專利名稱：一種多功能腫瘤成像劑、制備方法及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種多功能腫瘤成像劑及其制備技術，屬于腫瘤成像劑領域，特指靶向性腫瘤成像劑及其制備方法和應用
背景技術：
由于腫瘤細胞的過度增殖和對正常組織的侵犯、轉移，癌癥成為威脅人類健康的嚴重疾病。然而目前在臨床腫瘤診斷和治療中廣泛應用的藥物多為非選擇性藥物，體內分布廣泛，常規治療劑量即可對正常組織器官產生顯著的毒副作用，導致患者不能耐受，故提高藥物的腫瘤選擇性，減少其在非靶向部位的聚集是提高抗腫瘤藥物療效的關鍵。靶向性藥物能最大限度地進入到靶區，并在靶區濃集，直接作用于病變組織、器官和細胞，延長藥物與靶部位的作用時間，使到達需藥部位的藥量增加，從而減少用藥量、藥物的毒副作用，達到高效低毒的治療效果。生物靶向納米藥物和磁性靶向納米藥物(Cho H S，Dong Z Y，Pauletti G M, Zhang J M, Xu H，Gu H C，Wang L M, Ewing R C，Huth C，Wang F，ShiD L. Fluorescent, superparamagnetic nanospheres for drug storage, targeting,and imaging: a multifunctional nanocarrier system for cancer diagnosis andtreatment, ACS Nano, 2010, 4(9) :5398-5404)是目前革E向納米藥物研究的兩大熱點，其中具有核殼結構的納米顆粒(Gao J H，Liang G L, Cheung J S. Multifunctionalyolk—sheil nanoparticles: a potential MRI contrast and anticancer agent, J.Am. Chem. Soc.，2008, 130:11828-11833)引起了人們的關注，ニ氧化硅具備良好的生物安全性，表面的硅羥基易于修飾，可與各種生物分子通過多種方式偶聯且不會對生理活動造成危害。使得ニ氧化娃包覆的納米顆粒(Jiang S，Gnanasammandhan M K，Zhang Y.Optical imaging-guided cancer therapy with fluorescent nanoparticles, J. R.Soc. Interface, 2010, 7:3_18)在核殼結構的納米粒子中脫穎而出。

發明內容
本發明報道了ー種新型多功能的納米復合成像劑，它具備腫瘤靶向性、磁共振成像和抗腫瘤的特性。以粒徑20 nm磁性納米四氧化三鐵(Fe3O4)為核，通過微乳液方法制備了包裹熒光染料異硫氰酸羅丹明B (RBITC)和多孔磁性納米四氧化三鐵為核、ニ氧化硅為殼的納米顆粒(RBITC-Fe3O4IgSiO2,其中@表示核殼結構)。接著在SiO2的表面修飾了腫瘤靶向肽精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸(RGD)及甲氧基聚こニ醇(PEG)，獲得腫瘤靶向納米多孔藥物載體(RBITC-Fe3O4IgSiO2-PEG-RGD)；最后將順磁性抗腫瘤配合物ニ氯N- (2-丙酸こ酯基)-N，N-ニ(2-吡啶甲基)胺合錳(簡寫為LMnCl)吸附到多孔藥物載體中最終得到了ー種腫瘤靶向性多功能的納米復合成像劑(LMnCl-RB I TC-Fe3O4OS i O2-PEG-RGD )。一種多功能腫瘤成像劑，其結構式為LMnCl-RBITC-Fe304@Si02-PEG-RGD，其中LMnCl為ニ氯N- (2-丙酸こ酯基)-N, N- ニ(2-吡啶甲基)胺合猛，RBITC為異硫氰酸羅丹明B，RGD為精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸三肽，PEG為甲氧基聚こニ醇，其中@表示核殼結構。上述一種多功能腫瘤成像劑的制備方法，按照下述步驟進行
(I)將Fe3O4和四甲氧基硅烷(TEOS)以質量比I :1 I :6，混合并超聲分散于三氯甲烷，其中Fe3O4與三氯甲烷質量比I :1 I :10，再加入Fe3O4的量0. I I. 0倍的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)水溶液，接著加入水和I 5 M的NaOH溶液；其中水與TEOS的質量比例I :1 I : 10，其中NaOH與TEOS的質量比例I :2 I : 10，溫度控制在30 70 0C制成溶液A ^fTEOS和RBITC按照質量比4 :1 I :1，混合后制成溶液B ;將溶液B加入溶液A中，再加入こ酸こ酯，其中こ酸こ酯用量為反應液體積的5% 40%，反應I 30 min后加入氨丙基三こ氧基硅烷(APS)，其中APS =Fe3O4質量比為10 :1 I :1，攪拌反應I 5 h，磁性分離，固體用こ醇和水各洗2次得熒光染料異硫氰酸羅丹明B (RBITC)和多孔磁性納米四氧化三鐵為核、ニ氧化硅為殼的納米顆粒(RBITC-Fe3O4IgSiO2,其中@表示核殼結構)。(2)將精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸三肽(RGD)、1，3- ニ環己基碳ニ亞胺(DCC)和N-羥基丁ニ酰亞胺(NHS)混合，其中RGD DCC :NHS質量比為I :5 :2 I :1 :4，加入一定量的DMF至固體剛好溶解，其中質量比DMF =NHS為2 :1 8 :1，溶液在常溫下攪拌反應10 36 h ;再加入上述干燥后的固體RBITC-Fe3O4IgSiO2，繼續攪拌反應10 36 h ;結束反應，磁性分離得表面修飾RGD的熒光染料異硫氰酸羅丹明B (RBITC)和多孔磁性納米四氧化三鐵為核、ニ氧化硅為殼的納米顆粒(RBITC-Fe3O4OSiO2-RGD)tj(3)稱取甲氧基聚こニ醇酸溶于DMF制成飽和溶液中，其中甲氧基聚こニ醇酸RBITC-Fe3O4OSiO2-RGD的質量比為4:1 1: 2，再依次加入DCC和NHS，其中質量比DCC:NHS:甲氧基聚こニ醇酸為3:3:1 3:2: 4，讓其在常溫下攪拌反應10 36 h ;再將RBITC-Fe3O4OSiO2-RGD加入其中，常溫攪拌反應10 36 h后加入一定量的こ醇超聲分散5分鐘，其中與RBITC-Fe3O4IgSiO2-R⑶的質量比為I :1 6 :1 ;然后加入順磁性抗腫瘤配合物ニ氯N_( 2-丙酸こ酯基)-N，N- ニ(2-吡啶甲基)胺合錳(簡寫為LMnCl )，其中質量比LMnCl: RBITC-Fe3O4OSiO2 -RGD為I :2 4 :1，混和溶液在40 80 °C下攪拌反應I 6 h ;磁性分離，真空干燥得產物ー種腫瘤靶向性多功能的納米復合成像劑(LMnCl-RBITC-Fe304@Si02-PEG-RGD)。其中步驟(DFe3O4為粒徑20 nm磁性納米Fe3O4中，磁性納米Fe3O4和四甲氧基娃烷(TEOS)質量比為I 2 ；Fe3O4與三氯甲烷質量比為I :2 ;再加入Fe3O4的量0. 5倍的CTAB水溶液，水與TEOS的質量比例為I :4. 5 ; NaOH溶液為2 M，其中NaOH與TEOS的質量比例為I :5，溫度控制在70 °C;TE0S和RBITC的質量比為2 :1 ;其中こ酸こ酯用量為反應液體積的20%，反應10 min ;其中氨丙基三こ氧基硅烷(APS):Fe304質量比為5 : 1，攪拌反應3 h。其中步驟(2)中將精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸(RGD)、1，3-ニ環己基碳ニ亞胺(DCC)和N-羥基丁ニ酰亞胺(NHS)以質量比I :1. 5 :1. 5混合，加入NHS質量4倍的DMF至固體剛好溶解，溶液在常溫下攪拌反應24 h后。其中步驟(3)中甲氧基聚こニ醇酸的分子量2000 ;稱取RBITC-Fe3O4IgSiO2-RGD兩倍質量的甲氧基聚こニ醇酸溶于DMF制成飽和溶液， 其中DCC:NHS:甲氧基聚こニ醇酸質量比為3:3:2 ;讓其在常溫下攪拌反應24 h ;再將RBITC-Fe3O4IgSiO2-R⑶加入其中，繼續常溫攪拌反應24 h后加入RBITC-Fe3O4IgSiO2-RGD質量3倍的こ醇超聲分散5分鐘；然后加入RBITC-Fe3O4IgSiO2-RGD質量兩倍的順磁性抗腫瘤配合物ニ氯N- (2-丙酸こ酯基)-N, N- ニ(2-吡啶甲基)胺合錳(簡寫為LMnCl )，混和溶液在80° C下攪拌反應4 h。
上述一種多功能腫瘤成像劑的應用，具有腫瘤靶向肽誘導的腫瘤細胞主動靶向性，可以用于腫瘤細胞與正常細胞的磁共振成像鑒別劑。本發明的優點上述所說的ー種多功能腫瘤成像劑的應用，具有腫瘤靶向肽誘導的腫瘤細胞主動靶向性，可以用于腫瘤細胞與正常細胞的磁共振成像鑒別劑，能借助磁共振成像技術或熒光成像技術區別腫瘤細胞與正常細胞，而傳統的磁共振成像劑僅具有成像功能，不能區別腫瘤細胞和正常細胞；此外這種多功能腫瘤成像劑，還具有抗腫瘤活性，可運用于臨床磁共振成像監測治療用藥，實現腫瘤治療過程的時時監測，而目前臨床運用的抗腫瘤藥物僅具有腫瘤抑制性能，無法實現藥物治療過程的實時監測。


圖I :LMnCl-RBITC-Fe304@Si02-PEG-RGD 引起的 HeLa 細胞形狀的變化(A: I u g/ml, B: 10 u g/ml; C: 30iig/ml)。納米顆粒對腫瘤生長的抑制活性(實驗I)。30 U g/ml的LMnCl-RBITC-Fe304@Si02-PEG-RGD處理HeLa細胞時，幾乎所有細胞全部皺縮、變圓，即所有細胞全部死亡，說明其對腫瘤細胞的抑制活性較好。圖 2 :LMnCl-RBITC-Fe304@Si02-PEG-RGD 的 MRI 圖(WRL-68 細胞)(a:空白；b:10 u g/ml; c: 30 u g/ml; d: 50 y g/ml)。WRL-68細胞為正常地肝細胞，附圖2較弱的磁共振信號表示L3MnCl-RBITC-Fe304@Si02-PEG-RGD納米顆粒在正常細胞里的吸收較少。圖 3 :LMnCl-RBITC-Fe304@Si02-PEG-R ⑶的 MRI 圖 OfepG-2 細胞)(a:空白；b:10 u g/ml; c: 30 u g/ml; d: 50 y g/ml)。H印G-2細胞為肝癌細胞，附圖3較強的信號表示肝癌細胞對L3MnCl-RBITC-Fe304@Si02-PEG-RGD納米顆粒吸收較強，即制備的納米顆粒具有腫瘤選擇性吸收和磁共振成像的特性。經生物活性測試，LMnC I -RB I TC-Fe304iS i O2-PEG-RGD同時具有動物體外磁共振成像，抗腫瘤以及腫瘤靶向性的特征，能特定地殺死HeLa細胞，30 u g/ml能夠引起細胞顯著死亡；此外這種納米復合物對肝腫瘤細胞H印G-2聚集度顯著高于正常肝細胞WRL-68 (見圖2與圖3，實驗I與2)，說明具有較好的腫瘤細胞靶向性，從而有望作為ー種診斷、治療癌癥的多功能靶向納米藥物或用于腫瘤磁共振成像、熒光成像劑。
具體實施例方式試劑和原料
實驗中所用試劑均為分析純，除特別注明タト，未經進一歩處理。元素分析用Carlo-Erba-1106型元素分析儀測定，紅外光譜用Fr-IR 169 (固體用KBr壓片)。抗腫瘤試驗試劑如下(I) RPMI 1640培養基(RPMI 1640+10%小牛血清+HEPES
3.5g/l +NaHCO3 2. 2g/l + 青霉素 0. 13g/l + 鏈霉素 0. 15g/l)。(2)高糖 DMEM 培養基(DMEM +10%小牛血清+HEPES 3. 5g/l +NaHCO3 2. 2g/l +青霉素 0. 13g/l +鏈霉素 0. 15g/I)。(3) MTT (美國Amresco公司產品)
納米顆粒對水質子弛豫速率增強的能力影響其在體內磁共振成像的效果，弛豫效率用め表示，A值越大，其弛豫能力越強，活體成像效果也越好。弛豫效率用下式計算/ ,= [ (IA1) ^sd-(IA1) J/[M](I)
式中(IA1)t5bsd與(IA1)d分別為在造影剤存在下觀察到水質子的縱向弛豫速率和純水中質子的弛豫速率。[M]為造影劑的濃度，計算得LMnCl-RBITC-Fe304@Si02-PEG-RGD的縱向弛豫效率め分別為11. 99 mrnoF 1 L s_、數據表明所合成是納米顆粒對水質子的弛豫速率起良好的加速作用。附圖2為LMnCl-RBITC-Fe304@Si02-PEG-RGD的WRL-68細胞的MRI圖，附圖3為LMnCl-RBITC_Fe304@Si02-PEG-RGD作用H印G-2細胞的MRI圖，從圖可以看出，兩者都有一定的磁共振成 像效果。比較附圖2和附圖2可知，LMnCl-RBITC-Fe3O4IgSiO2-PEG-RGD納米顆粒能特定地靶向于腫瘤細胞，而對正常細胞的吸收較弱。以上結果表明，LMnC I -RB I TC-Fe304iS i O2-PEG-RGD能作為腫瘤靶向性磁共振成像劑，從而有望用于腫瘤的診斷和治療。
實施例I (最價制備條件舉例)將粒徑20 nm磁性納米Fe3O4 (40 mg)和四甲氧基娃烷(TEOS ) (80mg)以質量I :2混合并超聲分散于80 mg三氯甲烷(Fe3O4與三氯甲烷質量比I :2)，再加入0. 5M十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)水溶液0. 8ml，接著加入水2ml和2 M的NaOH溶液0. 4 g (其中NaOH與TEOS的質量比例I :5)，溫度控制在最佳70 °C獲得溶液A ;將另ー份TEOS (120mg)和異硫氰酸羅丹明B (RBITC) (60mg)以質量比2 1混合后制成溶液B ;將溶液B加入溶液A中，再加入反應液體積的20%こ酸こ酷，反應10 min后加入APS (200mg) (APS =Fe3O4質量比5 :1)，攪拌反應3 h，磁性分離，固體用こ醇和水各洗2次得包裹熒光染料異硫氰酸羅丹明B (RBITC)和多孔磁性納米四氧化三鐵為核、ニ氧化硅為殼的納米顆粒(RBITC-Fe304@Si02，其中0表示核殼結構)。將22 mg RGD、(33mg) 1，3_ ニ環己基碳ニ亞胺(DCC)和(33mg) N-輕基丁ニ酰亞胺(NHS)的N，N-ニ甲基甲酰胺混合(其中RGD DCC :NHS質量比為I :1. 5 :1. 5)，加入20 mlDMF至固體剛好溶解，溶液在常溫下攪拌反應24 h。再加入上述干燥后的固體RBITC-Fe3O4OSiO2,繼續攪拌反應24 h。結束反應，磁性分離得表面修飾RGD的熒光染料異硫氰酸羅丹明B(RBITC)和多孔磁性納米四氧化三鐵為核、ニ氧化硅為殼的納米顆粒RBITC-Fe3O4IgSiO2-RGD(69. I mg)。稱取甲氧基聚こニ醇酸(分子量2000) (138. 2 mg)溶于DMF制成飽和溶液中(其中甲氧基聚こニ醇酸RBITC-Fe3O4OSiO2-RGD質量比2 :1中，再依次加入207. 3 mg的DCC和207.3 mg NHS (質量比DCC:NHS:甲氧基聚こニ醇酸為3:3:2)，讓其在常溫下攪拌反應24 h。再將RBITC-Fe3O4OSiO2-RGD (69. I mg)加入其中，常溫攪拌反應24 h后加入18ml乙醇超聲分散5分鐘；然后加入138. 4 mg順磁性抗腫瘤配合物ニ氯N- (2-丙酸こ酯基)-N，N-ニ(2-吡啶甲基)胺合錳(簡寫為LMnCl)(質量比LMnCl: RBITC-Fe3O4OSiO2-RGD約為
2:1)，混和溶液在80 °C下攪拌反應4 h。磁性分離，真空干燥得產物LMnCl-RBITC-Fe3O4IgSiO2-PEG-RGD (132 mg)。IR (KBr, cm-1) 3440, 1608，1428，1065，562. UV (H2O, nm)，555，260.Mn 12.68%.粒徑(TEM)，20-30 nm。 油脂分布系數I. 2。測得納米顆粒的h遲豫時間分別為83. 410 ms,縱向弛豫效率め為11. 99 mmoF 1 L s_、 經生物活性測試，LMnC I -RB I TC-Fe304iS i O2-PEG-RGD同時具有動物體外磁共振成像，抗腫瘤配合物的輸送以及腫瘤靶向性的特征，能特定地殺死HeLa細胞，30 y g/ml能夠引起細胞顯著死亡。
實施例2:將粒徑20 nm磁性納米Fe3O4 (40 mg)和TEOS (40mg)以質量I :1混合并超聲分散于40 mg三氯甲烷(Fe3O4與三氯甲烷質量比I :1)，再加入0. 5M十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)水溶液0. 12ml，接著加入水0.3 ml和2 M的NaOH溶液0. I g (其中NaOH與TEOS的質量比例I : I )，溫度控制在最佳70 ° C制得溶液A ;將另ー份TEOS (20mg)和RBITC(20mg)以質量比I :1混合后制成溶液B ;將溶液B加入溶液A中，再加入反應液體積的5%こ酸こ酷，反應10 min后加入APS (400mg) (APS :Fe304質量比10 :1 )，攪拌反應3 h，磁性分離，固體用こ醇和水各洗2次得包裹熒光染料異硫氰酸羅丹明B(RBITC)和多孔磁性納米四氧化三鐵為核、ニ氧化硅為殼的納米顆粒(RBITC-Fe3O4IgSiO2，其中@表示核殼結構)。將15 mg RGD、(15 mg) 1，3_ ニ環己基碳ニ亞胺(DCC)和(60 mg) N-輕基丁ニ酰亞胺(NHS)的N，N-ニ甲基甲酰胺混合(其中RGD DCC :NHS質量比為I :1 :4)，加入10 mlDMF至固體剛好溶解，溶液在常溫下攪拌反應10 h。再加入上述干燥后的固體RBITC-Fe3O4OSiO2,繼續攪拌反應10 h。結束反應，磁性分離得表面修飾RGD的熒光染料異硫氰酸羅丹明B(RBITC)和多孔磁性納米四氧化三鐵為核、ニ氧化硅為殼的納米顆粒RBITC-Fe3O4IgSiO2-RGD(27. 6 mg)稱取甲氧基聚こニ醇酸(分子量2000) (70. 6 mg)溶于DMF制成飽和溶液中(其中甲氧基聚こニ醇酸=RBITC-Fe3O4OSiO2-RGD質量比4 1中，再依次加入211. 8 mg的DCC和NHS (質量比DCC:NHS:甲氧基聚こニ醇酸為3:3:1 )，讓其在常溫下攪拌反應10 h。再將RBITC-Fe3O4OSiO2-RGD (27.6 mg)加入其中，常溫攪拌反應10 h后加入9. 5 mlこ醇超聲分散；然后加入13. 8 mg順磁性抗腫瘤配合物ニ氯N- (2-丙酸こ酯基)-N, N- ニ(2-吡啶甲基)胺合錳(簡寫為LMnCl)(質量比LMnCl: RBITC-Fe3O^SiO2 -RGD約為1:2)，混和溶液在80 °C下攪拌反應I h。磁性分離，真空干燥得產物LMnCl-RBITC-Fe304@Si02-PEG-RGD(49 mg)。實施例3 :將粒徑20 nm磁性納米Fe3O4 (60 mg)和TEOS (240mg)以質量比I :6混合并超聲分散于600 mg三氯甲烷(Fe3O4與三氯甲烷質量比I :10)中，再加入0. 5M十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)水溶液1.2 ml，接著加入水240 ml和2 M的NaOH溶液2. 4 g (其中NaOH與TEOS的質量比例I : 10)，溫度控制在最佳30 °C制得溶液A ;將另ー份TEOS (120mg)和RBITC (120 mg)以質量比I :1混合后制成溶液B ;將溶液B加入溶液A中，再加入反應液體積的40%こ酸こ酷，反應30 min后加入APS (60mg) (APS =Fe3O4質量比I :1)，攪拌反應3 h，磁性分離，固體用こ醇和水各洗2次得包裹熒光染料異硫氰酸羅丹明B (RBITC)和多孔磁性納米四氧化三鐵為核、ニ氧化硅為殼的納米顆粒(RBITC-Fe3O4IgSiO2，其中@表示核殼結構)。將15 mg RGD、15 mg 1，3_ ニ環己基碳ニ亞胺(DCC)和15 mgN-輕基丁ニ酰亞胺(NHS)的N，N-ニ甲基甲酰胺混合(其中RGD :DCC :NHS質量比為I :1 :1)，加入36 ml DMF至固體剛好溶解，溶液在常溫下攪拌反應10 h。再加入上述干燥后的固體RBITC-Fe3O4OSiO2，繼續攪拌反應36 h。結束反應，磁性分離得表面修飾RGD的熒光染料異硫氰酸羅丹明B (RBITC)和多孔磁性納米四氧化三鐵為核、ニ氧化硅為殼的納米顆粒RBITC-Fe3O4OSiO2-RGD (46. 8 mg)。稱取甲氧基聚こニ醇酸(分子量2000)(23. 4 mg)溶于DMF制成飽和溶液中(其中甲氧基聚こニ醇酸=RBITC-Fe3O4OSiO2-RGD質量比I :2中，再依次分別加入34. 2 mg的DCC和22.8 mg的NHS (質量比DCC:NHS:甲氧基聚こニ醇酸為3:2:4)，讓其在常溫下攪拌反應36 h。再將RBITC-Fe3O4OSiO2-RGD (46.8 mg)加入其中，常溫攪拌反應36 h后加入30 mlこ醇超聲分散5分鐘；然后加入107. 2 mg順磁性抗腫瘤配合物ニ氯N-(2-丙酸こ酯基)-N，N-ニ(2-吡啶甲基)胺合錳(簡寫為LMnCl)(質量比LMnCl: RBITC-Fe3O4OSiO2-RGD約為4 :1)，混和溶液在80 °C下攪拌反應I h。磁性分離，真空干燥得產物LMnCl-RBITC-Fe3O4IgSiO2-PEG-RGD (68 mg)。
實施例4 :將粒徑20 nm磁性納米Fe3O4 (60 mg)和TEOS (60 mg)以質量比I :1混合并超聲分散于240 mg三氯甲烷(Fe3O4與三氯甲烷質量比I :4)中，再加入0.5M十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)水溶液I. 4 ml，接著加入水240 ml和2 M的NaOH溶液6 mg (其中NaOH與TEOS的質量比例I : 10)，溫度控制在最佳30 °C制的溶液A ;將另ー份TEOS (120 mg)和RBITC (120 mg)以質量比I :I混合后制成溶液B ;將溶液B加入溶液A中，再加入反應液體積的30%こ酸こ酷，反應30 min后加入APS (90mg) (APS :Fe304質量比I. 5 :1)，攪拌反應
3h，磁性分離，固體用こ醇和水各洗2次得包裹熒光染料異硫氰酸羅丹明B (RBITC)和多孔磁性納米四氧化三鐵為核、ニ氧化硅為殼的納米顆粒(RBITC-Fe3O4IgSiO2，其中@表示核殼結構)。將44 mg RGD、(44 mg) 1，3_ ニ環己基碳ニ亞胺(DCC)和(44 mg) N-輕基丁ニ酰亞胺(NHS)的N，N-ニ甲基甲酰胺混合(其中RGD DCC :NHS質量比為I :1 :1)，加入42 mlDMF至固體剛好溶解，溶液在常溫下攪拌反應20 h。再加入上述干燥后的固體RBITC-Fe3O4OSiO2,繼續攪拌反應20 h。結束反應，磁性分離得表面修飾RGD的熒光染料異硫氰酸羅丹明B(RBITC)和多孔磁性納米四氧化三鐵為核、ニ氧化硅為殼的納米顆粒RBITC-Fe3O4IgSiO2-RGD(56. 8 mg)。稱取甲氧基聚こニ醇酸(分子量2000) (113.6 mg)溶于DMF制成飽和溶液中(其中甲氧基聚こニ醇酸RBITC-Fe304@Si02-RGD質量比I :2中，再依次分別加入169. 8 mg的DCC和169.8 mg的NHS (質量比DCC:NHS:甲氧基聚こニ醇酸為3:3:2)，讓其在常溫下攪拌反應20 h。再將RBITC-Fe3O4IgSiO2-RGD (56.8 mg)加入其中，常溫攪拌反應20 h后加入38mlこ醇超聲分散5分鐘；然后加入85. 2 mg順磁性抗腫瘤配合物ニ氯N- (2-丙酸こ酯基)-N，N- ニ(2-吡啶甲基)胺合錳(簡寫為LMnCl)(質量比LMnCl: RBITC-Fe3O4OSiO2 -RGD約為I. 5 :1)，混和溶液在80 °C下攪拌反應I. 5 h。磁性分離，真空干燥得產物LMnC I -RB I TC-Fe304iS i O2-PEG-RGD (86 mg)。實驗I :抗腫瘤活性測定及細胞増殖形態學觀察 以實施例I得到的配合物為受試化合物
將HeLa細胞在含10%熱滅活的胎牛血清(FCS)的RPMI1640培養液中，于CO2培養箱(37 °C，5%C02、飽和濕度)內連續培養。取對數生長期細胞，消化、計數，以2X104/ml的密度接種于96孔培養板中，每孔100 u I。培養24 h后,分別用濃度為I U g/ml, 10 u g/ml 和 3O u g/ml 的 LMnCl-RBITC-Fe304@Si02-PEG-RGD 作用 HeLa 細胞。用 TS100 Nikon 倒置相差顯微鏡觀察細胞的生長情況。從附圖I的細胞形態學觀察，可以看出30 u g/mlLMnC I -RB I TC-Fe304iS i O2- PEG-RGD的能顯著誘導腫瘤細胞的凋亡。分別用濃度為I y g/ml，10 u g/ml 和 30 u g/ml 的 LMnCl-RBITC-Fe3O4OSiO2-PEG-RGD 作用 HeLa 細胞(見圖 I)。實驗結果顯示 LMnCl-RBITC_Fe304@Si02-PEG-RGD都能引起細胞的皺縮和誘導細胞不同程度的分裂。用30 ii g/ml的LMnCl-RBITC-Fe3O4IgSiO2-PEG-RGD處理HeLa細胞時，幾乎所有細胞全部皺縮、變圓，即所有細胞全部死亡，說明其對腫瘤細胞的抑制活性較好。.實驗2 :細胞磁共振成像
將WRL-68細胞和IfepG2細胞在含10%熱滅活的胎牛血清(FCS)的RPMI1640培養液中，于CO2培養箱(37 °C, 5%C02、飽和濕度)內連續培養。取對數生長期的WRL-68細胞和H印G2細胞，消化、計數，以2X104/ml的密度接種到96孔培養板中，每孔100 yl。培養24 h后，分別用不同濃度的LMnCl-RBITC-Fe304@Si02-PEG-RGD的溶液處理腫瘤細胞，連續培養4 h后，于室溫在匪120磁共振成像儀(0.53 T )上進行Tl加權成像測試，見圖2和圖3。設置參數為重復采樣次數(NS)為8，反轉恢復序列循環采樣次數(TlIRCount)為300，每次增加的步長(AddDl)為2000，90。脈寬び90)為4.5，180。脈寬(P180)為9。測得納米顆粒的h遲豫時間分別為83. 410 ms。
權利要求
1.一種多功能腫瘤成像劑，其結構式為LMnCl-RBITC-Fe304@Si02-PEG-RGD，其中LMnCl為ニ氯N- (2-丙酸こ酯基)-N，N-ニ(2-吡啶甲基)胺合錳，RBITC為異硫氰酸羅丹明B，RGD為精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸三肽，PEG為甲氧基聚こニ醇，其中@表示核殼結構。
2.權利要求I所述的ー種多功能腫瘤成像劑的制備方法，其特征在于按照下述步驟進行 (1)將Fe3O4和四甲氧基硅烷(TEOS)以質量比I:1 I :6，混合并超聲分散于三氯甲烷，其中Fe3O4與三氯甲烷質量比I :1 I :10，再加入Fe3O4的量0. I I. 0倍的十六烷基三 甲氧基溴化銨(CTAB)水溶液，接著加入水和I 5 M的NaOH溶液；，其中水與TEOS的質量比例I :1 I : 10，其中NaOH與TEOS的質量比例I :2 I : 10，溫度控制在30 70 0C制 成溶液A ;將TEOS和異硫氰酸羅丹明B(RBITC)按照質量比4 :1 I :1，混合后制成溶液B ;將溶液B加入溶液A中，再加入こ酸こ酷，其中こ酸こ酯用量為反應液體積的5% 40%，，反應I 30 min，后加入氨丙基三こ氧基硅烷(APS)，其中APS =Fe3O4質量比為10 :1 I :1，攪拌反應I 5 h，磁性分離，固體用こ醇和水各洗2次得RBITC-Fe3O4IgSiO2 ； (2)將精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸三肽((RGD)、1，3-ニ環己基碳ニ亞胺(DCC)和N-羥基丁ニ酰亞胺(NHS)混合，其中RGD DCC :NHS質量比為I :5 :2 I :1 :4，加入一定量的DMF至固體剛好溶解，其中質量比DMF =NHS為2 :1 8 :1，溶液在常溫下攪拌反應10 36 h ；再加入上述干燥后的固體RBITC-Fe3O4IgSiO2，繼續攪拌反應10 36 h ;結束反應，磁性分離得固體 RBITC-Fe3O4OSiO2-RGD ； (3)稱取甲氧基聚こニ醇酸溶于DMF制成飽和溶液中，其中甲氧基聚こニ醇酸RBITC-Fe3O4OSiO2-RGD的質量比為4:1 1: 2，再依次加入DCC和NHS，其中質量比DCC:NHS:甲氧基聚こニ醇酸為3:3:1 3:2: 4，讓其在常溫下攪拌反應10 36 h ;再將RBITC-Fe3O4OSiO2-RGD加入其中，常溫攪拌反應10 36 h后加入一定量的こ醇超聲分散5分鐘，其中與RBITC-Fe3O4IgSiO2-R⑶的質量比為I :1 6 :1 ;然后加入順磁性抗腫瘤配合物ニ氯N_( 2-丙酸こ酯基)-N，N-ニ(2-吡啶甲基)胺合錳，其中質量比LMnCl: RBITC-Fe3O4IgSiO2-RGD為I:2 4 :1，混和溶液在40 80 °C下攪拌反應I 6 h ;磁性分離，真空干燥得產物ー種腫瘤靶向性多功能的納米復合成像劑。
3.根據權利要求2所述的ー種多功能腫瘤成像劑的制備方法，其特征在于其中步驟(1)Fe3O4為粒徑20nm磁性納米Fe3O4，磁性納米Fe3O4和TEOS質量比為I :2 ;Fe304與三氯甲烷質量比為I :2 ;再加入Fe3O4的量0.5倍的CTAB水溶液，水與TEOS的質量比例為I :4. 5 ;NaOH溶液為2 M，其中NaOH與TEOS的質量比例為I :5，溫度控制在70 °C ；TE0S和RBITC的質量比為2 1 ;其中こ酸こ酯用量為反應液體積的20%，反應10 min ;其中APS :Fe304質量比為5 :1,攪拌反應3 h。
4.根據權利要求2所述的ー種多功能腫瘤成像劑的制備方法，其特征在于其中步驟(2)中將RGD、1,3-ニ環己基碳ニ亞胺(DCC)和N-羥基丁ニ酰亞胺(NHS)以質量比I:1. 5 :I. 5混合，加入NHS質量4倍的DMF至固體剛好溶解，溶液在常溫下攪拌反應24 h后。
5.根據權利要求2所述的ー種多功能腫瘤成像劑的制備方法，其特征在于其中步驟(3)中甲氧基聚こニ醇酸的分子量2000;稱取RBITC-Fe3O4IgSiO2-RGD兩倍質量的甲氧基聚こニ醇酸溶于DMF制成飽和溶液，其中DCC:NHS:甲氧基聚こニ醇酸質量比為3:3:2 ;讓其在常溫下攪拌反應24 h ;再將RBITC-Fe3O4IgSiO2-RGD加入其中，繼續常溫攪拌反應24h后加入RBITC-Fe3O4IgSiO2-RGD質量3倍的こ醇超聲分散5分鐘；然后加入RBITC-Fe3O4OSiO2-RGD質量兩倍的順磁性抗腫瘤配合物ニ氯N- (2-丙酸こ酯基)-N，N- ニ(2-吡啶甲基)胺合錳，混和溶液在80°C下攪拌反應4 h。
6.權利要求I所述的ー種多功能腫瘤成像劑的應用，具有腫瘤靶向肽誘導的腫瘤細胞主動靶向性，可以用于腫瘤細胞與正常細胞的磁 共振成像鑒別劑。
全文摘要
本發明一種多功能腫瘤成像劑、制備方法及應用，屬于腫瘤成像劑領域。它具備腫瘤靶向性、磁共振成像和抗腫瘤的特性。以Fe3O4為核，通過微乳液方法制備了包裹熒光染料異硫氰酸羅丹明B和多孔磁性納米四氧化三鐵為核、二氧化硅為殼的納米顆粒。SiO2的表面修飾了腫瘤靶向肽RGD及甲氧基聚乙二醇，最終得到了一種腫瘤靶向性多功能的納米復合成像劑。具有腫瘤靶向肽誘導的腫瘤細胞主動靶向性，可以用于腫瘤細胞與正常細胞的磁共振成像鑒別劑，可運用于臨床磁共振成像監測治療用藥，實現腫瘤治療過程的時時監測，而目前臨床運用的抗腫瘤藥物僅具有腫瘤抑制性能，無法實現藥物治療過程的實時監測。
文檔編號A61K49/12GK102614532SQ20121009434
公開日2012年8月1日 申請日期2012年4月1日 優先權日2012年4月1日
發明者劉穎奇, 陳秋云, 陶艮平 申請人:江蘇大學