專利名稱：翼首草總苷提取物及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種翼首草總苷提取物及其制備方法和用途，屬于藥物領域。
背景技術：
類風濕關節炎(Rheumatiod Arthritis,簡稱RA)是一種常見的以慢性多關節炎病變為主要表現的全身性免疫性疾病，全世界共有上億病人。據統計，RA國外的患病率為 I 2%，個別地區高達5% ;我國發病率約為O. 74%，現有病人1000萬人左右。據調查表明，在正常人群中，類風濕性關節炎的發病率占正常人群的O. 35%左右。本病致殘率高，未及時診治的類風濕性關節炎患者二年致殘率50%，三年致殘率達70%。而已經患類風濕性關節炎的患者，平均壽命縮短10 15年，所以RA嚴重影響勞動能力，研制RA的治療藥物， 對于緩解該類疾病的臨床癥狀，提高病人的生存質量，保障生產力，具有積極的意義。藏藥翼首草，為川續斷科植物匙葉翼首草Pterocephalus hookeri (C. B. Clarke) Hoeck的干燥全草，具有清熱解毒、祛風濕、止痛功效。翼首草為藏醫常用藏藥，又名“榜姿毒烏”，為藏藥特征明顯的典型民族藥物，用藥歷史悠久，藏醫歷來將其主要用于治療風濕性等疾病，除藏醫及其密切相關的蒙醫外，中醫藥和其它傳統醫藥基本沒有應用翼首草的歷史。在藏醫藥理論指導下，以翼首草的臨床應用為依據，對翼首草提取物抗風濕性關節炎作用及機理進行了試驗研究，結果表明翼首草提取物抗RA作用是肯定的，對于實驗性佐劑關節炎動物模型原發性炎癥及繼發性關節炎均有較好的抗炎效果，并能減輕滑膜的病理改變，同時也有明顯的鎮痛作用，這與藏醫臨床以翼首草治療風濕、類風濕關節炎應用相吻合。(沈芄，藏藥翼首草抗類風濕性關節炎作用與機理研究，成都中醫藥大學，2002年.)對翼首草的化學成分研究表明，翼首草中主要含有齊墩果烷型三萜類皂苷、環烯醚萜苷類化合物、生物堿、多糖等成分。對翼首草有效成分的研究表明，采用大鼠急性足腫脹實驗、小鼠棉球肉芽腫實驗、小鼠急性耳腫脹實驗和小鼠急性滲出實驗等方法，證明了翼首草正丁醇部位總皂苷具有顯著的抗炎活性[關昕璐，等.翼首草的抗炎作用與急毒實驗研究.北京中醫藥大學學報.2004,27 (2) :71 73]。翼首草中環烯醚萜苷類的主要成分馬錢素，具有明顯的抗炎藥理作用，但其結構類似物具有免疫增強作用。[龐偉.藏藥翼首草的研究與應用·中國民族醫藥雜志.2007，(5) :63-65]。專利申請號200910196870. X， 該發明中提供了翼首草總皂苷有效部位提取物，其主要成分為齊墩果烷型五環三萜皂苷， 總皂苷含量50-90%，該總皂苷提取物能顯著抑制腫瘤細胞增殖，該總皂苷提取物中直接采用大孔樹脂分離得到，提取物中含有環烯醚萜苷。綜合現有文獻可知，目前僅有翼首草中總皂苷及馬錢素具有抗炎鎮痛作用、以及總皂苷抗腫瘤的報道，還未見翼首草總苷提取物治療類風濕性關節炎的活性成分的相關報道。

發明內容
本發明的目的在于提供一種翼首草總苷提取物及其制備方法和用途。本發明的另一目的在于提供了一種治療類風濕性關節炎的藥物組合物。本發明提供了一種翼首草總苷提取物，它來源于川續斷科植物匙葉翼首草 Pterocephalus hookeri (C. B. Clarke)Hoeck的干燥全草,該提取物中，總阜苷和總環烯醚萜苷的總含量不低于50% w/w，其中，含有馬錢苷O. 45-0. 78% w/w，齊墩果酸O. 2-0. 45% w/w,熊果酸 O. 65-1. I % w/w。進一步地，該提取物中，含有馬錢苷O. 6-0. 7% w/w，齊墩果酸O. 3-0. 4% w/w，熊果酸 O. 8-1. 0% w/w。本發明還提供了上述翼首草總苷提取物的制備方法，它包括如下步驟取翼首草，加水煎煮提取，濾過，濾液濃縮后，采用非極性或弱極性大孔吸附樹脂上樣，先以水洗去雜質后，棄去洗脫液；以60-85% v/v乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液后，回收溶劑，干燥，即得翼首草總苷提取物。其中，大孔吸附樹脂為D101、AB-8或HPD-300 ;洗脫用乙醇為65-75% v/v。進一步地，選用DlOl型大孔吸附樹脂；以70% v/v乙醇洗脫。更進一步地，大孔吸附樹脂洗脫的具體操作步驟如下將上樣液的濃度配制為O. 1-0. 2g生藥/ml，采用DlOl型大孔吸附樹脂上樣，上樣流速為l_3BV/h，上樣量以藥材計為藥材樹脂=(O. 5-1. 5) I w/w,以3-5BV水洗脫，流速為l_3BV/h，棄去洗脫液；以2-4BV的70%乙醇洗脫，洗脫流速為2_4BV/h。進一步優選地，將上樣液的濃度配制為O. Ig生藥/ml，采用DlOl型大孔吸附樹脂室溫下上樣，上樣流速為2BV/h，上樣量為樹脂用量的I倍(藥材樹脂=I 1)，以4BV 水洗脫，流速為2BV/h，棄去洗脫液；以3BV的70%乙醇洗脫，洗脫流速為3BV/h。本發明還提供了上述翼首草總苷提取物在制備抗炎、鎮痛或治療類風濕性關節炎的藥物中的用途。本發明還提供了一種治療類風濕性關節炎的藥物組合物，它是由上述的翼首草總苷提取物為活性成分，加上藥學上常用的輔料制備而成的制劑。本發明翼首草總苷提取物具有良好的抗炎鎮痛作用，對機體特異性細胞免疫有一定的抑制效果，并且能夠通過降低類風濕性關節炎的促炎癥因子水平和提高機體抗氧化能力，有效地治療類風濕性關節炎，療效確切，為臨床用藥提供了一種新的選擇。顯然，根據本發明的上述內容，按照本領域的普通技術知識和慣用手段，在不脫離本發明上述基本技術思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。以下通過實施例形式的具體實施方式
，對本發明的上述內容再作進一步的詳細說明。但不應將此理解為本發明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發明上述內容所實現的技術均屬于本發明的范圍。


圖I本發明翼首草提取物有效部位篩選工藝；圖2AA大鼠后肢原發性和繼發性腫脹(左上A :正常組；中上B :模型對照組；右上 C :尼美舒利組；左下D :翼首草總苷提取物高劑量組；中下E :翼首草總苷提取物中劑量組; 右下F :翼首草總苷提取物低劑量組)圖3AA大鼠前肢繼發性腫脹(分組如上圖2)
具體實施例方式實施例I本發明翼首草總苷提取物的制備取翼首草原藥材IOOOg切段，加1600ml水潤濕，6000ml水煎煮提取2次，每次
I.5h，濾過，濾液濃縮后，離心除去沉淀，水提物稀釋至O. Ig生藥/ml藥液，采用DlOl型大孔吸附樹脂室溫下上樣，上樣流速為2BV/h，上樣量為樹脂用量的I倍(藥材樹脂= I I)，以4BV水洗脫，流速為2BV/h，棄去洗脫液；以3BV的70%乙醇洗脫，洗脫流速為 3BV/h，洗脫液減壓回收乙醇至稠膏狀，低溫干燥或冷凍干燥，粉碎，過四號篩，即得總苷提取物。實施例2翼首草總苷提取物的含量檢測一、提取物中總苷的含量測定照比色法(《中華人民共和國藥典》2010版一部附錄VA)測定。對照品溶液的制備取馬錢苷對照品適量，精密稱定，加蒸餾水制成每IOOml中含 6mg的溶液，即得。標準曲線的制備取馬錢苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成60μ g/ml的溶液。 分別精密量取對照品溶液O. 6ml, O. 8ml, I. 0ml, I. 2ml, I. 4ml, I. 6ml至比色管中，揮去溶劑，放冷。依次精密加入新鮮配制的5%香草醛-冰乙酸溶液O. 2ml，高氯酸O. 8ml，于60°C 水浴中加熱顯色15min后，冰浴冷卻5min，分別精密加入冰乙酸5ml混勻，備用。空白溶液的制備同上法。照比色法(《中華人民共和國藥典》2010版一部附錄VA)在535nm的波長處分別測定吸光度，以吸光度做縱坐標，濃度做橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程。測定法精密稱取實施例I制備的提取物O. 15g，置IOOml于量瓶中，甲醇溶解，精密吸取100 μ I至比色管中，揮去溶劑，放冷。依次精密加入新鮮配制的5%香草醛-冰乙酸溶液O. 2ml，高氯酸O. 8ml，于60°C水浴中加熱顯色15min后，冰浴冷卻5min，分別精密加入冰乙酸5ml混勻，作為供試品溶液。空白溶液的制備同上法。按上文方法測定實施例I制備的3批翼首草提取物中總苷的含量，結果見表I。
表I樣品含量測定結果(η = 2)批號 I23總苷含量(％) 52.66251 04252.052由上述結果可知，本提取物按干燥品計算，含總皂苷和總環烯醚萜苷總量以馬錢苷(C21H22O11)計，不得少于50%。二、提取物中有效成分的含量測定(一 )馬錢苷的測定照高效液相色譜法(中國藥典2010年版一部附錄VI D)測定。色譜條件與系統適用性實驗以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-水 (12 88)為流動相；檢測波長為240nm;理論塔板數按馬錢苷峰計算應不低于3000。對照品溶液的制備精密稱取馬錢苷對照品適量，加甲醇制成每Iml含60 μ g的溶液，即得。供試品溶液的制備取實施例I制備的提取物約O. lg，精密稱定，置25ml量瓶中，加入甲醇適量使溶解，再加甲醇至刻度，搖勻。置3000r/min離心機中離心20min，微孔濾膜濾過，即得。測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μ 1，注入液相色譜儀，測定，即得。本品按干燥品計算，含馬錢苷(C21H22O11)不得少于O. 30%。表2樣品含量測定結果(η = 2)
批號I23馬錢苷含量(％)0.620.640.60( 二 )熊果酸和齊墩果酸的含量測定色譜條件與系統適用性實驗以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；甲醇-O. Imol/ L乙酸銨溶液(85 15)作為流動相；檢測波長為210nm ;理論塔板數按熊果酸峰計算應不低于3000。對照品溶液的制備精密稱取齊墩果酸對照品、熊果酸對照品適量，加甲醇制成每 Iml含齊墩果酸O. lmg、熊果酸O. Img的溶液，即得。供試品溶液的制備取實施例I制備的提取物約O. lg，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入90%甲醇溶液各50ml，再精密加入鹽酸O. 15ml，稱定重量，80°C水浴回流 30min,放冷，再稱定重量，加甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μ 1，注入液相色譜儀，測定，即得。本品按干燥品計算，含齊墩果酸(C3tlH48O3)、熊果酸(C3tlH48O3)的總量不得少于 I. 00%。表3樣品含量測定結果(η = 2)
批號齊墩果酸熊果酸總量I0.341%0.919%1.260%20.315%0.892%1.207%30.333%0.872%1.205%以下通過藥理、藥效試驗證明本發明翼首草提取物的有益效果。試驗例I本發明翼首草有效提取部位的篩選按圖I的提取路徑，制備出A、B、C三種不同的翼首草提取部位，考察各部位的抗炎鎮痛作用。其中，大孔樹脂純化方法參見實施例I。I. I、對角叉菜膠致小鼠足腫脹的影響翼首草提取部位B、C及翼首草水提液對角叉菜膠致小鼠足腫脹均有顯著抑制作用。其中B部位作用最強，但稍弱于消炎痛。I. 2、對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響翼首草提取部位B及翼首草水提液對二甲苯致小鼠耳廓腫脹均有抑制作用。其中 B部位作用較強，但稍弱于消炎痛。I. 3、對冰醋酸致小鼠腹腔毛細血管通透性增加的影響
翼首草提取部位B、C及翼首草水提液對醋酸致小鼠腹腔通透性增強均有抑制作用。其中B部位作用較強，但稍弱于消炎痛。I. 4、對冰醋酸致小鼠扭體反應的影響翼首草提取部位A、B、C及翼首草水提液對醋酸致小鼠扭體反應均有抑制作用，延長扭體潛伏期，減少扭體次數。其中B部位作用相對較強，但稍弱于消炎痛。I. 5、翼首草各提取部位抗炎鎮痛作用比較由表4可知，B、C及翼首草水提液具有抗炎鎮痛作用，而B部位作用相比更明顯。 擬將B部位作為今后抗類風濕性關節炎藥效實驗的受試藥物。表4翼首草各提取物藥效篩選比較
權利要求
1.一種翼首草總苷提取物，其特征在于它來源于川續斷科植物匙葉翼首草 Pterocephalus hookeri (C. B. Clarke)Hoeck的干燥全草,該提取物中，總阜苷和總環烯醚萜苷的總含量大于50% w/w ;其中，含有馬錢苷O. 45-0. 78% w/w，齊墩果酸O. 2-0. 45% w/ w,熊果酸 O. 65-1. I % w/w。
2.根據權利要求2所述的翼首草總苷提取物，其特征在于該提取物中，含有馬錢苷O.6-0. 7% w/w，齊墩果酸 O. 3-0. 4% w/w，熊果酸 O. 8-1. 0% w/w。
3.權利要求I或2所述的翼首草總苷提取物的制備方法，其特征在于它包括如下步驟取翼首草，加水煎煮提取，濾過，濾液濃縮后，采用非極性或弱極性大孔吸附樹脂上樣， 先以水洗去雜質后，棄去洗脫液；以60-85% v/v乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液后，回收溶劑， 干燥，即得翼首草總苷提取物。
4.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于大孔吸附樹脂為D101、AB-8或 HPD-300 ;洗脫用乙醇為65-75% v/v。
5.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于選用DlOl型大孔吸附樹脂；以70% v/v乙醇洗脫。
6.根據權利要求3-5任意一項所述的制備方法，其特征在于大孔吸附樹脂洗脫的具體操作步驟如下將上樣液的濃度配制為O. 1-0. 2g生藥/ml，采用DlOl型大孔吸附樹脂上樣，上樣流速為l_3BV/h，上樣量以藥材計為藥材樹脂=(O. 5-1. 5) I w/w,以3-5BV水洗脫，流速為 l-3BV/h，棄去洗脫液；以2-4BV的70%乙醇洗脫，洗脫流速為2_4BV/h。
7.根據權利要求6所述的制備方法，其特征在于將上樣液的濃度配制為O.Ig生藥/ ml，采用DlOl型大孔吸附樹脂室溫下上樣，上樣流速為2BV/h，上樣量以藥材計為藥材樹脂=I 1，以4BV水洗脫，流速為2BV/h，棄去洗脫液；以3BV的70%乙醇洗脫，洗脫流速為 3BV/h0
8.權利要求I或2所述的翼首草總苷提取物在制備抗炎、鎮痛或治療類風濕性關節炎的藥物中的用途。
9.一種治療類風濕性關節炎的藥物組合物，其特征在于它是由權利要求I或2所述的翼首草總苷提取物為活性成分，加上藥學上常用的輔料制備而成的制劑。
全文摘要
本發明提供了翼首草總苷提取物，它來源于川續斷科植物匙葉翼首草Pterocephalus hookeri(C.B.Clarke)Hoeck的干燥全草，該提取物中，總皂苷和總環烯醚萜苷的總含量不低于50％w/w，其中，含有馬錢苷0.45-0.78％w/w，齊墩果酸0.2-0.45％w/w，熊果酸0.65-1.1％w/w。本發明還提供了該提取物的制備方法和用途。本發明翼首草總苷提取物具有良好的抗炎鎮痛作用，對機體特異性細胞免疫有一定的抑制效果，并且能夠通過降低類風濕性關節炎的促炎癥因子水平和提高機體抗氧化能力，有效地治療類風濕性關節炎，療效確切，為臨床用藥提供了一種新的選擇。
文檔編號A61K36/185GK102579519SQ20121006115
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月9日 優先權日2011年3月9日
發明者古銳, 孟憲麗, 張藝, 賴先榮 申請人:成都中醫藥大學