract1223-34。MaJKC，HiattA，HeinM，VineND，WangF，StabilaP，vanDolleweerdC，MostovK，和LehnerT(1995)分泌抗體在植物中的產(chǎn)生和組裝。科學(xué)268716-719。MaJKC，和HeinMB(1995)在植物中產(chǎn)生的抗體的免疫治療潛力TIBTECH13522-527。Maggio等1996植物分子生物學(xué)報導(dǎo)14(3)249MasonHS，Ba11JM，ShiJJ，JiangX，EstesMK，和ArntzenCJ(1996)Norwalk病毒衣殼蛋白在轉(zhuǎn)基因煙草中的表達(dá)及其植物口服免疫原性。ProcNatlAcadSci935335-5340。MasonHS，LamDMK，和ArntzenCJ(1992)在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)乙型肝炎表面抗原。ProcNatlAcadSci8911745-11749。Meredith，MJ(1995)豬生殖和呼吸綜合征。豬信息中心，劍橋大學(xué)。MieleL(1997)作為生物藥物主的植物生物反應(yīng)器管理因素。TIBTECH1545-50。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法，其中，所述修飾包括用異源信號序列取代天然信號序列。6．如權(quán)利要求5的方法，其中，所述異源信號序列是PR1b序列。7．如權(quán)利要求4的方法，其中，所述修飾包括ER滯留基序。8．如權(quán)利要求4的方法，其中，所述修飾包括裂解位點(diǎn)。9．如權(quán)利要求7的方法，其中，所述修飾還包括HIS標(biāo)志。10．如權(quán)利要求3的方法，其中，所述合成基因序列是修飾過的，以便增強(qiáng)所述基因在植物組織中的表達(dá)和穩(wěn)定性。11．如權(quán)利要求10的方法，其中，所述天然基因序列是修飾過的，以便增強(qiáng)所述基因的表達(dá)和所述蛋白在植物組織中的穩(wěn)定性。12．如權(quán)利要求10的方法，其中，所述修飾包括用異源信號序列取代所述天然信號序列。13．如權(quán)利要求12的方法，其中，所述異源信號序列是PR1b序列。14．如權(quán)利要求10的方法，其中，所述修飾包括ER滯留基序。15．如權(quán)利要求10的方法，其中，所述修飾包括裂解位點(diǎn)。16．如權(quán)利要求15的方法，其中，所述修飾還包括HIS標(biāo)志。17．如權(quán)利要求1的方法，其中，所述基因編碼ORF5蛋白。18．如權(quán)利要求1的方法，其中，所述植物是煙草植物。19．如權(quán)利要求1的方法，其中，所述植物是苜蓿植物。20．如權(quán)利要求1的方法，其中，所述蛋白是從收獲的植物組織中提取并純化的。21．一種分離的DNA分子，包括序列鑒定號1所示序列。22．一種含有權(quán)利要求21所述DNA分子的載體，所述DNA操作地與啟動子、增強(qiáng)子和終止子區(qū)結(jié)合。23．一種含有權(quán)利要求22所述載體的植物。24．一種通過權(quán)利要求1的方法生產(chǎn)的蛋白。25．一種通過權(quán)利要求20的方法生產(chǎn)的蛋白。26．一種使豬對豬生殖呼吸綜合征免疫的方法，包括ⅰ)用權(quán)利要求22的載體轉(zhuǎn)化植物；ⅱ)生長所述轉(zhuǎn)化植物；ⅲ)用所述轉(zhuǎn)化植物的組織喂養(yǎng)豬；ⅳ)視需要重復(fù)步驟ⅲ)。27．如權(quán)利要求26的方法，其中，用所述轉(zhuǎn)化植物的組織喂養(yǎng)豬的步驟包括喂給未收獲的組織。28．如權(quán)利要求26的方法，其中，在步驟ⅲ)之前，收獲所述植物組織，并用收獲的組織喂養(yǎng)所述豬。29．一種使豬對豬生殖呼吸綜合征免疫的方法，包括ⅰ)用權(quán)利要求22的載體轉(zhuǎn)化植物；ⅱ)生長所述轉(zhuǎn)化植物；ⅲ)收獲所述轉(zhuǎn)化植物，以便獲得收獲的組織；ⅳ)從所述收獲組織中提取由所述DNA分子編碼的蛋白；ⅴ)給所述豬服用所述蛋白；ⅵ)視需要重復(fù)步驟ⅴ)。30．如權(quán)利要求29的方法，其中，在步驟ⅴ)中，作為食品添加劑或作為注射劑給豬施用所述蛋白。31．如權(quán)利要求1的方法，其中，從所述轉(zhuǎn)化植物中收獲組織，以便獲得收獲的組織。32．如權(quán)利要求31的方法，其中，所述蛋白是從所述收獲的組織中提取的。33．一種分離的DNA分子，包括序列鑒定號2所示序列。34．一種分離的DNA分子，包括序列鑒定號3所示序列。35．一種分離的DNA分子，包括序列鑒定號4所示序列。36．一種分離的DNA分子，包括序列鑒定號5所示序列。37．一種分離的DNA分子，包括序列鑒定號6所示序列。38．一種分離的DNA分子，包括序列鑒定號7所示序列。39．一種分離的DNA分子，包括序列鑒定號8所示序列。40．一種分離的DNA分子，包括序列鑒定號9所示序列。41．一種分離的DNA分子，包括序列鑒定號10所示序列。42．一種分離的DNA分子，包括序列鑒定號11所示序列。43．一種分離的DNA分子，包括序列鑒定號12所示序列。44．一種分離的DNA分子，包括序列鑒定號13所示序列。全文摘要披露了一種用于制備豬生殖和呼吸綜合征病毒蛋白的方法。該方法包括獲得編碼所需蛋白的基因,然后將該基因插入適于轉(zhuǎn)化植物的載體中,并用該載體轉(zhuǎn)化植物。在所述轉(zhuǎn)化植物生長之后,可以收獲所需要的組織,并從所收獲的組織中提取所述蛋白。本發(fā)明還涉及對豬進(jìn)行抗豬生殖呼吸綜合征免疫的方法,包括收獲所述轉(zhuǎn)化的植物,以便獲得收獲的組織,并用所述收獲的組織喂養(yǎng)豬,或者從收獲的組織中提取所述蛋白,并作為飼料添加劑或作為注射劑給豬施用所述蛋白。不過,如果需要還可以在收獲之前直接用所述植物組織喂養(yǎng)。文檔編號C07K14/08GK1295618SQ99804564公開日2001年5月16日申請日期1999年1月27日優(yōu)先權(quán)日1998年1月27日發(fā)明者R·賴默森,J·張,D·尤,L·艾利森,J·布蘭德勒申請人:加拿大農(nóng)業(yè)及農(nóng)業(yè)食品部,圭爾夫大學(xué)