專(zhuān)利名稱(chēng)：SCF-Fc融合蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種融合蛋白，具體地說(shuō)，涉及一種SCF-Fc融合蛋白，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
自1990年美國(guó)3個(gè)研究組幾乎同時(shí)報(bào)道干細(xì)胞因子(SCF)以來(lái)，世界各地進(jìn)行了廣泛深入的研究。干細(xì)胞因子又稱(chēng)肥大細(xì)胞生長(zhǎng)因子(MGF)，c-Kit配體(c-Kit-L)及Steel因子(SLF)。它是由骨髓微環(huán)境中的基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的一種酸性糖蛋白。其糖基連在肽鍵的N和O基團(tuán)上，由非共價(jià)結(jié)合的兩個(gè)相同亞基組成。SCF和其他細(xì)胞因子一起誘導(dǎo)干和祖細(xì)胞增生、延長(zhǎng)其存活期及引起干和祖細(xì)胞 動(dòng)員。雖然SCF的受體在祖細(xì)胞無(wú)顯著不同，但SCF誘導(dǎo)紅系祖細(xì)胞增生比粒-單祖細(xì)胞強(qiáng)，可能是其他特異性因素影響祖細(xì)胞對(duì)SCF的反應(yīng)性。給小鼠應(yīng)用SCF和粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)，外周血干細(xì)胞和祖細(xì)胞第I天即達(dá)高峰，6周后正常。骨髓中干和祖細(xì)胞第I天下降，第14天升高達(dá)10倍，6周后正常。表明最初外周血干和祖細(xì)胞升高是由骨髓中動(dòng)員到外周血。Mauch等報(bào)道SCF和IL-Il合用增加長(zhǎng)期骨髓增殖細(xì)胞(LTMRC)從骨髓動(dòng)員到未切脾鼠的脾和切脾鼠的血液。Yonemura等認(rèn)為SCF單獨(dú)在體外不能維持干細(xì)胞量，體內(nèi)作用是SCF和其他細(xì)胞因子相互作用的結(jié)果。在體外SCF和IL-7協(xié)同促進(jìn)體B細(xì)胞增生。Takeda等認(rèn)為體內(nèi)B細(xì)胞發(fā)育不是受體c_kit和SCF相互作用，而另一受體型酪氨酸激酶(FLK2)對(duì)B細(xì)胞發(fā)育比c-kit更重要。SCF在肥大細(xì)胞發(fā)育和存活中起關(guān)鍵作用。小鼠SCF的基因缺失導(dǎo)致結(jié)締組織和粘膜表面肥大細(xì)胞缺乏。由于SCF引起肥大細(xì)胞脫粒，應(yīng)用時(shí)一般以減少劑量為代價(jià)。Nocka等發(fā)現(xiàn)與二硫化物相聯(lián)系的二聚體SCF比普通SCF刺激細(xì)胞增生強(qiáng)10 20倍，但對(duì)肥大細(xì)胞脫粒并不比普通SCF強(qiáng)。SCF既有化學(xué)激動(dòng)性，也有化學(xué)趨化性。膜結(jié)合型SCF促進(jìn)造血祖細(xì)胞回到骨髓。靜脈輸注c-kit+造血祖細(xì)胞后其沿著SCF的梯度移動(dòng)到骨髓，是由ckit粘附到骨髓基質(zhì)細(xì)胞表面的SCF引起的。Kim等認(rèn)為基質(zhì)細(xì)胞源因子-I (SDF-I)只有化學(xué)趨化性，它作為生理抗移動(dòng)因子抑制造血祖細(xì)胞移出骨髓。應(yīng)用SCF、促血小板生長(zhǎng)因子(TPO)、IL-12、IL-3處理冷凍骨髓細(xì)胞移植給鼠，其恢復(fù)血小板和中性粒細(xì)胞比用未處理的骨髓移植早3 6 d。在鼠模型中，受者在應(yīng)用5-FU前和后給予SCF注射，可以使干細(xì)胞從靜止期進(jìn)入細(xì)胞周期。這樣干細(xì)胞對(duì)5-FU敏感，易于殺死，為供者骨髓移入受者提供了穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境，有利于骨髓移植的成功。綜上所述，SCF有著廣泛的應(yīng)用前景，然而SCF應(yīng)用于臨床至今并沒(méi)有取得實(shí)質(zhì)性的、突破性的進(jìn)展，而且很多體外實(shí)驗(yàn)的明顯結(jié)果往往在體內(nèi)難以得到重復(fù)與驗(yàn)證。究其原因，天然或重組SCF自身短暫的血漿循環(huán)半衰期是關(guān)鍵性障礙。大多數(shù)細(xì)胞因子因免疫刺激而分泌并發(fā)揮其調(diào)節(jié)作用。但它們的血漿半衰期都很短暫，從生理角度這是一種機(jī)體避免過(guò)度的免疫反應(yīng)的保護(hù)機(jī)制。其中以SCF為例,其體內(nèi)循環(huán)半衰期僅僅為數(shù)分鐘。因而使用天然或重組SCF于體內(nèi)，難以達(dá)到穩(wěn)定的有效的血漿濃度。本發(fā)明的干細(xì)胞生長(zhǎng)因子與Fe融合蛋白(SCF-Fc )，不僅具有重組SCF的全部生物學(xué)活性，而且明顯延長(zhǎng)了半衰期。特別，在器官移植方面，目前異體器官移植已成為挽救晚期器官衰竭患者生命的有效臨床手段，然而如何解決居高不下的中長(zhǎng)期慢性移植器官排斥發(fā)生率，以及大劑量長(zhǎng)期非特異免疫抑制藥物引發(fā)的嚴(yán)重合并癥，最終誘導(dǎo)受體對(duì)異體移植器官的免疫耐受，仍然是世界范圍異體器官移植界所面臨的嚴(yán)重挑戰(zhàn)。雖然近三十年來(lái)對(duì)異體移植免疫耐受的機(jī)理和實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)方案的研究取的了很大進(jìn)展，然而目前被證實(shí)的，能夠在多種不同種系動(dòng)物模型，特別是在人的臨床腎移植的受體中，達(dá)到免疫耐受的僅有方法，是應(yīng)用供體骨髓細(xì)胞移植，誘導(dǎo)和維持長(zhǎng)期的穩(wěn)定的嵌合體(MC)。
現(xiàn)行的成功的治療方案需要在移植前對(duì)受體使用大劑量放射治療合并多種細(xì)胞毒性藥物和免疫抑制藥物的誘導(dǎo)，達(dá)到對(duì)受體進(jìn)行骨髓肅清(myeloablation)的效果。但是對(duì)大劑量放療和細(xì)胞毒性免疫抑制藥物安全性的顧慮，嚴(yán)重阻礙了這一方案在器官移植的臨床應(yīng)用。如何深入探索和掌握嵌合體介導(dǎo)的移植免疫耐受的機(jī)理，發(fā)展一種能夠在不對(duì)受體進(jìn)行骨髓肅清(myeloablation)的條件下，成功誘導(dǎo)穩(wěn)定嵌合體狀態(tài)，以達(dá)到異體移植免疫耐受的目的，將是具有重大科學(xué)研究和臨床應(yīng)用意義的重要課題。近期對(duì)干細(xì)胞的研究提供顯著證據(jù)表明，骨髓造血干細(xì)胞(HSC)的維持和自身更新取決于其存在的微環(huán)境，稱(chēng)之為誘導(dǎo)造血微環(huán)境或干細(xì)胞涅池(niche)。至今，大多數(shù)的研究最關(guān)注的是骨髓干細(xì)胞niche。這種特殊的在骨髓內(nèi)的niche,代表了一種和諧的微環(huán)境，在這個(gè)生理的微環(huán)境內(nèi)HSC和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相互依存，共同維持這種平衡。骨髓HSC微環(huán)境對(duì)HSC功能的關(guān)鍵作用已得到充分的認(rèn)識(shí)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種SCF-Fc融合蛋白。本發(fā)明的SCF-Fc融合蛋白，所說(shuō)的SCF包括胞外區(qū)全部序列，所說(shuō)的Fe片段包括鉸鏈區(qū)、CH2區(qū)和CH3區(qū)，所說(shuō)的SCF與Fe序列之間為直接融合或通過(guò)連接序列融合，所說(shuō)的SCF選自人、小鼠、大鼠或其他動(dòng)物的SCF，所說(shuō)的Fe片段選自人或動(dòng)物的IgG、IgM、IgD、IgA或者它們的亞型，所說(shuō)Fe片段選自天然型Fe或與受體和/或補(bǔ)體結(jié)合相關(guān)的氨基酸改變的突變型Fe。所說(shuō)的SCF選自人、小鼠或大鼠SCF，其中人SCF具有如SEQ ID. I所示的氨基酸序列和如SEQ ID. 2所示的核苷酸序列，小鼠SCF具有如SEQ ID. 3所示的氨基酸序列和如SEQ ID. 4所示的核苷酸序列，大鼠SCF具有如SEQ ID. 5所示的氨基酸序列和如SEQ ID. 6所示的核苷酸序列。所說(shuō)的Fe片段選自人或動(dòng)物的IgG、IgM、IgD、IgA或者它們的亞型。所說(shuō)的Fe片段選自人IgGl、小鼠IgG2a或大鼠IgG2a，其中人IgGl的氨基酸序列如SEQ ID. 7所示，小鼠IgG2a的氨基酸序列如SEQ ID. 8所示、大鼠IgG2a的氨基酸序列如SEQ ID. 9所示。所說(shuō)的突變型Fe片段選自突變型人IgGl或小鼠IgG2a，其中突變型人IgGl的氨基酸序列如SEQ ID. 10所示，突變型小鼠IgG2a的氨基酸序列如SEQ ID. 11所示。本發(fā)明還包括一種SCF-Fc融合蛋白編碼DNA序列的載體，所說(shuō)的載體為真核載、體。所說(shuō)的真核載體為哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體。由于原核表達(dá)體系所表達(dá)的產(chǎn)物,缺乏糖基化修飾功能，蛋白功能不能保證，因此在此發(fā)明中，優(yōu)選哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體，如P Re-CMV ( Invitrogen 公司)。本發(fā)明還包括一種SCF-Fc融合蛋白編碼DNA序列的載體的宿主細(xì)胞，所說(shuō)的宿主細(xì)胞選自真核細(xì)胞或原核細(xì)胞。所說(shuō)的宿主細(xì)胞選自CHO細(xì)胞。本發(fā)明的SCF-Fc融合蛋白的用途，包括用于建立溶細(xì)胞性SCF-Fc融合蛋白，一過(guò)性的清除cKit表面受體陽(yáng)性的造血干細(xì)胞，激活骨髓造血干細(xì)胞微環(huán)境一 Niche，促進(jìn)造血干細(xì)胞歸宿至干細(xì)胞微環(huán)境，誘導(dǎo)和增強(qiáng)混合嵌合體的形成，以誘導(dǎo)移植免疫耐受，還可以應(yīng)用于對(duì)血液系統(tǒng)遺傳性細(xì)胞異常疾病的干細(xì)胞治療；用于建立非溶性的SCF-Fc融合 蛋白可以應(yīng)用于SCF的替代療法，以及用于標(biāo)記和分離骨髓造血干細(xì)胞。本發(fā)明的所用術(shù)語(yǔ)“Fe”指免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)的羧基端或其中的一部分，例如免疫球蛋白Fe片段可包括重鏈CH1、CH2、CH3、CH4的兩個(gè)或更多結(jié)構(gòu)域與免疫球蛋白鉸鏈區(qū)的組合。已知免疫球蛋白有很多類(lèi)別，如IgA、IgD、IgE、IgM及IgG(包括IgGl、IgG2、IgG3、IgG4)，從特定免疫球蛋白類(lèi)別和亞類(lèi)中選擇特定的免疫球蛋白Fe區(qū)，是在本領(lǐng)域技術(shù)人員所掌握的范圍之內(nèi)。免疫球蛋白是人類(lèi)血液中最豐富的蛋白質(zhì)，它們的半衰期可高達(dá)21天。已經(jīng)報(bào)道和公布的專(zhuān)利將免疫球蛋白的Fe區(qū)域與其他蛋白質(zhì)(如各種細(xì)胞因子和可溶性受體)的區(qū)域融合，創(chuàng)制出融合蛋白。這類(lèi)融合蛋白是通過(guò)IgG Fe鉸鏈區(qū)中的Cys殘基連接的同源二聚體蛋白，結(jié)構(gòu)類(lèi)似于IgG分子但無(wú)CHl區(qū)域和輕鏈。這類(lèi)融合蛋白維持有原功能蛋白質(zhì)的生物活性，同時(shí)大大延長(zhǎng)了體內(nèi)半衰期(參見(jiàn)，如Nature，337:525-531. 1989;如 Trends Biotechnol.，14:52-60，1996;如美國(guó)專(zhuān)利 No. 5349053 與 6224867 及中國(guó)專(zhuān)利200510084233. 5)。在該方面幾個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，免疫球蛋白Fe片段分別選自人IgGl，小鼠IgG2a，大鼠IgG2a，包括其鉸鏈區(qū)、CH2、CH3區(qū)。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的SCF-Fc融合蛋白具有與重組SCF相比，半衰期明顯延長(zhǎng)。SCF與免疫球蛋白Fe融合，可選擇多種連接序列，例如可以選擇一系列的甘氨酸和絲氨酸的組合，長(zhǎng)度約為20個(gè)氨基酸殘基(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利NO 00/13827)，也可選擇SCF與免疫球蛋白Fe的鉸鏈區(qū)直接融合。在該方面的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，SCF與Fe鉸鏈區(qū)通過(guò)Gly-Asp連接序列融合。免疫球蛋白的Fe區(qū)域中消滅病原體的免疫防御中起重要作用。IgG的效應(yīng)功能由Fe介導(dǎo)通過(guò)兩種主要機(jī)制，即(I)與細(xì)胞表面Fe受體的結(jié)合，吞噬作用或殺傷細(xì)胞通過(guò)抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒性途徑(ADCC)消化病原體；(2)與第一補(bǔ)體成分Cl的Clq部分結(jié)果，弓丨發(fā)依賴(lài)于補(bǔ)體的細(xì)胞毒性途徑(CDC)，從而裂解病原體。由于溶細(xì)胞性SCF-Fc融合蛋白，SPSCF與天然型免疫球蛋白Fe融合蛋白，由于其天然型Fe功能區(qū)的存在，所以其具有ADCC和⑶C效應(yīng)。在某些應(yīng)用方面，這兩種效應(yīng)是正向的，但在另一些應(yīng)用領(lǐng)域，這兩種效應(yīng)可能是反向的。因此，本發(fā)明還通過(guò)對(duì)Fe中與受體和(或)補(bǔ)體結(jié)合相關(guān)的氨基酸改變，提供了SCF-Fc融合蛋白的另一種形式，非溶細(xì)胞性SCF-Fc融合蛋白，即SCF與突變型免疫球蛋白Fe融合蛋白。


圖I為干細(xì)胞生長(zhǎng)因子擴(kuò)增電泳圖，其中，I :人干細(xì)胞生長(zhǎng)因子PCR產(chǎn)物；2 :小鼠干細(xì)胞生長(zhǎng)因子PCR產(chǎn)物；3 :大鼠干細(xì)胞生長(zhǎng)因子PCR產(chǎn)物；M :DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(Marker);
圖2-1為表達(dá)純化的干細(xì)胞生長(zhǎng)因子與Fe融合蛋白(SDS-PAGE)還原前電泳圖，其中，I :人干細(xì)胞生長(zhǎng)因子與Fe融合蛋白(還原前)(Human SCF/Human IgGl-Fc++) ；2 :人干細(xì)胞生長(zhǎng)因子與Fe變體融合蛋白(還原前)(Human SCF/Human IgGl-Fc—);3 :小鼠干細(xì)胞生長(zhǎng)因子與Fe融合蛋白(還原前)(Mouse SCF/Mouse IgG2a_Fc++) ;4 :大鼠干細(xì)胞生長(zhǎng)因子與Fe融合蛋白(還原前)(Rat SCF/Rat IgG2a_Fc++) ；5 :大鼠干細(xì)胞生長(zhǎng)因子與小鼠Fe融合蛋白(還原前)(Rat SCF/Mouse IgG2a_Fc) M :蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(Marker);
圖2-2為表達(dá)純化的干細(xì)胞生長(zhǎng)因子與Fe融合蛋白(SDS-PAGE)還原后電泳圖，其中，
I:人干細(xì)胞生長(zhǎng)因子與Fe融合蛋白(還原后)(Human SCF/Human IgGl-Fc++) ；2 :人干細(xì)胞生長(zhǎng)因子與Fe變體融合蛋白(還原后)(Human SCF/Human IgGl-Fc—);3 :小鼠干細(xì)胞生長(zhǎng)因子與Fe融合蛋白(還原后)(Mouse SCF/Mouse IgG2a_Fc++) ;4 :大鼠干細(xì)胞生長(zhǎng)因子與Fe融合蛋白(還原后)(Rat SCF/Rat IgG2a_Fc++) ；5 :大鼠干細(xì)胞生長(zhǎng)因子與小鼠Fe融合蛋白(還原后)(Rat SCF/Mouse IgG2a_Fc) M :蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(Marker);
圖3為重組干細(xì)胞生長(zhǎng)因子半衰期的測(cè)定曲線；
圖4-1為應(yīng)用SCF/Fc紅色熒光標(biāo)記的骨髓造血干細(xì)胞；
圖4-2為應(yīng)用SCF/Fc (紅色)與抗ckit (白灰色)雙熒光標(biāo)記的骨髓造血干細(xì)胞；
圖5為SCF-Fc熒光標(biāo)記骨髓造血干細(xì)胞效果的流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果；
圖6為應(yīng)用SCF/Fc分離骨髓造血干細(xì)胞的結(jié)果 圖7為應(yīng)用溶細(xì)胞性SCF/Fc增強(qiáng)混合嵌合體的建立以誘導(dǎo)移植免疫耐受結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明，應(yīng)理解，引用實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例I干細(xì)胞生長(zhǎng)因子與Fe融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 以人-干細(xì)胞生長(zhǎng)因子與Fe融合蛋白的基因構(gòu)建為例
以購(gòu)自 Thermo (Open Biosystems)公司的 cDNA 克隆(貨號(hào)MHS4426_99239430)為模板，擴(kuò)增人SCF胞外區(qū)全序列(GenBank BC126166. 1)，上游引物引入NotI位點(diǎn)、Kozak序列
Pl: 5’ ATATGGCGGCCGCCGCCACCATGAAGAAGACACAAACTTG 3’ 下游引物引入 BamHI 位點(diǎn) P2: 5’ ctctgGGATCCCAGTGTAGGCTGGAGTC 3’
反應(yīng)體系為50ul，其中濃度為50pM/ul引物各加O. 5ul，濃度為2. 5mM Each的dNTP加
O.8ul，所用DNA聚合酶為江蘇省弗泰生物科技有限公司生產(chǎn)的pfu DNA polymerase, 2. 5U/ul,加 O. 8ulο反應(yīng)條件為94°C 30秒、54°C 30秒、72°C 45秒，25個(gè)循環(huán)后，產(chǎn)物經(jīng)I. 5%瓊脂糖凝膠電泳分析，產(chǎn)物大小與預(yù)期大小(591bp)—致(圖3)。將得到的基因產(chǎn)物用江蘇省弗泰生物科技有限公司生產(chǎn)的DNA凝膠回收試劑盒純化后，用NotI和BamHI (Fermentas公司)酶切、回收、連接克隆至實(shí)驗(yàn)室保存的pRc-CMV-Fc表達(dá)載體系統(tǒng)。
pRc-CMV-Fc表達(dá)載體系統(tǒng)是經(jīng)改造的帶有優(yōu)化的多克隆位點(diǎn)、信號(hào)肽序列、Fe片段系統(tǒng)(人、小鼠或大鼠天然型Fe，或相應(yīng)突變型Fe)。將Human SCF連接至pRc_CMV_ (Human IgGl-Fc)即得溶細(xì)胞性人SCF-Fc融合蛋白的表達(dá)構(gòu)建。同理，將Human SCF連接至pRc-CMV-(Mouse IgG2a_Fc)，即得溶細(xì)胞性人SCF-mFc融合蛋白的表達(dá)構(gòu)建；將Human SCF連接至pRc_CMV_(突變型Human IgGl-Fc),即得非溶細(xì)胞性Human SCF-Fc融合蛋白的表達(dá)構(gòu)建。將篩選、抽提得到的克隆質(zhì)粒測(cè)序(Genscript公司)，DNASTAR軟件比對(duì)，與預(yù)期序列完全一致，構(gòu)建即完成。同樣的方法，構(gòu)建小鼠-干細(xì)胞生長(zhǎng)因子與Fe融合蛋白，大鼠-干細(xì)胞生長(zhǎng)因子與Fe融合蛋白，所用模板及引物說(shuō)明如下
小鼠-干細(xì)胞生長(zhǎng)因子與Fe融合蛋白的基因構(gòu)建
模板購(gòu)自 Thermo (Open Biosystems)公司的 cDNA 克隆(貨號(hào)MMM1013_65096),引物Pl :5’ atatgGCGGCCGCTGGATCGCAGCGCTG 3’，
引物 P2:5’ CAGAGGGATCCTGTAGGCCCGAGTCTTCAG 3’
PCR產(chǎn)物大小為676bp (圖I)
大鼠-干細(xì)胞生長(zhǎng)因子與Fe融合蛋白的基因構(gòu)建
使用全基因合成的方法，方法參考文獻(xiàn)進(jìn)行A modified method for PCR-directedgene synthesis from large number of overlapping oligodeoxyribonucleotides.Cherry, J ；Nieuwenhuijsen, Bff ；Kaftan, EJ ；Kennedy, JD ；Chanda, PKJournal of Biochemical and Biophysical Methods. 200870(6)
PCR產(chǎn)物大小為654bp (圖I)
實(shí)施例2.干細(xì)胞生長(zhǎng)因子與Fe融合蛋白的生產(chǎn)
I、穩(wěn)定的高表達(dá)細(xì)胞株的篩選
用冷的I XPBS將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CHO細(xì)胞稀釋至8 XlOVml后，
取0. 4mI懸液,加入電擊杯,再加入15ug線性化表達(dá)質(zhì)粒,混合后冰上靜置10-15min。設(shè)定電穿孔儀電壓800V，電容25uF，點(diǎn)穿后電擊杯在冰上靜置lOmin，用移液管轉(zhuǎn)移細(xì)胞至含5%1X FBS培養(yǎng)液的IOcm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。兩天后待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)恢復(fù)，用400 ug/ml的G418對(duì)陰性細(xì)胞進(jìn)行篩選。觀察細(xì)胞狀態(tài)，每4天換液一次，培養(yǎng)兩周后，采用極限稀釋法，用96孔培養(yǎng)板進(jìn)行高表達(dá)細(xì)胞株篩選。最終通過(guò)ELISA檢測(cè)和比較篩選，得到穩(wěn)定的高表達(dá)細(xì)胞株。2、高表達(dá)細(xì)胞株的培養(yǎng)
根據(jù)需要，按每毫升培養(yǎng)液加5mg微載體計(jì)算，稱(chēng)取微載體，并在磷酸緩沖液(PBS)的液體模式下高壓滅菌。將滅菌好的微載體移入攪瓶，待微載體沉淀后，棄去PBS，加入培養(yǎng)液。取出細(xì)胞培養(yǎng)皿中的處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SCF-Fc高表達(dá)細(xì)胞，去上清液，加適量胰蛋白酶37°C消化2-3min(顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞漂浮并分散)后，加適量含血清的培養(yǎng)基終止消化并細(xì)胞計(jì)數(shù)。根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果和培養(yǎng)體積，將細(xì)胞和培養(yǎng)液混合并使細(xì)胞分散均勻，得到細(xì)胞懸液，懸液細(xì)胞密度為l-5xl05/ml。待攪瓶中的微載體沉淀，棄去培養(yǎng)液,并將細(xì)胞懸液加入攪瓶。將攪瓶放入二氧化碳培養(yǎng)箱(5% 二氧化碳、37 °C)，調(diào)整攪瓶轉(zhuǎn)速至50-70rpm，進(jìn)行連續(xù)懸浮培養(yǎng)。3、SCF-Fc融合蛋白的純化
發(fā)酵培養(yǎng)物經(jīng)高速冷凍離心后收集培養(yǎng)上清，培養(yǎng)上清經(jīng)離子截留分子量為IOKDPellicon (購(gòu)自Millipore公司)超濃縮15倍,然后用Protein A親合層析柱(購(gòu)自GE公司)分離提純，提純的蛋白經(jīng)IXPBS的透析最終得到SCF-FC融合蛋白。(圖2-1，圖2_2)實(shí)施例3.干細(xì)胞生長(zhǎng)因子與Fe融合蛋白半衰期的測(cè)定
檢測(cè)原理和方法為檢測(cè)融合蛋白的血清半衰期特殊設(shè)計(jì)了一種酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法(ELISA)，使用鼠抗人SCF單克隆抗體作為捕獲抗體，生物素標(biāo)記的鼠抗人IgGl單克隆抗體作為檢測(cè)抗體，這種ELISA是特異性的針對(duì)人SCF-Fc融合蛋白中的SCF和IgGl，不會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性反應(yīng)，可以對(duì)血清中的SCF-Fc濃度進(jìn)行定量的分析，從而測(cè)出SCF-Fc的循環(huán)半衰期。分別對(duì)4只10周大的C57BL/6小鼠靜脈注射O. Img人SCF-Fc融合蛋白，在注射后的5分鐘、I小時(shí)、5小時(shí)、8小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)分別進(jìn)行IOOml眼窩取血，并·進(jìn)行上述ELISA方法檢測(cè)。SCF-Fc融合蛋白血清半衰期達(dá)到32小時(shí)。(圖3)
實(shí)施例4.應(yīng)用SCF-Fc熒光標(biāo)記骨髓造血干細(xì)胞
先將Rat-SCF-mFc融合蛋白做生物素標(biāo)記。用無(wú)水DMSO配制10mg/ml生物素N-羥基丁二酰亞胺活化酯溶液(SIGMA Cat# B-2642，生物素終濃度22mM)。用磷酸鹽緩沖液(IXPBS)配制濃度為O. 5mg/ml的Rat-SCF-mFc融合蛋白溶液。取3ul生物素酯溶液加入300ul Rat-SCF-mFc融合蛋白溶液中，室溫放置Ih。加入3. 3ul O. 5M Tris(pH=8)，室溫放置Ih終止反應(yīng)。IX PBS過(guò)夜透析。應(yīng)用生物素標(biāo)記的Rat-SCF-mFc融合蛋白(Rat-SCFiFc-Biotin)進(jìn)行紅色熒光標(biāo)記骨髓造血干細(xì)胞。將LEW大鼠的骨髓細(xì)胞進(jìn)行紅細(xì)胞裂解液溶解(碧云天生物技術(shù)公司，貨號(hào)C3702)，將細(xì)胞涂片、1%福爾馬林固定，然后用Rat-SCF-mFc-Biotin進(jìn)行4度、30分鐘染色，再用Avidin-TRITC (購(gòu)自博士德生物公司，貨號(hào)BA1093)染色，應(yīng)用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，結(jié)果如圖4-1。應(yīng)用Rat-SCF-mFc-Biotin和抗cKit-FITC雙熒光標(biāo)記骨髓造血干細(xì)胞。將LEW大鼠的骨髓細(xì)胞進(jìn)行紅細(xì)胞裂解液溶解，將細(xì)胞涂片、1%福爾馬林固定，用Rat-SCF/mFc-Biotin進(jìn)行4度、30分鐘染色，再用Avidin-TRITC染色，然后再用抗cKit-FITC進(jìn)行染色，應(yīng)用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，結(jié)果如圖4-2。SCF-Fc熒光標(biāo)記骨髓造血干細(xì)胞效果的測(cè)定。將LEW大鼠的骨髓細(xì)胞進(jìn)行紅細(xì)胞裂解液溶解，用Rat-SCF-mFc-Biotin進(jìn)行4度、30分鐘染色。用Avidin-TRITC染色，然后再用抗cKit-FITC進(jìn)行4度、30分鐘染色。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，結(jié)果如圖5，93% SCF/Fc標(biāo)記陽(yáng)性骨髓細(xì)胞是cKit標(biāo)記陽(yáng)性。實(shí)施例5.應(yīng)用SCF-Fc分離骨髓造血干細(xì)胞
將LEW大鼠的骨髓細(xì)胞進(jìn)行紅細(xì)胞裂解液溶解，應(yīng)用Rat-SCF-mFc-Biotin與Avidin-磁珠混合，4度、30分鐘后，加入骨髓細(xì)胞4度、30分鐘處理。過(guò)磁珠后，洗脫磁珠上的細(xì)胞。洗脫的細(xì)胞加入抗cKit-FITC，4度30分鐘處理后，用流式細(xì)胞儀分析。結(jié)果如圖6，應(yīng)用SCF-Fc分離的骨髓造血細(xì)胞77. 4%為cKit陽(yáng)性的造血干細(xì)胞。實(shí)施例6.應(yīng)用SCF-Fc增強(qiáng)混合嵌合體的建立以誘導(dǎo)移植免疫耐受以BN大鼠為供體，進(jìn)行原肢異體移植，以LEW大鼠為受體接受環(huán)孢素(Cyclosporin)和雷帕霉素(Rapamycin)進(jìn)行ALS，21天治療，一組受體(n=2)接受了溶細(xì)胞性Rat-SCF-Fc融合蛋白(O. 3mg)腹腔注射，術(shù)后用抗BN大鼠MHC抗體檢測(cè)嵌合體的進(jìn)行，結(jié)果顯示經(jīng)SCF-Fc融合蛋白治療的大鼠嵌合體不斷升高。其中一只受體術(shù)后11周可達(dá)97. 5%。另一只可達(dá)22. 4%，而對(duì)照組只維持在2- 4%之間。(如圖7)
權(quán)利要求
1.SCF-Fc融合蛋白，其特征在于，所說(shuō)的SCF包括胞外區(qū)全部序列，所說(shuō)的Fe片段包括鉸鏈區(qū)、CH2區(qū)和CH3區(qū)，所說(shuō)的SCF與Fe序列之間為直接融合或通過(guò)連接序列融合，所說(shuō)的SCF選自人、小鼠、大鼠或其他動(dòng)物的SCF，所說(shuō)的Fe片段選自人或動(dòng)物的IgG、IgM、IgD、IgA或者它們的亞型，所說(shuō)Fe片段選自天然型Fe或與受體和/或補(bǔ)體結(jié)合相關(guān)的氨基酸改變的突變型Fe。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的SCF-Fc融合蛋白，其特征在于，所說(shuō)的SCF選自人、小鼠或大鼠SCF，其中人SCF具有如SEQ ID. I所示的氨基酸序列和如SEQ ID. 2所示的核苷酸序列，小鼠SCF具有如SEQ ID. 3所示的氨基酸序列和如SEQ ID. 4所示的核苷酸序列，大鼠SCF具有如SEQ ID. 5所示的氨基酸序列和如SEQ ID. 6所示的核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的SCF-Fc融合蛋白，其特征在于，所說(shuō)的Fe片段選自人或動(dòng)物的IgG、IgM、IgD、IgA或者它們的亞型。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的SCF-Fc融合蛋白，其特征在于，所說(shuō)的Fe片段選自人IgGl、小鼠IgG2a或大鼠IgG2a，其中人IgGl的氨基酸序列如SEQ ID. 7所示，小鼠IgG2a的氨基酸序列如SEQ ID. 8所示、大鼠IgG2a的氨基酸序列如SEQ ID. 9所示。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的SCF-Fc融合蛋白，其特征在于，所說(shuō)的突變型Fe片段選自突變型人IgGl或小鼠IgG2a，其中突變型人IgGl的氨基酸序列如SEQ ID. 10所示，突變型小鼠IgG2a的氨基酸序列如SEQ ID. 11所示。
6.—種包含權(quán)利要求1-5中任意一種SCF-Fc融合蛋白編碼DNA序列的載體,其特征在于，所說(shuō)的載體為真核載體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的載體，其特征在于，所說(shuō)的真核載體為哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體。
8.—種包含權(quán)利要求1-5中任意一種的SCF-Fc融合蛋白編碼DNA序列的載體的宿主細(xì)胞，其特征在于，所說(shuō)的宿主細(xì)胞選自真核細(xì)胞或原核細(xì)胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，所說(shuō)的細(xì)胞選自CHO細(xì)胞。
10.如權(quán)利要求1-5中任意一種所述的SCF-Fc融合蛋白的用途，包括用于建立溶細(xì)胞性SCF-Fc融合蛋白，一過(guò)性的清除cKit表面受體陽(yáng)性的造血干細(xì)胞，激活骨髓造血干細(xì)胞微環(huán)境一 Niche，促進(jìn)造血干細(xì)胞歸宿至干細(xì)胞微環(huán)境，誘導(dǎo)和增強(qiáng)混合嵌合體的形成，以誘導(dǎo)移植免疫耐受，還可以應(yīng)用于對(duì)血液系統(tǒng)遺傳性細(xì)胞異常疾病的干細(xì)胞治療；用于建立非溶性的SCF-Fc融合蛋白可以應(yīng)用于SCF的替代療法，以及用于標(biāo)記和分離骨髓造血干細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種SCF-Fc融合蛋白，其特征在于，所說(shuō)的SCF包括胞外區(qū)全部序列，所說(shuō)的Fc片段包括鉸鏈區(qū)、CH2區(qū)和CH3區(qū)，所說(shuō)的SCF與Fc序列之間為直接融合或通過(guò)連接序列融合。本發(fā)明的SCF-Fc融合蛋白可用于建立溶細(xì)胞性SCF-Fc融合蛋白，一過(guò)性的清除cKit表面受體陽(yáng)性的造血干細(xì)胞，激活骨髓造血干細(xì)胞微環(huán)境－Niche,促進(jìn)造血干細(xì)胞歸宿至干細(xì)胞微環(huán)境，誘導(dǎo)和增強(qiáng)混合嵌合體的形成，以誘導(dǎo)移植免疫耐受，還可以應(yīng)用于對(duì)血液系統(tǒng)遺傳性細(xì)胞異常疾病的干細(xì)胞治療；用于建立非溶性的SCF-Fc融合蛋白可以應(yīng)用于SCF的替代療法，以及用于標(biāo)記和分離骨髓造血干細(xì)胞。
文檔編號(hào)A61K38/18GK102675470SQ201210094390
公開(kāi)日2012年9月19日 申請(qǐng)日期2012年4月1日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月1日
發(fā)明者卞春東, 查長(zhǎng)春, 田燕, 鄭心校 申請(qǐng)人:江蘇省弗泰生物科技有限公司