專利名稱：天仙子藥材的指紋圖譜及其質量控制方法
技術領域：
本發明屬于中藥材鑒別方法領域，特別涉及一種天仙子藥材的化合物的指紋圖譜及其質量控制方法。
背景技術：
天仙子，即Henbane Qlyoscyamus niger L.),為兩年生草本,原生于歐洲,西亞， 北亞及北非等地，后傳入東亞，北美和澳洲，現許多國家均有栽培，是一種傳統的致幻劑。天仙子原植物高0. 3-0. 7m，灰綠色葉子，白色或淡黃色花，具紫色脈紋，種子為深棕色，帶有明顯難聞氣味，因此俗稱臭茄。在中國，古代應用天仙子多以種子藥用，少數以根入藥，現代應用主要以種子入藥，而在英國、美國和德國，除種子外，天仙子的干燥葉，花冠和新鮮開花期的全株植物也可入藥，英國藥典以帶花全草入藥。中藥的天仙子是指爺科植物莨菪Hyoscyamus niger L.的干燥成熟種子,原稱 “莨菪子”，又稱“橫唐”，味辛，性溫，有大毒。具有解痙止痛，定喘，安神的功能。主治胃痙攣疼痛、喘咳、癲狂。曾有文獻報導天仙子用于治療氣管炎、支氣管哮喘、抗休克、改善微循環。 特別在近幾年來，在研究使用過程中，進一步發現了它多方面的藥理作用和臨床功能，主要治療作用是解除小血管和平滑肌的痙攣，感染性休克，改善微循環，治療神經痛和癲癇，調節和多種體液因子等，近年來，具研究發現天仙子的一些化合物還具有抗癌活性。《中華本草》和《中藥大辭典》記載天仙子廣泛分布于全國各地東北、華北、西北及安徽、山東、河南、四川、西藏等地。天仙子有生品、炒制品、醋制品，2010版《中國藥典》收載天仙子，但未收錄其炮制方法，亦沒有對炮制溫度和時間等詳細炮制工藝參數的規定。目前中國藥典規定的檢測指標為托烷類生物堿，不具有專屬性。單一成分的測定難以代表其整體質量，藥材中其它成分的情況不能給與全面反映。為此，就需要借助于色譜指紋圖譜技術，建立天仙子較為科學全面的質量評價體系。指紋圖譜技術優點是可以全面的反映天仙子復雜的化學成分及其相對比例，有效的表征其質量。同時，炮制使天仙子中的有效成分含量發生了變化，有利于增強療效，需有其特征性的方法來進行質量控制，否則會影響天仙子的質量、療效及用藥安全性。

發明內容
本發明的目的是提供一種天仙子藥材及其炮制品的指紋圖譜及其質量控制方法， 建立了天仙子及炒天仙子的質量標準，為今后控制天仙子飲片的臨床用藥的安全性和有效性奠定了基礎。本發明的技術方案如下
I、供試品溶液的制備稱取天仙子或其炮制品約lg，加50ml甲醇回流提取I h，濾過， 濃縮，定容至IOml容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，備用；
其中炮制品是指清炒品、醋制品或加水制品；各炮制品的炮制方法如下清炒品取藥材適量，將鍋預熱至160°C，投入藥材，拌炒 4-8分鐘；醋制品取藥材適量，加食用醋悶4小時，藥材與食用醋的比例為IOOg藥材加入 40mL食用醋，后將鍋預熱至160°C，投入藥材，拌炒4-8分鐘；加水制品取藥材適量，加水悶4小時，藥材與水的比例為IOOg藥材加入40mL水，后將鍋預熱至160°C，投入藥材，拌炒 4-8分鐘；2、對照品溶液的制備取克羅酰胺對照品適量，加甲醇制成每ml含0.2mg的對照品溶液，備用；
3、色譜條件與系統適用性試驗
色譜柱十八烷基硅烷鍵合硅膠(ODS)柱；流動相以乙腈-0. 1%磷酸梯度洗脫；流速 I. 00ml/min ;梯度洗脫程序為0-25分鐘乙腈-0. 1%磷酸(10:90);25_50分鐘乙腈-0. 1%磷酸(30:70);50-85 分鐘乙腈-0. 1% 磷酸(37. 5:62. 5);85_90 分鐘乙腈-0. 1% 磷酸(45:55); 柱溫30°C ;檢測波長254nm ;進樣量10 ;
分別精密吸取上述不同供試品溶液各IOW，注入高效液相色譜儀，按上述的色譜條件進行測定，記錄色譜峰的保留時間。其中，不同產地天仙子供試品溶液中克羅酰胺對照品的保留時間(21號峰)為1， 克羅酰胺對照品色譜峰出現在46分鐘左右，計算相對保留時間，對不同產地的圖譜進行比較和歸屬，其中天仙子指紋圖譜中共有指紋峰共計30個，相對保留時間為1 (0. 078),2 (0.087)，3 (0.204)，4 (0. 225), 5 (0.243)，6 (0. 282), 7 (0.321)，8 (0.405)，9 (0.447)，
10(0. 555)，11 (0. 599)，12 (0. 655)，13 (0. 696)，14 (0. 723)，15(0. 743)，16 (0. 774)， 17 (0. 786)，18 (0. 812)，19 (0. 893)，20 (0. 973)，21 (I)，22 (I. 035)，23 (I. 074)，24 (I. 288)， 25 (I. 376)，26 (I. 406)，27 (I. 436)，28 (I. 473)，29 (I. 672)，30 (1.725);
不同炮制品天仙子供試品溶液中克羅酰胺對照品的保留時間(26號峰)為1，克羅酰胺對照品色譜峰出現在46分鐘左右，計算相對保留時間，天仙子炮制品中指紋圖譜中共有指紋峰共計42個，相對保留時間為1(0.078),2(0. 087),3 (0. 109),4(0. 125),5 (0. 144) ,6(0. 169) ,7 (0.204)，8 (0. 225) ,9(0. 243), 10 (0. 282),11(0. 321),12(0. 399),
13(0. 405)，14 (0. 447) , 15(0. 555)，16 (0. 567) , 17(0. 599)，18 (0. 655)，19 (0. 696)， 20 (0. 723)，21 (0. 743)，22 (0. 762)，23(0. 774)，24(0. 786) ,25 (0. 812)，26 (0. 893)， 27 (0. 973) ,28 (1) ,29 (I. 035) ,30 (I. 074), 31 (I. 091) ,32(1. 115) ,33 (1. 146)， 34(1. 288), 35(1. 376) ,36 (I. 406) , 37(1. 436), 38 (I. 473)，39 (I. 569)，40 (I. 614)，41 (I. 672)，42(1. 725)；
天仙子及其炮制品的HPLC指紋圖譜及共有峰的標定實驗結果提供了天仙子在相同條件下的HPLC圖譜相關參數,天仙子藥材及炮制品的色譜峰均在90min之內出現,并用對照品溶液標定出克羅酰胺對照品色譜峰。由于克羅酰胺對照品色譜峰出現在46分鐘左右， 各樣品均存在，時間居中，峰面積較大，為主峰，故選擇此峰為內標參照峰，其它特征峰依次標號。共有峰的確定原則為①每個樣品中都含有這種成份；②峰形離度>8% ;③各峰相對保留時間的RSD〈5% ;④各峰相對峰面積的RSD〈30%。結果找出較穩定的共有色譜峰。各色譜圖中共有峰面積之和均達總面的90%以上。共有峰的提取原則主要共有峰與相鄰峰的分離度應達到有效分離，即分離度為
I.2以上，其他共有峰也應達到一定的分離；峰尖到峰谷的距離至少應大于該峰高的2/3以上，如果達不到則兩個峰可以合并為一個峰計算。以指紋圖譜建立質量標準的優勢就在于指紋譜中每個峰具體是何種物質上不明確時，依然能夠給出充分的、可靠的信息，用以控制藥材質量。因此，在比較主要共有峰時，對于百分面積較小的共有峰應給于足夠的重視。運用中藥色譜指紋圖譜相似度評價計算軟件進行各地天仙子及不同炮制品的相似度評價。導入實驗數據，設定參照譜，譜峰自動匹配，自動生成對照譜，各樣品圖譜與對照譜比較及相
互比較，可得各地天仙子相似度結果及天仙子與炮制品天仙子相似度結果。天仙子炮制前后的HPLC指紋圖譜有明顯的差別，主要表現在極性較大和極性較小的部位，其中具特征規律的有以下3個方面①清炒后新增加了 2個色譜峰，醋制后新增加了 3個色譜峰；②原來在生品中含量小的成分炮制后顯著增加，分別為3 (0. 109)，I (0. 321)，14 (0. 447)，15 (0. 555)，17 (0. 599)，19 (0. 696)，20 (0. 723)，23 (0. 774)，
24(0. 786), 25 (0. 812), 26 (0. 893), 29 (I. 035) ,30 (I. 074), 31 (1. 091) ,32(1. 115), 33(1. 146) ,35(1. 376) ,36 (I. 406) ,37(1. 436), 38 (I. 473)，39 (I. 569);③原來在生品中含量較大的成分炮制后顯著降低，為42(1. 725)。


圖I不同產地天仙子指紋圖譜高效液相色譜圖2天仙子各炮制品指紋圖譜高效液相色譜圖。
具體實施例方式以下實施例子進一步解釋本發明的內容，但并不用以限制本發明。實施例I
1、供試品溶液的制備分別稱取8個產地天仙子約IgjP50ml甲醇回流提取I h,濾過，濃縮，定容至IOml容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，備用；
2、對照品溶液的制備取克羅酰胺對照品適量，加甲醇制成每ml含0.2mg的對照品溶液，備用；
3、色譜條件與系統適用性試驗
高效液相色譜儀島津LC-20A高效液相色譜儀(SH)-IOA檢測器，LC-20A泵，SIL-20A 自動進樣器，CT0-20A柱溫箱，CBM-20A系統控制器，LC Solution LC工作站)色譜柱 DiamonsiI (迪馬)-C18 (5 u m, 150X4. 6 mm);流動相:以乙腈-0. 1%磷酸梯度洗脫；流速
1.00ml/min ;梯度洗脫程序為0-25分鐘乙腈-0. 1%磷酸(10:90);25_50分鐘乙腈-0. 1%磷 @1(30:70)； 50-85 分鐘乙腈-0. 1% 磷酸(37. 5:62. 5 ) ; 85-90 分鐘乙腈-0. 1% 磷酸(45:55)； 柱溫30°C ;檢測波長254nm ;進樣量10 ;
分別精密吸取上述不同產地供試品溶液各10沿，注入高效液相色譜儀，按上述的色譜條件進行測定，記錄色譜峰的保留時間，以供試品溶液中克羅酰胺對照品的保留時間 (21號峰)為1，克羅酰胺對照品色譜峰出現在46分鐘左右，計算相對保留時間，對不同產地的圖譜進行比較和歸屬，其中天仙子指紋圖譜中共有指紋峰共計30個，相對保留時間為I (0.078),2 (0. 087) ,3 (0. 204) ,4 (0. 225), 5 (0. 243) ,6 (0.282)，7 (0. 321) ,8 (0. 405) ,9 (0. 447) , 10 (0. 555), 11 (0. 599), 12 (0. 655), 13 (0.696)，
14(0. 723)，15 (0. 743)，16 (0. 774)，17 (0. 786)，18 (0. 812)，19 (0. 893)，20 (0. 973) ,21 (1), 22(1. 035) ,23(1. 074) ,24(1. 288) ,25(1. 376), 26 (I. 406) ,27 (I. 436), 28 (I. 473) ,29 (I. 672)，30 (I. 725)；對8個產地的天仙子藥材指紋圖譜進行了測定，經過計算比較得到各自的指紋圖譜的相似度，結果表明，除兩個樣品外，其余樣品的相似度均在0. 90 I之間，表明各樣品的相似情況良好。性狀鑒別表明，云南和安徽兩個樣品中分別混有不合格藥材和一定量的偽品， 結果相似度均小于0. 90。可見，用該法分析未知樣品時，只需測得該樣品的色譜指紋圖譜， 計算未知樣品與共有模式間的相似度，即可對樣品進行鑒定、分類和評價。實驗結果提示，6 個產地的天仙子藥材具有較高的相似度。相似度計算結果見表I。表I不同產地HPLC指紋圖譜相似度計算結果
權利要求
1.一種天仙子藥材的指紋圖譜，其特征在于天仙子指紋圖譜中共有指紋峰共計 30個，以克羅酰胺為特征峰，克羅酰胺的保留時間為1，指紋峰的相對保留時間依次為 I (0. 078),2 (0. 087) ,3 (0. 204) , 4 (0. 225) , 5 (0. 243) , 6 (0. 282) , 7 (0.321)，8(0. 405) ,9 (0. 447)，10(0. 555)，11 (0. 599)，12 (0. 655)，13 (0. 696) , 14(0. 723), 15 (0. 743)，16 (0. 774)，17 (0. 786)，18 (0. 812)，19 (0. 893)，20 (0. 973) ,21 (1) ,22 (I. 035)，23(I. 074), 24 (I. 288), 25 (I. 376), 26 (I. 406)，27 (I. 436)，28 (I. 473)，29 (I. 672)，30 (I. 725)。
2.一種天仙子藥材的指紋圖譜，其特征在于天仙子炮制品中指紋圖譜中共有指紋峰共計42個，以克羅酰胺為特征峰，克羅酰胺的保留時間為1，指紋峰相對保留時間依次為 I (0. 078),2(0. 087) ,3 (0. 109), 4(0. 125) ,5 (0.144)，6 (0.169)，7 (0.204)，8 (0.225)，9(0. 243)，10 (0. 282) ,11(0. 321)，12 (0. 399)，13 (0. 405)，14 (0. 447)，15 (0. 555)，16 (0. 567)，17 (0. 599)，18 (0. 655)，19 (0. 696)，20 (0. 723) ,21 (0. 743)，22 (0. 762)，23 (0. 774)， 24(0. 786) ,25 (0. 812)，26 (0. 893)，27 (0. 973)，28 ⑴，29 (I. 035)，30 (I. 074)， 31(1.091) ,32(1. 115) ,33(1. 146) ,34(1. 288) ,35(1. 376), 36 (I. 406) ,37(1. 436), 38 (I. 473)，39 (I. 569)，40 (I. 614)，41 (I. 672) ,42(1. 725)
3.根據權利要求2所述的一種天仙子藥材的指紋圖譜，其特征在于所述的天仙子炮制品為清炒品、醋制品或加水制品，其中清炒品的是指取天仙子藥材適量，將鍋預熱至160°C， 投入藥材，拌炒4-8分鐘；醋制品是指取天仙子藥材適量，加食用醋悶4小時，藥材與食用醋的比例為IOOg藥材加入40mL食用醋，后將鍋預熱至160°C，投入藥材，拌炒4_8分鐘；加水制品是指取天仙子藥材適量，加水悶4小時，藥材與水的比例為IOOg藥材加入40mL水，后將鍋預熱至160°C，投入藥材，拌炒4-8分鐘。
4.一種天仙子藥材的質量控制方法，其特征在于(1)供試品溶液的制備稱取天仙子或其炮制品約lg，加50ml甲醇回流提取I小時，濾過，濃縮，定容至IOml容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，備用；(2)對照品溶液的制備取克羅酰胺對照品適量，加甲醇制成每ml含0.2mg的對照品溶液，備用；(3)色譜條件與系統適用性試驗色譜柱十八烷基硅烷鍵合硅膠(ODS)柱；流動相以乙腈-0. 1%磷酸梯度洗脫；流速 I. 00ml/min ;梯度洗脫程序為0-25分鐘乙腈-0. 1%磷酸(10:90);25_50分鐘乙腈-0. 1%磷酸(30:70);50-85 分鐘乙腈-0. 1% 磷酸(37. 5:62. 5);85_90 分鐘乙腈-0. 1% 磷酸(45:55); 柱溫30°C ;檢測波長254nm ;進樣量10 ;分別精密吸取上述不同的供試品溶液各10沿，注入高效液相色譜儀，按上述的色譜條件進行測定，記錄色譜峰的保留時間，其中，不同產地供試品溶液中克羅酰胺對照品的保留時間(21號峰)為1，克羅酰胺對照品色譜峰出現在46分鐘左右，計算相對保留時間，對不同產地的圖譜進行比較和歸屬，其中天仙子指紋圖譜中共有指紋峰共計30個，相對保留時間為1 (0. 078),2 (0. 087) ,3 (0. 204) ,4 (0. 225), 5 (0. 243) ,6 (0. 282), 7 (0.321)，8(0. 405) ,9 (0. 447), 10(0. 555) , 11 (0. 599), 12 (0. 655)，13 (0. 696) , 14(0. 723), 15 (0. 743)，16 (0. 774)，17 (0. 786)，18 (0. 812)，19 (0. 893)，20 (0. 973) ,21 (1) ,22 (I. 035)，23(I. 074), 24 (I. 288), 25 (I. 376), 26 (I. 406)，27 (I. 436)，28 (I. 473)，29 (I. 672)，30(I. 725)；不同炮制品供試品溶液中克羅酰胺對照品的保留時間(26號峰)為1，克羅酰胺對照品色譜峰出現在46分鐘左右，計算相對保留時間，天仙子炮制品中指紋圖譜中共有指紋峰共計 42 個，相對保留時間為I (0. 078),2(0. 087)，3 (0. 109) ,4(0. 125)，5 (0.144)，6 (0.169)，7 (0.204)，8 (0. 225) ,9(0. 243), 10 (0. 282),11(0. 321),12(0. 399), 13 (0. 405)，14(0. 447)，15(0. 555)，16(0. 567)，17(0. 599)，18(0. 655)，19(0. 696)， 20 (0. 723)，21 (0. 743) , 22 (0. 762) ,23 (0. 774) ,24(0. 786) ,25 (0. 812) ,26 (0. 893)， 27 (0. 973) ,28 (1) ,29 (I. 035) ,30 (1.074)，31 (I. 091) ,32(1. 115) ,33 (1. 146) 34(1.288)，35(1. 376),36 (I. 406) ,37(1. 436), 38 (I. 473), 39 (I. 569) ,40 (I. 614) ,41 (1.672)，42(1.725)。
5.根據權利要求4所述的一種天仙子藥材的的質量控制方法，其特征在于所述的天仙子炮制品為清炒品、醋制品或加水制品，其中清炒品的是指取天仙子藥材適量，將鍋預熱至 160°C，投入藥材，拌炒4-8分鐘；醋制品是指取天仙子藥材適量，加食用醋悶4小時，藥材與食用醋的比例為IOOg藥材加入40mL食用醋，后將鍋預熱至160°C，投入藥材，拌炒4-8 分鐘；加水制品是指取天仙子藥材適量，加水悶4小時，藥材與水的比例為IOOg藥材加入 40mL水，后將鍋預熱至160°C，投入藥材，拌炒4_8分鐘。
全文摘要
本發明公開了一種天仙子藥材的指紋圖譜及其質量控制方法，屬中藥材鑒別方法領域。本發明提供一種天仙子藥材及其炮制品的指紋圖譜及其質量控制方法，天仙子指紋圖譜中以克羅酰胺為特征峰，天仙子指紋圖譜共有指紋峰的共計30個，天仙子炮制品中以克羅酰胺為特征峰，指紋圖譜中共有指紋峰的共計42個，本發明的色譜柱為十八烷基硅烷鍵合硅膠柱；流動相以乙腈-0.1%磷酸梯度洗脫建立天仙子的質量標準，為今后控制天仙子飲片的臨床用藥的安全性和有效性奠定了基礎。
文檔編號A61P11/14GK102621243SQ201210082259
公開日2012年8月1日 申請日期2012年3月27日 優先權日2012年3月27日
發明者李軍, 楊丹, 門啟鳴 申請人:大連市食品藥品檢驗所